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研究記事

ルスコゲニンはKDM1Aをダウンレギュレートすることでフェロトーシスとアポトーシスを共誘導し、上咽頭癌の進行を抑制する

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DOI:

10.3791/72523

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2026年9月3日

1School of Stomatology and Optometry, Hubei University of Science and Technology

この記事について

サマリー

本プロトコールは、上咽頭癌細胞におけるruscogeninの抗腫瘍効果を評価することを目的としています。本手法では、生存率、遊走能、アポトーシス、およびフェロトーシス解析を含む包括的な方法を用いて、この化合物がKDM1Aを標的としてダウンレギュレートし、いかにして二重の細胞死を誘導するかを体系的に解明します。

要約

上咽頭癌（NPC）は非常に侵襲性の高い悪性腫瘍です。天然化合物であるルスコゲニン（Rus）は抗がん活性を有することが示されています。本研究では、NPC細胞への影響およびその基礎となる分子経路を調査することにより、上咽頭癌（NPC）における具体的な作用機序を解明します。ヒト上咽頭癌（NPC）細胞株C666-1に様々な濃度のRusを投与しました。一連のin vitroアッセイを実施し、細胞生存率、増殖、遊走、浸潤、アポトーシス、およびフェロトーシスを評価しました。リシン特異的脱メチル化酵素1A（KDM1A）の役割をウェスタンブロットおよび分子ドッキングを用いて調査し、その媒介的な役割を過剰発現レスキュー実験によって検証しました。Ruscogeninは、C666-1細胞の増殖能、コロニー形成能、遊走能、および浸潤能を濃度依存的に低下させました。メカニズムとしては、Rus処理が、実行カスパーゼ-3の活性化およびBax/Bcl-2バランスを介したプロアポトーシスシグナルへの移行で示されるアポトーシスと、脂質過酸化および細胞内鉄の上昇によって特徴づけられるフェロトーシスの両方を誘導することが明らかになりました。これらの抗腫瘍効果は、KDM1Aのダウンレギュレーションと強く相関していました。極めて重要な点として、KDM1Aを強制的に過剰発現させると、Rusが誘導するアポトーシスとフェロトーシスが有意に減弱し、悪性表現型の抑制が逆転したことから、KDM1Aが重要な媒介的役割を担っていることが確認されました。RuscogeninはKDM1Aをダウンレギュレートし、それによってアポトーシスとフェロトーシスを促進することで、上咽頭癌の悪性進行を抑制します。これらの知見は、Rus-KDM1A軸がNPC治療のための有望な治療標的であることを示しています。

概要

上咽頭癌（NPC）は、遺伝的要因と環境的要因の相互作用によって引き起こされる癌の一種である1。放射線療法により治療法は著しく進歩したが、NPC患者の全生存率は依然として不十分である。これは、NPC細胞が急速に増殖し、局所リンパ節や遠隔臓器に転移しやすい性質を持つためと考えられる2。したがって、NPCの進行を促進する分子メカニズムを解明することが不可欠である。最近では、Fe2⁺と脂質ペルオキシドによって鉄依存的に調節される新しい細胞死の形態であるフェロトーシスが、NPCに深く関与していることが明らかになった3。現在の知見では、フェロトーシスがNPCにおいて重要な役割を果たしており、その誘導によって癌の放射線療法を強化できることが示されている4,5。

毒性が低く副作用も少ないため、漢方処方は数千年にわたり癌の治療に広く用いられてきました6,7。多成分、多標的、および相乗効果を持つ薬剤として、伝統的な中国医学（TCM）の処方は、NPCを含む癌の予防および治療における効果的な補完療法として用いられています8,9,10。多年草であるOphiopogon japonicusの根であるオフィオポゴン根（RO）は、補助療法としてNPCを効果的に軽減することが報告されています11,12。ROの主要成分であるルスコゲニン（Rus）は、強力な抗癌効果を持つことが報告されています13。大腸癌のマウスモデルにおいて、Rusはタイトジャンクションの損傷を改善し、腫瘍の転移を抑制することができます14。重要なことに、Rusはフェロトーシスを誘導することで膵癌細胞の生存率を低下させることも可能です。しかし、RusのNPCに対する効果はまだ明らかになっていません。

エピジェネティクスはがんの病因に関する主要な研究分野であり、多くの効果的な治療法を提供しています15。よく研究されているエピジェネティック修飾の一つであるヒストンメチル化は、がんの発症に関与しており、薬剤設計の重要な標的でもあります16。ヒストンメチル化のダイナミックな調節は、メチル転移酵素と脱メチル化酵素によって媒介されます17。KDM1Aはヒストンリシン脱メチル化酵素であり、エピジェネティック調節に関与しているため、発がんに決定的な役割を果たすことが明らかになっています18。さらに、KDM1Aは肺がんや膵臓がんなど、複数の癌で高発現するオンコプロテイン（癌タンパク質）であることが分かっています19。Guoらは、KDM1Aの上昇がホスファターゼおよびテンシン相同体（PTEN）の発現を抑制し、アポトーシスを阻害しながらNPC細胞の増殖と遊走を促進することを報告しました20。一方、KDM1Aのアップレギュレーションが肺がんにおけるフェロトーシスを抑制することも判明しています21。Super-PREDデータベースの解析により、KDM1AはRusの潜在的な標的であることが示されました。

他の癌におけるRusの抗腫瘍能は認識されていますが、上咽頭癌における具体的な役割および分子メカニズムは完全に未解明であり、重要な研究上の空白となっています。さらに、KDM1Aが腫瘍の増殖およびフェロトーシス耐性と関連していることは個別の報告で示されていますが、KDM1Aを標的とすることでNPCにおいて複数の細胞死経路を同時に誘発できるかを探究した研究はまだありません。したがって、本研究は、RusがKDM1Aを直接的にダウンレギュレートすることで、NPC細胞の悪性進行を抑制するという仮説を立てる強力な根拠となります。

本研究は、NPC細胞の増殖、遊走、および浸潤に対するRusの効果を体系的に評価することで、この知見の空白を埋めることを目的としました。本研究の主な新規性は、二重のメカニズム戦略を明らかにした点にあります。特に、Rusが古典的なアポトーシスと鉄依存性のフェロトーシスの両方を同時に誘導する能力に焦点を当てました。新規のRus-KDM1Aシグナリング軸を検証することで、単一の天然化合物が同時多経路遮断を通じて腫瘍の耐性を克服できることを証明し、標的NPC治療に向けた有望な前臨床的根拠を提示することで、現在の知見を大幅に進展させました。

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プロトコル

細胞培養、処理、およびトランスフェクション

ヒト鼻咽頭癌（NPC）細胞株C666-1（RRID: CVCL_M597）および非悪性ヒト鼻咽頭上皮細胞株NP69（RRID: CVCL_F755）を市販のサプライヤーから購入した。両細胞株はショートタンデムリピート（STR）解析によって認証され、使用前にマイコプラズマ汚染がないことが確認された。日常的な培養において、C666-1細胞は10%胎児ウシ血清（FBS）および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地で増殖させた。NP69細胞は、10% FBS、10 ng/mLリコンビナント上皮成長因子、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したケラチノサイト無血清培地で培養した。Ruscogenin（Rus; 純度 ≥ 98%）を市販のサプライヤーから購入した。両細胞株は、37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で維持した。処理のため、細胞をさまざまな濃度（10, 20, 50 µM）のRuscogenin（Rus）に24時間曝露させた22。トランスフェクションには、市販のサプライヤーから入手した、過剰発現用のリシン特異的脱メチル化酵素1Aをコードするプラスミド（oe-KDM1A）および対応するネガティブコントロールの空ベクトル（oe-NC）を用い、細胞密度が70–80%に達したときにC666-1細胞に導入した。具体的には、2.5 µgのプラスミドDNAと5 µLのリポフェクション試薬をそれぞれ150 µLの低血清培地で希釈し、穏やかに混合して室温で20分間インキュベートした後、製造者のプロトコルに従って6ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を37 °Cで48時間インキュベートし、その後トランスフェクション効率を確認した。

Cell counting kit-8 (CCK-8) アッセイ

Rus処理後の細胞生存率は、CCK-8アッセイを用いて定量化した。この手順では、まず細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。次に、10 µLのCCK-8溶液を添加してアッセイを開始し、2時間のインキュベーション後、プレートリーダーを用いて450 nmにおける吸光度（OD）として比色変化を測定した。

コロニー形成アッセイ

コロニー形成能による生存率を評価するため、C666-1細胞を6ウェルプレートに播種し、14日間培養した。培養期間後、得られたコロニーを100% methanolで10分間固定し、次いで0.5% crystal violetで30分間可視化した。その後、染色されたコロニー数を顕微鏡イメージングおよびカウントによって定量化した。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロット解析では、まずRIPAバッファーを用いて細胞から全タンパク質を抽出し、得られたライセートを遠心分離（12,000 × g）して上清を回収した。タンパク質量の定量にはBCAアッセイを用いた。等量の全タンパク質（1レーンあたり30 µg）を負荷し、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離した。分離後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜へ、氷上で100 Vの定電圧にて90分間転写した。その後、0.1% Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水（TBST）で調製した5%牛血清アルブミン（BSA）を用いて、室温で2時間ブロッキングを行った。続いて、ブロッキングバッファーで希釈した以下の一次抗体（すべて1:1000）を用いて、4°Cで一晩インキュベートした：Ki67, PCNA, MMP2, MMP9, Bcl-2, Bax, KDM1A, SLC7A11, GPX4, ACSL4, TFR1, および β-actin。最後に、HRP標識二次抗体で2時間インキュベートした後、化学発光（ECL）検出試薬を用いて免疫反応バンドを可視化し、画像解析ソフトウェアを用いてデンシトメトリー解析を行った。

傷癒合アッセイ（スクラッチアッセイ）

創傷治癒アッセイでは、C666-1細胞を6ウェルプレート内で80%コンフルエンシーまで培養した。200 µLピペットチップを用いて掻き取り、単層細胞に均一な創傷を導入した。剥離した細胞をPBSで洗浄して除去した後、培地を無血清培地に交換し、24時間インキュベートした。細胞遊走能を評価するため、光学顕微鏡を用いて0時間および24時間における創傷領域の画像を撮影した。

トランスウェルアッセイ

細胞浸潤能は、50 µLの基底膜マトリックスをあらかじめコーティングしたトランスウェルチャンバー（孔径8-µm）を用いて評価した。C666-1細胞の浸潤能をトランスウェルチャンバーを用いて測定した。上部インサートには血清飢餓培地で懸濁した細胞を播種し、下部ウェルには10% FBS含有DMEMを入れた。24時間のインキュベーション後、メンブレンの頂端側に残っていた細胞を慎重に除去した。定量のため、基底膜側に浸潤した細胞をメタノールで固定し、0.1%クリスタルバイオレットで染色した後、光学顕微鏡で撮影した画像から細胞数を計測した。

フローサイトメトリー

アポトーシスの定量にはフローサイトメトリーを用いた。サンプルの調製として、C666-1細胞を回収し、氷冷PBSで洗浄後、100 µLのバインディングバッファーに再懸濁した。次に、細胞をAnnexin-V-FITC (20 µg/mL) とプロピジウムイオダイド (PI) で共染色した。この染色は、遮光した状態で氷上で15分間行った。その後、直ちにフローサイトメーターでデータを取得し、アポトーシス細胞の割合を算出した。

caspase-3活性の検出

Caspase-3活性は、市販のアッセイキットを用い、製造元の指示に従って測定した。簡潔に述べると、C666-1細胞を溶解し、14,000 × gで遠心分離した後に上清を回収した。提供された試薬とともに2時間インキュベートした後、各上清の吸光度を405 nmで定量した。

RT-qPCR

市販のRNA抽出試薬を用いて、C666-1細胞から全RNAを精製した。得られたRNAを、製造元のプロトコルに従い、市販のキットを用いて第一鎖cDNAに逆転写した。その後、SYBR Greenベースのマスターミックスを用い、リアルタイムPCRシステムによる定量PCR（qPCR）で遺伝子発現解析を行った。転写産物の相対レベルの決定には、比較Ct（2⁻△△Ct）法を用いた。増幅に使用したプライマー配列は以下の通りである：β-actin（Forward: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'; Reverse: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'）およびKDM1A（Forward: 5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3'; Reverse: 5'-GTTGGAGAGTAGCCTC AAATGTC-3'）。

チオバルビツール酸反応物質 (TBARS) 測定法

脂質過酸化を測定するため、まずC666-1細胞から、沈殿（15% TCA、500 mM BHA）および10,000 × gで10分間の遠心分離により上清を調製した。次に、これらの上清を0.375%チオバルビツール酸と反応させ、100 °Cで10分間加熱してMDA-TBA付加体を生成させた。脂質過酸化の指標となるこの付加体のレベルを、マイクロプレートリーダーを用いて532 nmにおける吸光度を測定することで決定した23。

脂質活性酸素種 (ROS) の検出

脂質過酸化の検出には、脂質過酸化蛍光プローブを用いた。C666-1細胞を6ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、蛍光プローブ（2 µM）を添加した。このプローブは、酸化に伴い蛍光が赤から緑へとシフトする特性を持つ。緑色／赤色蛍光比を、共焦点レーザー走査顕微鏡および画像解析ソフトウェアを用いて解析した。プロットされた緑色／赤色蛍光比は明確に定義されており、脂質過酸化レベルの定量的指標として利用した24。

Fe2+の検出

細胞内二価鉄（Fe2⁺）レベルを細胞内鉄蛍光プローブを用いて測定した。C666-1細胞を10 µMの蛍光プローブとともに10分間インキュベートした。過剰なプローブを除去するためにPBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡により細胞を解析した。

分子ドッキング解析

分子ドッキングは、リガンドとその標的タンパク質の結合モードを評価することで、両者の結合親和性と相互作用を予測し、新規薬剤設計を促進する極めて重要な計算手法である25。RCSB PDBのウェブページ（https://www.rcsb.org/）から、KDM1Aの3D構造（PDB ID: 6NQU）を取得した。KDM1Aタンパク質構造の調製において、水分子および不要な低分子リガンドを除去した。分子ドッキングシミュレーションは、ラマルク遺伝アルゴリズムを用いた分子ドッキングソフトウェアを用いて実施し、可視化には分子可視化ソフトウェアを使用した26。

統計解析

すべての実験は少なくとも3回以上の独立した生物学的反復を用いて行われ、結果は平均値 ± 標準偏差（SD）として示している。統計解析には統計解析ソフトウェアを使用した。多群間の差は、一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較ポストホック検定によって評価した。P値が0.05未満の場合を、統計的に有意な差があるものとみなした。

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結果

ルスコゲニンは、上咽頭癌細胞の生存能および増殖を選択的に抑制する

まず、正常な鼻咽頭上皮細胞（NP69）および鼻咽頭癌（NPC）細胞（C666-1）の両方に対するruscogenin（Rus）の生存率への影響を調査した。CCK-8アッセイで判定したところ、10、20、および50 µMの濃度のRus処理は、正常なNP69細胞に対して有意な毒性を示さなかった。対照的に、Ruscogenin（Rus）は、濃度およびインキュベーション時間の両方に依存した形式で、C666-1癌細胞の生存を著しく損なわせた。最も顕著な細胞毒性活性は50 µMで観察された（p < 0.001）（Figure 1B-C）。次に、Rus処理後のC666-1細胞のコロニー形成能を評価するためにコロニー形成アッセイを行ったところ、Rusが非常に有意な用量依存的 manner でC666-1細胞のコロニー形成生存を著しく抑制することが示された（

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ディスカッション

上咽頭癌（NPC）は転移の頻度が高い深刻な悪性腫瘍であり、より優れた介入策が急務となっています27。本研究では、Radix ophiopogonisの誘導体として得られる天然物であるルスコゲニン（Rus）が、NPC細胞に対して強力な抗腫瘍効果を持つことを示します。また、Rusはヒストン脱メチル化酵素KDM1Aを抑制することでNPCの進行を阻止し、その結果としてアポトーシスとフェロトーシスという2種類の異なるプログラム細胞死を促進することが結論付けられました。本論文では、NPCにおけるこれまで未知であったRus-KDM1Aシグナル軸について、治療的可能性を向上させ得る二重の作用機序を含めて詳述します。

がん細胞の浸潤能および遊走能は、腫瘍転移を決定付ける要因となる。がん細胞の遊走および浸潤能は転移の主要な原因の2つであり、これらは不良な臨床転帰と密接に関連している。多くの場合、これはこの状況下で高度に発現するMatrix Metalloproteinase 2 (MMP 2)やMMP 9などの蛋白分解酵素によって促進さ...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言します。また、本研究の構想、データ収集、データ分析、および図の作成において、生成AIツールは使用されなかったことを宣言します。AI支援技術は、本原稿の起稿における軽微な言語編集および文法修正のみに使用されました。著者は、出版された内容および完全性について全責任を負います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7500 Fast リアルタイムPCRシステムApplied Biosystems4351106RT-qPCR分析
Annexin-V-FITC/PI アポトーシス検出キットBD Biosciences556547フローサイトメトリーによるアポトーシス検出
抗ACSL4抗体Abcamab155282ウェスタンブロット用一次抗体
抗Bax抗体Cell Signaling Technology (CST)5023ウェスタンブロット用一次抗体
抗Bcl-2抗体Cell Signaling Technology (CST)15071ウェスタンブロット用一次抗体
抗体
抗GPX4抗体Abcamab125066ウェスタンブロット用一次抗体
抗KDM1A (LSD1) 抗体Cell Signaling Technology (CST)2139ウェスタンブロッティング用一次抗体
抗Ki67抗体Abcamab16667ウェスタンブロッティング用一次抗体
抗MMP2抗体Abcamab92536ウェスタンブロッティング用一次抗体
抗MMP9抗体Abcamab76003ウェスタンブロット用一次抗体
抗PCNA抗体Cell Signaling Technology (CST)13110ウェスタンブロット用一次抗体
抗ウサギIgG抗体（HRP標識）Cell Signaling Technology (CST)7074二次抗体
抗SLC7A11 (xCT) 抗体Abcamab175186ウェスタンブロット用一次抗体
抗TFR1抗体Abcamab84036ウェスタンブロット用一次抗体
抗-β$\beta$-アクチン抗体Cell Signaling Technology (CST)4970ローディングコントロール一次抗体
アッセイキット
Autodock 4.2スクリプス研究所翻訳する原文が提供されていません。翻訳対象のテキストを入力してください。分子ドッキングシミュレーション
BCAタンパク質定量アッセイキットBeyotime BiotechnologyP0012タンパク質定量
BODIPY 581/591 C11プローブInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)D3861脂質ROS検出（2 μM)
C666-1細胞株iCell Bioscience Inc.iCell-h378ヒト上咽頭癌細胞株
カスパーゼ-3活性測定キットBeyotime BiotechnologyC1115アポトーシスの評価
CCK-8アッセイキット同仁化学研究所分子テクノロジーCK04細胞生存率の測定
化学物質 & 試薬
CytoFLEXフローサイトメーターBeckman CoulterCytoFLEXアポトーシス解析
ECL検出試薬MilliporeSigmaWBKLS0500ウェスタンブロットの可視化（Immobilon）
装置・器具
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco (Thermo Fisher Scientific)10099141細胞培養サプリメント
GraphPad Prism 8.0GraphPadソフトウェア翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳が必要な原文をご入力ください。統計解析およびグラフ作成
ImageJソフトウェア国立衛生研究所該当なし画像密度解析
ケラチノサイト無血清培地iCell Bioscience Inc.iCell-019NP69細胞培養用
共焦点レーザー走査顕微鏡Carl ZeissLSM 880BODIPY C11 蛍光イメージング
光学／蛍光顕微鏡OlympusIX73創傷スクラッチ法、トランスウェル & Fe2+イメージング
LightCycler 480 SYBR Green I Masterロシュ・ダイアグノスティックス4887352001定量リアルタイムPCR
Lipofectamine 2000試薬Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)11668019細胞導入試薬
マトリゲルCorning356234浸潤アッセイ用基底膜マトリックス
マイクロプレートリーダーMolecular DevicesSpectraMax M5吸光度測定（405, 450, 532 nm）
NP69細胞株iCell Bioscience Inc.iCell-h431正常ヒト鼻咽頭上皮細胞株
oe-KDM1A & oe-NCプラスミドShanghai GenePharma Co., Ltd.カスタム合成KDM1A過剰発現用プラスミド
Phen Green SK (PGSK) プローブInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)P14312細胞内Fe2+検出（10 μM)
Pymol 3.0シュレーディンガーöディンガー入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。分子ドッキングの視覚化
逆転写キットロシュ・ダイアグノスティックス4379012001Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
RIPA溶解バッファーSolarbio (中国、北京)R0010全タンパク質抽出
RPMI 1640培地iCell Bioscience Inc.iCell-0002C666-1細胞の培養に
ルスコゲニン (Rus)MedChemExpress (MCE)HY-N0193薬剤投与, 純度 ≥ 98%
ソフトウェア
TBARSアッセイキットCayman Chemical10009055脂質過酸化測定
TRIzol試薬Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)*15596026全RNA抽出

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