方法論記事

マウスにおける薬物投与および採血のためのアニマルウェルフェアに配慮した手動保定法

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DOI：

10.3791/72535

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2026年8月25日

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1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、注射や採血時にマウスを固定するための新しい手動保定法について説明します。これにより、処置中のストレスを軽減し、アニマルウェルフェアを向上させることができます。

要約

生物医学研究において動物実験は依然として不可欠であり、疾患メカニズムの解明や、医薬品および化学物質の有効性と安全性の評価に大きく貢献しています。その中でも齧歯類は、最も頻繁に使用される実験動物の一つです。実験実務において最も一般的な処置の一つに、注射や採血などの操作中の保定および固定があります。これらは通常、鎮静剤や麻酔を使用せず、覚醒状態のマウスに対して行われます。動物と操作者の双方の安全を確保するためには、適切な保定が必要です。しかし、手による固定や保定筒などの従来の保定方法は、マウスに急性ストレス反応を誘発させることが知られており、それによって動物福祉に悪影響を及ぼし、実験結果に影響を与える可能性があります。3R原則の枠組みにおけるリファインメント（改善）を促進し、動物福祉を向上させるため、本プロトコルでは、マウスへの注射および採血用に新しく開発されたアプリケーショントンネルの使用について説明します。このトンネルは、従来の手法と比較して、低刺激でありながら確実に保定できる方法を提供します。この福祉重視の保定法は、腹腔内注射、静脈内注射、採血などの標準的な処置に容易に導入することができ、実験マウスへのストレスを最小限に抑え、ハンドリング条件を改善することが可能です。

概要

動物実験は引き続き生物医学研究において中心的な役割を果たしており、疾患メカニズムの解明や、医薬品および化学物質の有効性と安全性の評価に大きく貢献しています。げっ歯類は最も一般的に使用される実験動物種であり、欧州連合では2023年に科学的目的で約350万匹のマウスと50万匹のラットが使用されました1。実験処置によって引き起こされる苦痛に対する社会的な認識が高まったことで、3R原則2,3に基づき、研究における動物福祉を向上させるための法的要件が設けられています。動物実験を代替法で完全に置き換えることはまだ不可能なため、動物の苦痛を軽減させるためには、既存の実験手順を最適化することが特に重要です。注射などの処置中の固定拘束を含むハンドリングは、日常的なケアおよび実験の両方において、実験動物が受ける最も一般的な介入の一つです。

腹腔内注射における従来の固定法では、親指と人差し指で首の皮膚と被毛をしっかりと掴み、尾を固定して、注射のために腹部を露出させるよう動物を回転させます。この姿勢は不自然であり、呼吸困難を招く可能性があり、それが動物に恐怖心を与えます4。すでに、例えば、従来のネックグリップ法に比べて頸部への圧迫を軽減した、いわゆる3フィンガー法を含む、さまざまな改良された固定法が報告されています4。別の方法では、完全な固定を大幅に回避しています。この方法では、尾と後肢を固定して下腹部への注射を可能にする一方で、動物がワイヤーメッシュにつかまることができます5。それにもかかわらず、どちらの手順にも限界があります。3フィンガー法では、依然として動物を持ち上げて不自然な姿勢に置く必要があり、潜在的にストレス反応を誘発する可能性があります。一方、もう一方の代替手法は、ストレスを受けた動物や防御的な動物による噛みつきに対して十分な保護を提供できず、注射に充てられる時間を制限する可能性があります。噛みつきによる怪我の可能性に加えて、不適切な固定や、誤って針を刺してしまう怪我のリスクも高まります。静脈注射や尾静脈からの採血のための固定には、動物を保持せずに固定する拘束具を使用する必要があり、これにより処置のために手が自由になります。拘束具は一般的に透明なアクリルのチューブでできており、尾を出すためのアクセススロットまたは穴がある閉じた端と、マウスを挿入するための開いた端があり、調整可能なプラグで固定できます。これには、動物を尾で持ち上げ、尾をアクセススロットに通せるように、後端から拘束具の中に引き入れる必要があります。これはストレスの多い手順であり、処置中にマウスが回転するのを防ぐために必要な拘束具の直径がかなり狭いため、さらに悪化し、結果として怪我につながる可能性があります6,7。

本プロトコルでは、マウスへの投与および採血のために新しく開発されたアプリケーショントンネルの使用方法について説明します。このトンネルを用いることで、固定の確実性を維持しながら、より低刺激な固定が可能になります。トンネルは、剛性のある外枠と、取り外し可能なぬいぐるみのような内張りで構成されており、動物の巣に似た柔らかく暗い空間を作り出します。従来の保定具と比較して、このトンネルは、サイズに合わせてカットしたVetbed Isobedインサートを収容できるよう、意図的に大きな寸法で設計されています。これにより、十分な保定力を維持しつつ、動物の安心感を高める柔らかく快適な内張りを提供します（Figure 1A–B）。トンネルの両端は開放されており、マウスは前からそのまま歩いて入り、後ろから出ることができます。一度トンネルに入ると、動物は方向転換できなくなり、その間、静脈注射や採血のために尾へのアクセスが可能になります（Figure 1C）。腹腔内投与の場合、トンネルを傾けて配置し（Figure 1D）、動物の尾の付け根を持ちながら仙骨領域に軽く圧力をかけてマウスの後端を上方に曲げることで、腹部尾側にアクセスできます（Figure 1C）。この方法は、手による固定が不要であるため、マウスと実験者の双方にとってストレスが少なくなります。

先行研究により、腹腔内投与にトンネルを使用することで、頻回に腹腔内投与を行う実験モデルにおいてさえ、ストレスレベルを永続的に低下させ、マウスの福祉を向上させることが示されています8。本研究では、この適用トンネルを、雌雄両方のマウスにおける静脈内投与および尾静脈からの採血についても試験し、その有効性を確認しました。

プロトコル

本プロトコルに記載されているすべての手順は、管轄の地方当局（ベルリン州保健社会局（LAGeSo）；承認番号 2022-077-G）によって審査および承認されており、ARRIVE 2.0ガイドラインに従って実施されました。本研究で使用したすべての材料は、材料表に記載されています。

1. 静脈内投与

注意：この手法では、マウスへの静脈内投与におけるアニマルウェルフェアに配慮した手動保定法について説明します。静脈内注射は、施設の方針および確立された安全・衛生手順に従い、訓練を受けた人員のみが実施してください。

  1. 動物の調製
    注意：動物を扱う際は、常に施設のバイオセーフティおよび衛生要件に従い、必要な個人用保護具（PPE）（ガウン、手袋、キャップ、マスクなど）を着用してください。
    1. 血管拡張を促進し、尾静脈の視認性を高めるため、ホームケージを赤色灯の下に10～15分間置く。
  2. 作業領域の準備
    1. アプリケーショントンネルを70%エタノールで洗浄します。その後、約5分間放置し、エタノールを完全に蒸発させます。
    2. 洗浄およびオートクレーブ滅菌済みのライニング（Vetbed Isobedを必要なサイズにカットしたもの）を丸めてトンネル内に配置します（図1B).
    3. 指を用いて、トンネル入口のライニングを、残りの開口部が隣接する指2本分の幅程度になるまで、ゆっくりと圧縮する。それ以上にライニングを圧縮してはならない。
    4. アプリケーショントンネルを作業面に配置し、トンネル入口の前に追加のフラットライニングを敷きます。
    5. 目的の注入液を満たした27G針付きの注入用シリンジを用意し、トンネルの横に配置します。綿棒と消毒用スプレーがすぐに使用できる状態にあることを確認してください。
  3. トンネルを用いたアニマルウェルフェアに配慮した保定
    1. ハンドリングチューブを用いて、マウスをホームケージから移動させる。
    2. ハンドリングトンネルをトンネルの開口部の直前に配置し、マウスが自発的にアプリケーショントンネルに入るようにします（図1C).
      注：マウスの中には、トンネルに自発的に入る前に、塗布用トンネルの前に敷いたライニングの上にまず乗ることを好む個体がいます。尾の付け根をそっと保持することで、マウスがトンネルの深くまで入りすぎるのを防ぐことができます。
    3. 中に入ると、マウスは通常、方向転換することなく、丸められたライニング内に留まります。
      注意：マウスがトンネルに入らない場合は、開口部が小さすぎる可能性があります。トンネル入口のライニングをわずかに圧縮してください。マウスが小さすぎて方向転換してしまう傾向がある場合は、巻き付けたライニングを締め直すか、層を追加してください。図1B).
  4. 静脈内注射
    注：静脈内注射は、確立された従来の尾静脈注射の手順を用いて行う。
    1. 尾の先端を持ってゆっくりと伸ばし、予定の注射部位を消毒します。尾を約 90° 外側尾静脈を背側に位置させる。
    2. 必要に応じて、より近位の部位で再度試行できるよう、尾の遠位端から注射を開始してください。
      重要ステップ：針を約15〜の角度で挿入します。20° 尾に対して針をほぼ平行に保ちながら挿入する。尾静脈は浅い位置にあるため、針先（ベベル）からわずかに突き出る程度に留める。正しく挿入されていれば、注入時の抵抗が最小限となり、注入液が静脈内を流れるのが視認できる。目的の量を、低速かつ一定の速度（13秒間に5 mL/kg以下）で注入する。針を抜いた後、出血を防ぐため、滅菌綿棒で注入部位を軽く圧迫する。
      注意：使用済みの針および注射器は、直ちに耐刺 punctures 且つ漏洩防止機能付きの鋭利物容器に廃棄してください。針刺し事故を防ぐため、注射器にキャップを戻さないでください。
  5. 解放と正の強化
    1. マウスが入っているトンネルをホームケージに戻し、動物がトンネルの反対側の端から自発的に脱出するようにしてください（図1C).
    2. ポジティブリインフォースメント（正の強化）および処置への馴化を促進するため、ホームケージ内で報酬（おやつ）を与えてください。
  6. 洗浄およびメンテナンス
    1. アプリケーショントンネルから内張りを取り除きます。アプリケーショントンネルを70%エタノールで洗浄します。
    2. ライニングが清潔なままであれば、以降の実験で再利用可能です。汚染されているか、目に見えて汚れている場合は、洗浄およびオートクレーブ滅菌を行ってから再利用してください。
      注意： 実験群ごとにライニングを1枚使用してください。異なる実験間、雄および雌の動物間、および施設内の衛生ガイドラインで要求される場合はいつでも、ライニングを交換してください。

2. 腹腔内投与

注：本手法では、マウスへの腹腔内投与におけるアニマルウェルフェアに配慮した手動保定法について説明します。腹腔内注射は、施設のガイドラインを遵守し、確立された安全および衛生手順に従って、訓練を受けた人員のみが実施してください。注射部位へのアクセスを向上させるため、マウスの後肢側を高く持ち上げる傾斜プラットフォーム（ウェッジ）と併せてアプリケーショントンネルを使用します。

  1. 作業エリアの準備
    1. 適用トンネルとウェッジを70%エタノールで清浄する。エタノールが完全に蒸発するまで約5分間待機する。
    2. 洗浄およびオートクレーブ滅菌済みのライニング（Vetbed Isobedを必要なサイズにカットしたもの）を丸めてトンネル内に配置する（Figure 1B）。
    3. 指を用いて、トンネル入口のライニングを、残りの開口部が隣り合う指2本分ほどの幅になるまで軽く圧縮する。ライニングをそれ以上に圧縮してはならない。
    4. 作業面上にあるウェッジの上に適用トンネルを設置し（Figure 1D）、トンネル入口の前にさらに平らなライニングを配置する。
    5. 27G針を装着し、所望の注射液を満たした注射器を準備し、トンネルの横に置く。
  2. トンネル内での福祉に配慮した保定
    注意：動物を扱う際は、施設内のバイオセーフティおよび衛生要件に従い、常に必要な個人用保護具（PPE）（ガウン、手袋、キャップ、マスクなど）を着用すること。
    1. ハンドリングチューブを用いてマウスをホームケージから移動させる。ハンドリングチューブをトンネル開口部の直前に配置し（Figure 1C）、マウスが自発的に適用トンネルに入るように誘導する。
      注：マウスによっては、自発的にトンネルに入る前に、適用トンネルの前に置かれたライニングの上にまず乗りたい場合がある。この場合は、トンネルをウェッジに設置する前に、まずマウスをトンネル内に進入させる。
    2. マウスが入ったら、マウスがトンネルの奥へ行き過ぎないよう、尾の付け根を人差し指と親指で軽く保持する。通常、マウスは向きを変えることなく、丸めたライニングの中に留まる。
      注：マウスがトンネルに入らない場合は、開口部が小さすぎる可能性がある。トンネル入口のライニングをわずかに圧縮する。マウスが小さすぎて向きを変えようとする場合は、丸めたライニングをきつく締めるか、層を追加する（Figure 1B）。
  3. 腹腔内注射
    1. 片手の親指と人差し指で尾の付け根を保持する（Figure 1C）。同じ手の中指を用いて仙骨領域に軽く圧力をかけ、尾をわずかに上向きに回す。これにより動物が安定し、腹部尾側へのアクセスが容易になる。
    2. 重要ステップ：注射器を作業面と平行に保持し、視認可能な腹部尾側領域に挿入して注射を行う。
    3. 注射後、ゆっくりと圧力を緩め、尾を離す。
      注意：使用済みの針および注射器は、直ちに耐 punctures 性および漏れ防止機能のある鋭利物廃棄容器に廃棄すること。針刺し事故を防ぐため、注射器のキャップを再度閉めようとしてはならない。
  4. 解放と正の強化
    1. マウスが入った状態のトンネルをホームケージに戻し、動物がトンネルの反対側から自発的に出るようにする（Figure 1C）。
    2. 正の強化と処置への馴化を促進するため、ホームケージ内で報酬（おやつ）を与える。
  5. 洗浄およびメンテナンス
    1. 適用トンネルから内部ライニングを取り出す。適用トンネルとウェッジを70%エタノールで清浄する。
    2. ライニングが清潔なままであれば、次回の実験に再利用できる。汚染されているか目に見えて汚れている場合は、再利用前に洗浄およびオートクレーブ滅菌を行う。
      注： 実験群ごとに1枚のライニングを使用すること。異なる実験間、オスとメスの動物間、および施設内の衛生ガイドラインで要求される場合にライニングを交換する。

3. 尾静脈からの採血

注：本手法では、マウスの尾静脈からの採血における、アニマルウェルフェアに配慮した手動保定法について説明します。すべての手順は、施設ガイドラインおよび確立された安全・衛生プロトコルに従い、訓練を受けた担当者が実施しなければなりません。

  1. 作業エリアの準備
    1. アプリケーショントンネルを70%エタノールで洗浄し、約5分間置いてエタノールを完全に蒸発させる。
    2. 洗浄およびオートクレーブ済みのライニングを丸めたもの（Vetbed Isobedを必要なサイズにカットしたもの）をトンネル内部に配置する（Figure 1B）。
    3. 指を使用して、トンネル入口のライニングを、残りの開口部が隣接する指2本分の幅になるまで軽く圧縮する。ライニングをそれ以上に圧縮してはならない。
    4. アプリケーショントンネルを作業台の上に配置し、トンネル入口の前に追加の平らなライニングを敷く。
    5. ランセット、採血用マイクロチューブ、綿棒、および消毒用スプレーがすぐに使用できる状態にあることを確認する。
  2. トンネルを用いたアニマルウェルフェアに配慮した保定
    注意：動物を扱う際は、施設におけるバイオセーフティおよび衛生要件に従い、常に必要な個人用保護具（PPE）（例：ガウン、手袋、キャップ、マスク）を着用すること。
    1. ハンドリングチューブを用いてマウスをホームケージから移動させる。ハンドリングチューブをトンネル開口部の直前に配置し、マウスが自発的にアプリケーショントンネルに入るようにする（Figure 1C）。
      注：マウスによっては、自発的にトンネルに入る前に、まずアプリケーショントンネルの前に敷いたライニングの上に乗りたい場合がある。マウスがトンネルの深くまで入りすぎるのを防ぐには、尾の付け根を軽く保持する。
    2. 一度中に入ると、通常、マウスは向きを変えることなく丸めたライニングの中に位置したままである。
      注：マウスがトンネルに入らない場合は、開口部が小さすぎる可能性があるため、トンネル入口のライニングをわずかに圧縮する。マウスが小さすぎて向きを変えようとする場合は、丸めたライニングを締め付けるか、層を追加する（Figure 1B）。
  3. 採血
    1. 尾の先端を持って軽く真っ直ぐに伸ばし、予定の採血部位を消毒する。尾を約90°回転させ、側尾静脈が背側にくるように配置する。
    2. 重要なステップ：ランセットを用いて側静脈を穿刺する。マイクロチューブまたはキャピラリーを用いて血滴を回収する。
      注意：使用済みのランセットは、直ちに耐穿刺性・漏洩防止機能付きの鋭利物廃棄容器に廃棄すること。針刺し事故を防ぐため、ランセットにキャップを戻そうとしてはいけない。
    3. 採血後、滅菌綿棒で穿刺部位を軽く圧迫し、止血させる。
  4. 解放と正の強化
    1. マウスが入ったトンネルをホームケージに戻し、動物がトンネルの反対側から自発的に出るようにする（Figure 1C）。
    2. 正の強化および処置への馴化を促すため、ホームケージに報酬（おやつ）を与える。
  5. 洗浄およびメンテナンス
    1. アプリケーショントンネルから内部ライニングを取り出す。アプリケーショントンネルを70%エタノールで洗浄する。
    2. ライニングが清潔なままであれば、以降の実験で再利用できる。汚染されていたり目に見えて汚れている場合は、再利用前に洗浄およびオートクレーブを行う。
      注：実験群ごとに1枚のライニングを使用する。異なる実験間、オスとメスの動物間、および施設の衛生ガイドラインで要求される場合はいつでもライニングを交換すること。

結果

新しい保定技術がマウスの福祉に及ぼす影響を評価するため、記載されたプロトコルに従って尾静脈からの採血および静脈内注射を実施した。野生型のC57BL/6マウス（雄および雌）を、アプリケーショントンネルまたは従来の保定器のいずれかで処置し、痛みやストレスの兆候を評価した。尾静脈からの採血後、マウスのストレスレベルを決定するためにマウス・グリマススケール（MGS）を用いた。MGSは、痛みやストレスを伴う処置への反応としての顔面筋肉の表情を分析する、広く利用されているスコアリングシステムである9,10。スコアを決定するため、マウスを保定器またはトンネルから解放した直後に写真を撮影した（代表的な画像はFigure 2に提示している）。マウスの行動評価に習熟した2名の観察者が、3つの顔面表情パラメータ（Figure 2Cの概略図に記載）を評価した。具体的には、眼窩の締まり（眼瞼の閉鎖と眼窩領域の狭小化。目の周囲にしわが見られる場合がある）、鼻の膨らみ（鼻梁の膨らみと鼻側面の垂直方向のしわが現れる場合がある）、および耳の位置（耳が顔から外側および／または後方へ回転し、折り畳まれて「尖った」形状を形成する場合がある。耳の間の距離が増大する）である。ひげの位置と頬の膨らみについては、マウスの被毛の色が暗く、信頼性の高い評価が困難であったため評価しなかった。各パラメータは0から2の3段階尺度（0 = なし、1 = 中程度にあり、2 = 明らかにあり）を用いてスコア化し、3つの顔面パラメータを平均して動物1匹あたりの平均MGSスコアを算出した。信頼性を確保するため、各動物は両方の観察者によって独立して、かつ盲検化された状態でスコア付けされ、その後2つのMGSスコアを平均して各動物の最終的なMGSスコアを生成した。雌雄ともに、従来の保定器と比較してアプリケーショントンネルで採血を行った場合に、MGSスコアが有意に低下した（Figure 2A–B）。

別のマウス群に対し、0.9% 塩化ナトリウム (NaCl) 100 µL を静脈内注射し、可聴発声の発生回数および拘束器具内での方向転換の試行回数を記録した。マウスは、特に痛みや恐怖を感じているときや防御行動の間など、強いストレスの兆候として、可聴レベルの鳴き声で発声する11,12,13。加えて、マウスは身体的拘束に対して自然にパニック反応を示し、その結果、閉じ込められた空間から脱出しようとする逃避反応が起こる。したがって、拘束器具内で180度回転しようとする試みは、恐怖の兆候であると考えられた。雌雄いずれのマウスにおいても、アプリケーショントンネルを用いた場合と比較して、拘束具内で静脈内注射を行った場合に、可聴発声および方向転換の試行の発生頻度が高くなることが観察された（図 3）。

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図 1: 新しい適用トンネル。 (A) 従来の拘束具と新しい適用トンネルのサイズの違いを示す代表的な画像。 (B) トンネルの内張りは、適当なサイズにカットしたロール状のVetbedで構成されており、柔らかく、支持力があり、暗い環境を提供します。マウスが小さすぎて回転しやすくなる場合は、ロール状の内張りを締めて利用可能なスペースを狭めることができます。 (C) 入退室、安全で快適な固定、および腹部と尾へのアクセスを含む、適用トンネル内での異なるハンドリング手順。 (D) トンネル内で腹腔内注射を行うための追加のウェッジ。ウェッジによってハンドラーに対するトンネルの角度が高まり、腹部領域へのアクセスが容易になります。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 2: 尾静脈からの採血後におけるマウスのgrimace scale（顔面表情スケール）。 雄または雌のマウスを、アプリケーショントンネル内または従来の拘束具を用いて採血に供した。マウスのgrimace scaleを評価するための写真は、動物が拘束具またはトンネルから出た直後に撮影され、その後、マウスの群分けについて盲検化された2名の経験豊富な実験者によって、眼窩の収縮、鼻の膨らみ、および耳の位置が独立してスコア付けされた。2つのスコアに基づいて、個体ごとの平均スコアが算出された。（A）雌マウス（トンネル n = 5; 拘束具 n = 8）。（B）雄マウス（トンネル n = 11; 拘束具 n = 11）。このグラフはSchlutt et al., 2026, PLOS ONEから改変したものである。CC BY 4.0ライセンスの下で棒グラフとして公開されていた元のデータは、ここで修正され、箱ひげ図として再プロットされている。（C）ChatGPT Image 2（OpenAI; https://chatgpt.com/より利用可能）を用いて著者作成のテキストプロンプトから生成された、顔面アクションユニットの概略図。最終的な画像は、科学的な正確性について著者によって確認および承認された。データは箱ひげ図（最小値から最大値）で示し、線は平均値を示す。Mann-Whitney検定を用い、p-value < 0.05を有意とした。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 3: 静脈内注射後の可聴発声および反転試行。雄または雌のマウスに対し、投与用トンネル内または従来の保定具を用いて 100 µL 0.9% NaCl を静脈内注射した。処置中の保定装置内における可聴発声および反転試行の発生回数を記録した（yes/no）。全群 n = 10。データは積層棒グラフの分割表として提示している。フィッシャーの直接確率検定を用い、p-value < 0.05 を有意とした。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1：大型の適用トンネルを用いたラットへの腹腔内投与より大きな直径（15 cm）の適用トンネルを使用して、ラットへの腹腔内投与を行った。手順は、マウスについて記載されたプロトコルと同様に実施した。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

この保定技術は、動物福祉のベストプラクティスなアプローチを支援するため、物質の投与および血液サンプリング用に開発されました。一部の科学コミュニティでは、特に追加の時間と労力を要する場合、長年確立されてきた標準的な手順とは異なる洗練されたハンドリングおよび保定方法の導入に依然として消極的な傾向があります。しかし、実験動物のストレスを軽減することは、動物福祉の観点から望ましいだけでなく、データのばらつきを抑え、ストレス誘発性の生理学的変化を最小限にし、失敗した試行や動物の脱落を減らすことで、実験の成功に大きく寄与します。本プロトコルでは、安全な適用およびサンプリング手順のための確実な保定とハンズフリーでのアクセスを提供しつつ、動物福祉を大幅に向上させる、導入が容易な方法を紹介します。

プロトコルにおける重要なステップは、アプリケーショントンネルへの正常な進入と、その中での安定した位置確保を確実にすることです。自発的な進入には、2つのアプローチが推奨されます。1つは移送チューブからトンネルへ直接進入させる方法、もう1つは移送チューブからあらかじめ配置したソフトライニングの上にマウスを置き、そこからトンネルへ進入させる方法です。最適なアプローチは動物の行動に依存するため、両方の方法を評価する必要があります。マウスが最も迅速に、かつ最も抵抗なく進入する方法が好ましいバリアントとなります。マウスがトンネルへの進入をためらう場合は、いくつかの要因を検討すべきです。(1) 進入口が狭すぎる可能性があり、その場合はライニングをわずかに圧縮して開口部を広げることができます。(2) 内部ライニングからの臭気の手がかりが受容性に影響を与える可能性があるため、ライニングには馴染みのあるケージの臭いを保持させることが望ましいですが、同時に実験群、ケージ、性別間の分離を確保し、混同を招く臭いを避けるために汚れた素材を交換してください。(3) マウスは自身の毛色に近い色の表面でより安全に感じることが示されているため14、ライニングの色を動物の毛色に合わせることが有益である可能性があります。(4) トンネルの開口部をケージの壁側に向けることで、マウスがホームケージやケージメイトを確認でき、進入が促進される場合があります。アプリケーショントンネルの潜在的な制限は、動物の自発的な進入に依存しているため、処置やサンプリングの前に短時間の遅延が生じると捉えられる可能性があることです。しかし、本研究ではマウスは通常 2–10 s 以内に迅速かつ一貫してトンネルに進入し、狭い範囲で再現性のある時間枠内で手順を実施することができました。このアプローチは従来の項皮拘束よりもわずかに時間を要するかもしれませんが、ハンドリング時間のわずかな増加は、ハンドリングに伴うストレスの軽減によって達成される動物福祉の大幅な改善と天秤にかけるべきです。さらに、従来型の拘束具への挿入においても、マウスが配置に抵抗することが多く、ハンドリング時間を要するため、実質的な差はありません。5%未満のケースで、マウスが自発的にトンネルに進入しませんでした。上述の対策は一般的に進入を促すのに十分でしたが、必要に応じて動物を優しくトンネルへ誘導することも可能です。このような場合であっても、ソフトな内部ライニングは従来の拘束具よりも福祉上の利点があります。

マウスがトンネルの中に入ると、内張りをしっかりと掴むことができます。これは動物福祉の観点から非常に好ましく、ハンドリング中に表面を掴ませることで、拘束されたマウスのストレスレベルが低下することが示されています4。同時に、ハンドラーはマウスが向きを変えようとすることなく、尾の付け根をしっかりと保持できます。内張りが動物をぴったりと囲んでいることが不可欠です。マウスが小さすぎてトンネル内で回転しがちな場合は、巻いた内張りを締め直すか、層を追加することで迅速に調整できます。異なるサイズ（年齢、性別、食事の違いなどによる）の動物を用いる実験では、直径の異なるトンネルを使用することも可能です（プリントテンプレートを参照してください8）。

注射および採血は、常に訓練を受けた人員によって行われる必要があります。それでも、アプリケーショントンネルは、熟練した人員と経験の浅いユーザーの両方にとって有効でした。特に、経験の浅い人員において失敗回数が減少したことが報告されており、これにより繰り返しの操作や処置時間の延長が軽減されました。また、ユーザーは従来のハンドフィクセーション技術を習得する場合と比較して、トンネル内でマウスを保定する方が、より快適で安心感があると感じたと報告しています。この手法は導入が容易であり、動物と実験者の双方に利益をもたらすため、人員の入れ替わりが頻繁な研究室にとって大きな利点となります。これらの観察結果は、トンネルハンドリングやカップハンドリングのような洗練されたハンドリング技術に関連して、以前に報告されたハンドリングの快適性と技術者の自信の向上15と一致しています。

重要な点として、ここで説明する手法は訓練を受けていないマウスにおいても有効であり、提示されたすべての結果は事前の馴化を行っていない動物を用いて得られたものである。先行研究では、動物への馴化および処置訓練を行うことで、計画された手順に慣れさせ、マウスのストレス反応を軽減できることが示されている16,17。したがって、適用トンネルを組み込んだ訓練プロトコルを導入すれば、特に頻繁な介入が必要な場合にストレスレベルをさらに低減できる可能性があり、そうでなければトンネルに対して負の連想を抱かせてしまう恐れがある。このような訓練プログラムは先行研究で正常に適用されており、これにより数週間にわたる繰り返しの腹腔内投与にトンネルを利用することが可能となった8。特に繰り返しの投与を必要とする研究において、このトンネルは大幅なリファインメント（改善）となり得る。移送チューブを用いた洗練されたハンドリング技術と拘束の軽減は、繰り返しの項背部把持や腹腔内投与の後でも、ハンドラーとの相互作用への意欲向上や、標準的な行動試験における不安様行動の減少など、肯定的な効果を維持することが示されている18,19. 同様に、トンネル内で行われた繰り返しの投与は、マウスのストレス関連パラメータを上昇させなかった8。

動物訓練において確立された原則である正の強化を通じて、餌による報酬が馴化を促進することが示されています。したがって、各ハンドリングセッションの最後に、報酬として少量のおやつを与えることが推奨されます。トンネルのテストでは、オート麦1粒などのごく少量で十分であり、動物の通常の食事に影響を与える可能性は低いです。代謝研究などで餌の摂取量が懸念される場合は、特殊食（例：ケトジェニックダイエット）に適合したフレーバー付きのおやつも利用可能です。重要な点として、おやつはアプリケーショントンネルを正常に使用するための必須条件ではなく、馴化を向上させるための追加的なリファインメント策として捉えるべきです。システムに慣れると、マウスは餌の報酬がなくても自発的にアプリケーショントンネルに繰り返し進入しました。

ここで説明する手法には、特定の身体部位へのアクセスに関して一定の制限があります。尾部は静脈注射や採血のために容易かつ安全にアクセスでき、腹部尾側領域は腹腔内投与に適していますが、皮下投与のための身体側方領域へのアクセスは制限されます。経口投与についても慎重に検討する必要があります。必要な頸部の伸展が得られないため、従来の経口ゾンデ法はこのシステムとは適合しません。しかし、マウスがピペットチップから自発的に物質を摂取する方法（例：練乳に混ぜるなど）20のような、より精緻な経口投与法であれば、トンネルの開口側から実施可能であると考えられます。その場合、頭部が明確に視認でき、物質を完全に摂取したことを確認するために、マウスがライニングやトンネルの深すぎる位置にいないことを確認しなければなりません。

既存の保定トンネルと比較して、本稿で述べる適用トンネルは動物福祉において明確な利点があります。安全な投与およびサンプリング手順のために保定が必要となることが多いものの、保定は齧歯類が実験手順中に経験する最大のストレス要因の一つであると認識されています7,21,22. 従来の尾持ちや保定を、トンネルハンドリングやカップハンドリングなどの洗練された手法に置き換えることで、動物福祉が大幅に向上することが先行研究で既に示されています。これらの洗練されたアプローチでハンドリングされたマウスは、尾を持って持ち上げられたマウスよりも不安レベルが低く、ハンドラーと相互作用しようとする意欲が高いことが示されています23,24. マウスが自発的に入る適用トンネルの使用は、トンネルハンドリングを一貫して拡張したものです。適用トンネルから出るマウスのグリマススケール（表情評価尺度）は、動物が保定されている、あるいは閉じ込められていると感じていないことを示しています。マウスがケージの格子に掴まった状態で行う腹腔内投与法は、述べられている骨盤領域のグリップリフティングに似ていますが5、前者は動物の逃避行動に基づいています。格子の上のマウスは、前肢でしがみつき、ハンドラーのグリップから離れようと前方へ引っ張るため、結果として保定状態となり、苦痛につながります。さらに、この種の保定は腹筋の緊張を高め、それに伴い針刺しによる疼痛を増強させます。対照的に、適用トンネルは洗練された保定法であり、その結果、グリマススコアの低下、可聴発声の減少、ハンドラーとの相互作用意欲の維持など、ストレス関連パラメータの減少が示されています811,12,13。超音波発声（USVs）は、行動学的に重要なコミュニケーション信号として認識されつつありますが、USVsは文脈に強く依存し、通常の生理的行動中にも発生するため、成マウスにおけるストレスマーカーとしての利用については依然として研究が進められています25。

それにもかかわらず、最近の知見では、USV記録が拘束に対する行動反応を評価するための、有望で非侵襲的、かつ再現性のあるアプローチとなり得ることが示唆されています26。したがって、今後の研究にUSV記録を組み込むことで、ストレスや情緒的反応をさらに特徴づけるための追加的な客観的指標が得られる可能性があります。 以上の結果を合わせると、本アプリケーショントンネルは、従来の拘束具と比較して、日常的な処置やサンプリングにおいてより安全でストレスの少ない拘束手順を可能にすることが示されました。重要な点として、透明なアクリル製拘束具とは異なり、内部のソフトライニングによりマウスが表面をしっかりと掴むことができるため、これはNC3Rsの推奨事項27に基づく重要な福祉的改善であると考えられます。トンネル内では、反転しようとする試みが著しく減少して観察され、動物福祉とハンドリングの安全性の両方が向上しました。従来のプラスチック製拘束具では、反転しようとする動作はしばしば排尿を伴い、その結果、被毛が濡れることで快適性がさらに損なわれます。この問題は、本アプリケーショントンネルの使用によってほぼ解消されました。

本手法の潜在的な応用範囲は広範です。特筆すべき点として、改良された抑制方法はマウスに限定されるものではなく、より大きな直径のトンネルを使用することでラットにも適用可能です。付随図 1齧歯類は、あらゆる科学分野において最も広く利用されている実験動物種であり、物質投与やサンプリングのための保定は、多くの研究室で日常的に行われている処置である。しかし、保定によるストレスは、動物福祉を損なうだけでなく、行動反応を含む科学的な結果に大きな影響を及ぼすことが示されている。28,29 および免疫機能などの生理学的メカニズム30したがって、動物実験における科学的妥当性と倫理的配慮の両面から、ストレスに起因する変動を最小限に抑えることが不可欠である。安全で実用的なハンドリングを維持しつつ、拘束に伴うストレスを軽減することで、アプリケーショントンネルの活用は、動物福祉を向上させると同時に、実験の質と再現性を大幅に改善する可能性がある。

開示事項

A.S.、J.K.U.、およびL.H.は、ドイツにおいて注入トンネルに関する実用新案権（登録番号 20 2024 100 448）を保有しています。その他の著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

私たちは、サポートを提供してくださったCharité動物施設スタッフおよび動物福祉担当官、特にAndré Dülsner博士に感謝いたします。また、アプリケーショントンネルの普及に対する資金援助をいただいたCharité 3R、および有益な議論を行ってくださったCharité 3R Refinement Taskforceの全メンバーに感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
滅菌済みアレルギー用ランセットHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Germany1110106
オプションウェッジ付き適用トンネル自作 3D プリントトンネルプリントテンプレートは https://osf.io/vsjnb で入手可能
採血管：Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, Germany20.1278.100
透明ハンドリングチューブDatesand Group, Stockport, UKGZCHTUBE-100サイズ：50 x 3 x 100 mm
エタノール, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyT913.1
Inject-F 使い捨て微量投与用シリンジ 1 mL B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany9166017V
オート麦Schapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, GermanyW100197オートクレーブ済み
Sanitas SIL 06 赤外線ランプBeurer Europe GmbH, Ulm, Germany61424
ソフト内張り：Original Vetbed Isobed SLVetbed Deutschland, Mudersbach, Germany1999981必要サイズに切断
Softasept ISO 70% 消毒スプレーB.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany19905
Sterican 27 G x ¾ 使い捨て滅菌皮下注射針B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany4657705Bサイズ：0.40 mm x 20 mm
綿棒：FIWA app 医療用アプリケーターFink & Walter GmbH, Merchweiler, Germany329012

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