本研究は、ジメチルスルホキシド（DMSO）がマウスにおけるシリカ誘発性の肺炎症および肺線維症を軽減させる可能性を示唆しています。トランスクリプトーム解析および実験的解析により、その保護効果にはIL-6/STAT3シグナル伝達経路の抑制およびMMP12発現のダウンレギュレーションが関与している可能性が示されており、珪肺症治療に向けた潜在的な治療的知見を提供しています。
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本研究は、ジメチルスルホキシド（DMSO）がマウスにおけるシリカ誘発性の肺炎症および肺線維症を軽減させる可能性を示唆しています。トランスクリプトーム解析および実験的解析により、その保護効果にはIL-6/STAT3シグナル伝達経路の抑制およびMMP12発現のダウンレギュレーションが関与している可能性が示されており、珪肺症治療に向けた潜在的な治療的知見を提供しています。
本研究の目的は、シリコーシスのマウスモデルにおいてジメチルスルホキシド（DMSO）の抗炎症作用および抗線維化作用を調査し、その治療的価値の可能性を探索することである。
鼻腔内投与により珪肺症のマウスモデルを構築し、DMSO投与を腹腔内注射により実施した。実験は1ヶ月間にわたって行われた。すべてのマウスから肺組織を回収し、その一部をトランスクリプトーム解析に供し、limmaパッケージを用いて変動的に発現する遺伝子を同定した。遺伝子機能および関連パスウェイを調査するため、ClusterProfilerを用いてジーンオントロジー（GO）および京都遺伝子・ゲノム百科事典（KEGG）の濃縮解析を行った。残りのサンプルに対しては、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色およびマッソン・トリクローム染色による組織病理学的評価を行い、さらにトランスクリプトーム解析の結果を検証するためにウェスタンブロット解析を実施した。
本研究は、DMSOがIL-6/STAT3-MMP12シグナル伝達軸を調節することにより、珪肺症における線維化プロセスを軽減させる可能性を示唆しています。シリカ誘導性珪肺症マウスモデルにおいて、DMSOは疾患に伴う体重減少を抑制し、コラーゲンの沈着を減少させました。トランスクリプトーム解析の結果、DMSOは複数の線維化関連パスウェイの活性を抑制し、有意に発現低下したMMP12を含む51個の主要遺伝子を同定しました。ウェスタンブロット解析により、MMP12の発現低下がさらに確認され、それに伴いIL-6およびp-STAT3のレベルも著しく減少したことから、IL-6/STAT3パスウェイがMMP12の発現調節に重要な役割を果たしていることが示唆されました。
DMSOは、IL-6/STAT3シグナル伝達経路の活性化を抑制し、それに伴いMMP12の発現を減少させることで、珪肺症における炎症反応および肺線維症を軽減させる可能性があります。
珪肺症は主要な職業性肺塵症の一つであり1、シリカダストへの長期的な曝露に起因する持続的な肺炎症および不可逆的な肺線維化を特徴とする2,3。この珪肺症の病態生理は非常に複雑である。これまでの研究により、マクロファージの異常活性化4、線維芽細胞の過剰増殖、上皮間葉転換、および細胞外マトリックス（ECM）成分の異常沈着が、線維化の進展における重要な寄与因子であることが示されている5,6。しかし、炎症と線維化の悪循環を支える中心的な分子メカニズムは、まだ完全には解明されていない。特に、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）ファミリーは、ECMのリモデリングおよび病理的な線維化の進行において極めて重要な役割を果たしている7。中でも、マクロファージから特異的に分泌されるマトリックスメタロプロテアーゼ12（MMP12）は、エラスチン、フィブロネクチン、IV型コラーゲンなどの主要なECM成分を分解し、慢性閉塞性肺疾患を含む線維性疾患の病態形成において重要な役割を担っている8。近年の研究では、マクロファージ由来のMMP12が、肺線維化の過程で内皮細胞を損傷させることにより、線維化をさらに促進させる可能性が示唆されている9。
多様な生物学的活性を持つ低分子化合物であるジメチルスルホキシド（DMSO）10は、膀胱炎を含むいくつかの炎症性疾患において抗炎症効果を示しており、間質性膀胱炎の治療薬として米国食品医薬品局（FDA）に承認されています11。近年の研究では、DMSOが炎症因子の放出を抑制し、酸化ストレス応答を軽減させることで、線維化の進行をある程度遅らせる可能性が示唆されています12。Ingrid Elisiaらによる研究では、DMSOが全血モデル中のヒト単球においてERK1/2、p38 MAPK、JNK、およびPI3K/Aktシグナル伝達経路の活性化を特異的に抑制し、それによって抗炎症効果を発揮することが報告されています13。
MMPファミリーが珪肺症の線維化プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されていますが、DMSOがMMPの発現調節を通じて珪肺症の病理学的進行に影響を与えるかどうかを決定的に示した研究はありません。したがって、本研究では珪肺症マウスモデルにおけるDMSOの抗炎症および抗線維化効果を調査し、DMSO介入の鍵となる調節遺伝子ネットワークと分子メカニズムを明らかにすることで、MMPに基づいた革新的な治療戦略に理論的根拠を提供することを目的としています。
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本研究で行われたすべての動物実験は、安徽理工大学の科学技術倫理委員会（承認番号：GZ2025-048）の承認を得ており、中国の実験動物福祉に関する国家標準（GB/T 35892-2018）を厳格に遵守して実施されました。図1に研究デザインを示します。
溶液の調製
シリカ懸濁液の調製：
結晶性シリカ（SiO₂、80%、粒子径 1–5 µm）をオートクレーブで滅菌した。次に、滅菌したシリカ粉末を滅菌生理食塩水に分散させ、最終濃度 10 mg/mL とした。投与直前に超音波ホモジナイザーを用いて懸濁液を十分に均質化し、粒子が均一に懸濁するようにした。
DMSO溶液の調製：
無菌条件下で、DMSO (≥99.9%) を滅菌生理食塩水で希釈して約 10% (v/v) の DMSO 溶液を調製し、超音波攪拌により均質化した。既報の通り14,15、各マウスに DMSO 溶液を 0.9 g/kg の用量で投与した。
実験動物
本研究では、8～12週齢の健康なC57BL/6J雄マウス32匹を使用し、実験前に1週間の馴化期間を設けた。マウスは、コンピュータによる乱数生成法を用いて、対照群、DMSO群、シリカ群、およびシリカ+DMSO群の4つの実験群（各群 n = 8）に無作為に割り当てられた。サンプルサイズは、同一のマウス・シリコーシスモデルを用いた先行研究および予備実験の結果に基づき、群間の組織病理学的および分子的な差異を検出するには1群あたり8匹で十分であると判断して決定した。動物は、温度管理された標準的な飼育条件下、12時間の明暗サイクルにおいて飼育し、餌と水は自由摂取とした。人道的なエンドポイントを研究前に設定したが、定義された早期安楽死の基準に該当した動物はいなかった。
珪質肺（シリコーシス）モデルの構築と薬剤介入
滅菌結晶性シリカ懸濁液（10 mg/mL）60 µLを1回鼻腔内投与し、珪肺症を誘発した。麻酔導入後、マウスを仰臥位に固定した。呼吸が深く緩やかになったことを確認した後、シリカ懸濁液60 µLを鼻孔に慎重に滴下し、肺へ自発的に吸入させた16。DMSO投与群のマウスには、DMSO溶液を固定用量で週2回、投与間隔を3～4日として1ヶ月間連続して腹腔内投与した。その他の群のマウスには、同様に等量の滅菌生理食塩水を投与した。実験期間中、毎日体重測定を行った。モデル作製から30日後、すべてのマウスを安楽死させ、滅菌条件下で肺組織を回収した。安楽死は、トリブロモエタノール（0.2 mL/10 g）の腹腔内投与による麻酔導入後、頸椎脱臼により行った。肺組織の一部は、トランスクリプトーム解析のため液体窒素中で保存した。また、一部の組織は病理学的染色に先立ち4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、残りの組織は後続の分子生物学的実験のために-80 °Cで保存した。すべての動物実験は、施設の動物倫理ガイドラインに従って実施した。
Ashcroft線維化スコアを含む組織病理学的評価は、実験群の割り付けについて盲検化された2名の研究者によって独立して行われた。
肺の病理学的検査
固定した肺組織を脱水、透明化し、パラフィンブロックに包埋した後、厚さ 5 µm の切片に切り出しました。
ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色：切片をヘマトキシリンで3～5分間染色し、酸性溶液で分化させ、流水下で青染し、エオシンで5分間対比染色した。段階的なエタノール系列で脱水後、キシレンで透徹し、中性樹脂で封入した17。
マッソン・トリクローム染色：切片をヘマトキシリン、リチュンレッド–酸性フクシン、ホスホモリブデン酸、およびブライトグリーンの順に順次染色した。酸性分化後、切片を脱水し、キシレンで透いさせ、中性樹脂で封入した18,19。
トランスクリプトーム解析
4つの実験群のマウス肺組織を安楽死直後に採取し、液体窒素で急速凍結させた。全RNAは、製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて抽出した。RNAの濃度と純度を測定し、内蔵ソフトウェアを備えたBioanalyzerを用いてRNAの完全性を評価した。RIN値が8.0を超えるサンプルを合格とした。ライブラリ調製では、Oligo(dT)ビーズを用いたpoly(A) mRNA濃縮、RNA断片化、cDNA合成、アダプター結紮、およびPCR増幅を行った。シーケンシングはIlluminaプラットフォームで実施し、1サンプルあたり約6.2–6.4 Gbのクリーンデータを生成した。本研究で得られたすべての生シーケンシングデータは、アクセッション番号GSE311671としてGene Expression Omnibus (GEO)データベースに登録されている。
クリーンリードをSTARアライナーを用いてMus musculusリファレンスゲノム（mm8）にマッピングした。遺伝子発現レベルは、生のリードカウントとして定量化した。差分的発現解析は、Rのlimmaパッケージを用いて行った。線形モデルを構築する前に、平均-分散関係を推定し精度重みを生成するため、voom関数を用いて生のカウントデータを変換した。生のP値はBenjamini-Hochberg（BH）法を用いて多重検定補正を行い、|log₂FoldChange| > 1.5かつ偽発見率（FDR） < 0.05の遺伝子を差分的発現遺伝子とした。機能濃縮解析は、RのclusterProfilerパッケージを用いて行った。遺伝子オントロジー（GO）濃縮解析を行い、有意に濃縮された生物学的プロセス（BP）、細胞成分（CC）、および分子機能（MF）カテゴリーを特定した。また、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ濃縮解析を行い、有意に濃縮されたシグナル伝達経路を特定した。濃縮の有意性は超幾何分布検定を用いて評価し、P値はBenjamini-Hochberg法を用いて多重比較補正を行った。補正P値（padj） < 0.05のGO用語およびKEGGパスウェイを有意に濃縮したものとした20,21,22,23}
ウェスタンブロット検出
新鮮なマウス肺組織を採取し、適切な量のラジオ免疫沈降分析（RIPA）溶解バッファーを用いてホモジナイズした。遠心分離後、上清を回収し、BCAタンパク質定量キットを用いてタンパク質濃度を測定した。その後、サンプルをローディングバッファーと混合し、100 °Cで10分間加熱した。タンパク質の分離は、10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルを用い、200 Vの電流で30分間行った。続いて、タンパク質を300 mAの定電流で30分間、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に電気転写した。膜を5%脱脂乳でブロッキングし、次にβ-Actin (1:1500)、IL-6 (1:1000)、STAT3 (1:800)、p-STAT3 (1:1500)、およびMMP12 (1:800)に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。翌日、膜をTBSTで洗浄し、二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした後、さらにTBSTで洗浄した。化学発光基質を用いてタンパク質バンドを可視化し、ImageJソフトウェアを用いてタンパク質定量を行った。
ウェスタンブロット解析は、各実験群から3つの独立した生物学的反復を用いて行われました。タンパク質サンプルは個々のマウス肺組織から調製され、各生物学的反復は1匹の独立した個体を表しています。
統計解析
すべての実験データはGraphPad Prism 9.5を用いて解析した。事前に正規性と分散の均一性の検定を行った。2群間の比較にはStudent's t-testを用い、多群間の比較にはTukeyのポストホック検定を組み合わせた一元配置分散分析（one-way ANOVA）を採用した。P ≤ 0.05を統計的に有意とみなした。
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DMSOはマウスにおいてシリカ誘発性肺線維症を軽減する（図 2）
珪肺症モデルにおける病理学的プロセスおよび肺組織の変化に対するDMSOの影響を評価するため、4つの実験群を設定した（図2A）。1ヶ月間にわたり体重変化をモニタリングした。
結果から、珪肺症群のマウスでは体重の継続的な減少が認められたのに対し、Silica+DMSO群では初期に体重減少が見られた後、DMSO投与により回復することが示された（図 2F）。珪砂への曝露から30日後、肺組織を採取し、HE染色（図 2B）およびMasson三色染色（図 2C）を用いて炎症および線維化の変化を評価した。HE染色切片...
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珪肺症は、持続的な炎症と進行性の肺線維症を特徴とし、肺機能と患者のQOLを著しく損なう、世界的に最も深刻な職業性肺疾患の一つです25。本研究では、シリカ誘発マウスモデルを用い、早期段階におけるジメチルスルホキシド（DMSO）の潜在的な保護効果を系統的に検討しました。得られた知見は、DMSO治療が炎症細胞の浸潤を抑制し、線維化による病理学的変化を軽減することを示しており、DMSOが珪肺症の初期段階において調節的な役割を果たす可能性が示唆されました。先行する実験研究では、ラットおよびマウスの両方において、DMSOが肺線維症に対して保護効果を発揮することが実証されています。Haschekらは、DMSOが実験動物モデルにおける肺の線維化変化を抑制したことを報告していますが、その基礎となる分子メカニズムは不明なままでした26。これらの知見と一致して、我々のトランスクリプトームおよびタンパク質発現解析により、DMSOが炎症シグナル伝達経路の調節を通じてシリカ誘発肺線維症を緩和する可能性がさらに示唆され、その潜在的な抗線維化活性に関するさらなるメカニズム的...
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著者は開示すべき事項はありません。
著者らは、安徽省深東生物技術開発有限公司のプラットフォーム、および技術支援をいただいた葛徳勇教授と徐磊氏に心より感謝いたします。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCAタンパク質定量キット | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6Jマウス | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| 結晶質シリカ | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| ローディングバッファー | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA溶解バッファー | Servicebio | G2002 | |
| 二次抗体 | Servicebio | GB23303 | |
| 脱脂粉乳 | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actin | Servicebio | GB11001 |
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