方法論記事

Candida albicansおよびStreptococcus agalactiaeの腟内共生マウスモデル

59 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/72557

⸱

2026年8月21日

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、マウスの膣内にCandida albicansとStreptococcus agalactiaeを共定着させる方法について詳述します。この手法は、多種微生物間の相互作用、宿主と微生物の相互作用、およびこれらの生物に対する宿主の反応を研究するために利用可能です。

要約

ヒトの膣内からは多様な微生物が単離されており、このニッチに生息する多くの生物は、共生的なライフスタイルと病原的なライフスタイルの間を切り替えることができます。群集組成や宿主環境を含む要因が疾患の結果に影響を与えますが、これらの結果を決定するメカニズムは十分に理解されていません。本稿では、女性生殖器（FGT）に定着するパソバイオントであるCandida albicansおよびStreptococcus agalactiae（B群Streptococcus、GBS）に対する、種間相互作用および宿主応答を調査するためのマウスモデルについて記述します。新たな証拠により、C. albicansとGBSが頻繁に同時に単離されることから、C. albicansの定着がGBS保有のリスク因子であることが示唆されています。妊娠中のGBS定着は、絨毛膜羊膜炎や死産を含む悪影響を及ぼす可能性があります 。また、GBSは胎内での胎児への伝播や、出生時の新生児への伝播が起こり得、新生児髄膜炎の主要な原因となります。膣内への定着はGBS疾患の重要な前駆段階であり、このニッチは数多くの選択圧を及ぼしますが、その一部はC. albicansの定着によって影響を受ける可能性があります。本プロトコルでは、抗生物質治療と単回投与の17β-estradiolを用いてC. albicansの定着を確立させ、その後、抗生物質を除去しGBSを接種する、C. albicansとGBSの同時膣内共定着モデルについて記述します。膣腔内の微生物量は、洗浄液を用いて実験期間中に定量し、FGT全体の微生物量は、膣、子宮頸管、および子宮を解剖し、ホモジナイズして平板塗抹することで定量します。この手法により、直接的および間接的な多種微生物相互作用がこれら2つの生物のライフスタイルや病原性、およびFGTにおける宿主の免疫学的状況に影響を与えるメカニズムの調査が可能になります。

概要

Streptococcus agalactiae（B群Streptococcus、GBS）は、胃腸管や腟管を含む複数の多微生物共存部位に定着するグラム陽性細菌のパソビオントである。腟管への定着は通常無症状であるが、妊娠中、GBSは腟管から子宮へ上行し、完全な膜を通過して、羊水や胎盤の感染を引き起こす可能性がある。したがって、本菌は不良妊娠転帰、胎児感染、および新生児疾患の主要なリスク要因となる1,2。新生児における侵襲性感染症の主要な原因であるため、伝播および感染のリスクに影響を与える因子を明らかにすることが極めて重要である。分娩時の抗菌薬予防投与は、垂直伝播および新生児における早期発症GBS疾患を減少させることができるが3,4、一方で、抗菌薬耐性率の上昇や、出生前または人生早期の抗菌薬投与に関連する潜在的な長期的影響が指摘されている5,6,7,8。これらの要因から、より標的を絞った予防的および治療的な介入策の開発が必要とされている。

マイクロバイオームの組成と多種細菌間の相互作用が、恒常性および疾患の発症確率に影響を与えることが近年の知見によって示されています9。ヒトの膣内マイクロバイオームにおけるGBSの優位性は、Lactobacillusの減少に関連しており、種および株特異的な相互作用が観察されており 、これらはin vitroおよびin vivoでの定着に多様な影響を及ぼします10,11。以前、我々の研究グループは、GBSの適応度に関する宿主および細菌の相関関係を研究するために、GBS膣定着マウスモデルを開発しました12。このモデルでは、マウスに17β-estradiolを単回投与し、翌日にGBSを膣内に接種します。このモデルを用いて、定着の維持および女性生殖器（FGT）組織への侵入におけるGBS表面タンパク質、制御シグナルネットワーク、および毒素分泌の重要性を明らかにしました。さらに、GBSは膣内においてAkkermansia muciniphilaやEnterococcus faecalisを含む他の細菌と複雑な相互作用を示すことが分かり13,14,15、GBSのライフスタイルと持続性が近接する微生物の存在によってどのように影響を受けるかが実証されました。

この既存のモデルは細菌間の相互作用を研究するために適応されてきましたが、他の微生物を研究するにはさらなる修正が必要でした。真菌は膣内マイクロバイオームにおいて研究が進んでいない構成要素であり、本手法で提示するモデルを用いて、真菌のコロナイゼーションおよび真菌と細菌の相互作用をin vivoで研究するためのツールを開発することを目的としました。ヒトの膣管から最も一般的に単離される真菌はCandida albicansであり、70%以上の個体にコロナイズしています16。C. albicansは多形態性であり、形態形成によって出芽酵母型とフィラメント型の間で切り替わることができます。フィラメント形成は、特異的な遺伝子発現レパートリーに関連しています17,18。これらの菌糸特異的な遺伝子の一部は、多種微生物のコロナイゼーションにおいて適応上の優位性をもたらすことが最近報告されています19,20,21。

ヒトの膣スワブにおいてC. albicansとGBSが共分離されたことがいくつかの研究で報告されており、我々の研究グループは最近、C. albicansに定植している個体ではGBSの保有率が有意に高いことを発見しました22。我々は、共生真菌、細菌、および宿主の三者間相互作用を研究するためのin vivoシステムを開発しました。従来のマウスを用いた真菌研究では、通常、細菌による定植抵抗性を克服し持続的な定植を確立するために抗生物質治療が必要です23。GBSの定植能力を妨げずにこれを達成するため、我々はマウスに抗生物質カクテルを投与し、C. albicansを接種し、定植が確立した後に抗生物質への曝露を停止して、その後GBSが定植できるようにしています。これにより、C. albicansとGBSの両方が同様の量および同様のタイムラインで膣管内に定植し、膣管内で直接的な相互作用が起こるように最適化されました。本プロトコルでは、抗生物質でマウスをプライミングし、17β-estradiolを投与し、真菌と細菌の両方の定植を確立させ、その後の解析のために洗浄液および組織サンプルを回収する方法について説明します。

プロトコル

本稿で提示する動物実験は、コロラド大学アンシュッツ校の機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認され、プロトコル#00316に従って実施されました。以下のタイムラインにおいて、0日目はS. agalactiaeを接種した日を指します。

1. 接種前に抗生物質を投与します。

  1. アンピシリン、ネオマイシン、およびゲンタマイシンをそれぞれ50 mg/mLの濃度でマウス用飲料水に溶解し、濃縮溶液を作成する。0.22 µmフィルターを用いて、この抗生物質溶液を滅菌させる。
  2. 水99 gに対して溶液1 mLを添加し、抗生物質溶液を1:100の希釈倍率でマウスの飲料水に加える。
  3. 7日後、ステップ1.1および1.2を繰り返し、水を交換する。
  4. 実験開始前に、少なくとも7～10日間は抗生物質を投与し続けるが、抗生物質による処置の合計期間が14日を超えないようにする。

2. マウスの発情周期を同期させる（-3日目）。

  1. マウス1匹あたり0.5 mgの17β-estradiolを、チューブ壁への懸濁液の付着分として少量の余剰分を加えて、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに入れる。コニカルチューブのキャップをしっかりと閉め、短時間ボルテックスして凝集物を分散させる。
    注意：17β-estradiolは皮膚または粘膜への接触を通じて体内に吸収される可能性があるため、本試薬は慎重に取り扱い、適切な個人用保護具を使用すること。
  2. 17β-estradiolを含むコニカルチューブに、17β-estradiol 0.5 mgあたり100 µLのゴマ油を0.45 µmフィルターを用いて直接滅菌しながら加える。濃度は5 mg/mLとなる。キャップをしっかりと閉め、溶液を十分にボルテックスして均質な懸濁液を作成する。
  3. 滅菌済みの1 mLシリンジ（マウス1匹につき1本）を準備する。プランジャーを0.15 mLの目盛りまで引き下げ、プランジャーが下を向き、ルアーロックチップが上を向くように固定しておく。
  4. 滅菌済みの18G 1.5”針を装着した新しい滅菌済み10 mLシリンジで17β-estradiol懸濁液を吸い上げ、これを用いて準備した1 mLシリンジに懸濁液を100 µLずつ充填する。
  5. 各1 mLシリンジに滅菌済みの26G 0.5”針を装着する。
  6. 0.5 mgの17β-estradiolを含む100 µLのゴマ油懸濁液を調製し、C. albicans接種の1日前に、マウス1匹につき1回分を腹腔内投与する。

3. マウスにC. albicansを接種する（-2日目）。

  1. 接種の1日前（17β-estradiol投与と同じ日）に、C. albicansをYeast Peptone Dextrose Brothで5 mLのオーバーナイト培養し、30 °Cのインキュベーターで250 rpmで振盪させる。
  2. 接種当日、オーバーナイト培養液の一部を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、ペレットが形成されるまで、または7–8 sの間、≤10,000 × gで遠心分離する。
  3. 上清を除去し、ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で再懸濁する。
  4. 血球計数器を使用して、懸濁液の濃度を算出する。
  5. 懸濁液の一部を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移して再度ペレット化し、新鮮な滅菌PBSで懸濁して、マウス1匹あたり少なくとも10 µLの最終容量で、最終濃度を109 C. albicans cells/mLにする。例えば、濃度が2 × 108 cells/mLでマウスが10匹の場合、500 µLをペレット化し、100 µLで再懸濁させる。
  6. 109 cells/mLのPBS懸濁 C. albicans 10 µL（107 cells/mouse）を各マウスの膣内に接種する。
    1. 非利き手の親指と人差し指で項皮を挟んで固定し、手首を回転させてマウスの背が手のひらに乗るようにして、各マウスを保定する。薬指と小指を使用して尾を固定する。
    2. 滅菌ピペットチップにC. albicans懸濁液10 µLを吸い取る。マウスの解剖学的構造に合わせて深さを調整し、チップを膣腔に約5–10 mm挿入する。
    3. C. albicans接種液を膣内に分注し、ピペットチップを抜く。
    4. 項皮を離した後、尾を持って後肢を上げる。C. albicans接種液が見えなくなるまで、または約1分間、マウスを前肢2本で歩かせる。

4. 飲料水を交換する（-1日目）。

  1. C. albicansを接種した1日後（これはS. agalactiaeを接種する前日にあたります）、マウスを清潔なケージに移します。
  2. マウスに抗生物質を含まない新鮮な水が提供されていることを確認します。

5. 膣腔内におけるC. albicans菌量の定量（-1日目）

  1. -1日目に、マウス1匹につき滅菌マイクロチューブ1本と滅菌PBS 100 µLを用意する。
  2. ステップ3.6.1に従って、各マウスを固定する。
  3. 滅菌ピペットチップに50 µLのPBSを吸い上げる。チップを腟腔内に約1–5 mm挿入し、PBS全量を3–5回ピペッティングする。PBSを滅菌マイクロチューブに分注する。
  4. ステップ5.3を繰り返し、洗浄液を計100 µL回収する。
  5. マイクロチューブをボルテックスし、滅菌PBSを用いて1:10,000希釈まで10倍段階希釈を行う。
  6. 希釈懸濁液10 µLおよび未希釈の洗浄液25 µLを、Candida選択性クロモジェニック寒天培地に塗布する。
  7. プレートを30 °Cで48時間培養する。C. albicansのコロニーは、表面が滑らかでティール色または緑色に呈色する。

6. マウスにS. agalactiaeを接種する（0日目）。

  1. 接種の1日前（飲料水の交換と同日）に、次の培養液を3 mL使用して一晩培養し、 S. agalactiae 静置条件下、37℃のTodd Hewitt Broth (THB) 中で °CO2インキュベーター
  2. 接種当日、オーバーナイト培養液を4 mLのTHBで1:10に希釈し、37℃で静置培養する。 °対数増殖期中期（600 nmにおける光学密度［OD］）に達するまで、C インキュベーターで培養します。600（0.4–0.5の間）に、約1.5–2時間で。
  3. 対数増殖期中期の培養液を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、3,000 rpmで遠心分離する。 × g 5分間、またはペレットが形成されるまで。
  4. 吸引により上清を除去し、その後、ペレットを300μLの溶液で懸濁させる。 µLの滅菌PBS。
  5. 再懸濁したペレットを用いて、少なくとも100個を調製してください。 µ〜のL（リットル） *S. agalactiae* マウス1匹あたりの懸濁液に加え、さらに500μL（または適切な単位） µODにおいて、滅菌PBS中のL600 0.4（約108 コロニー形成単位 [CFU]/mL（10匹のマウス分として合計1.5 mL以上）。
    注：一部の *S. agalactiae* 株によってOD値が異なる場合があります。600-CFU/mL比。どのODが600 10に相当します8 あらかじめCFU/mLを算出しておく。
  6. 懸濁液を新しい滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、3,000で遠心分離する。 × g 5分間、またはペレットが形成されるまで。
  7. 上清を吸引し、ペレットを1/10量で再懸濁する。th 滅菌PBSの初期容量の（例えば、懸濁液1.5 mLを遠心してペレット化した場合は、150μLで再懸濁する） µL)。この懸濁液の濃度は10になります。9 CFU/mLとし、細菌接種源として使用する。
  8. 50 $\mu\text{L}$を段階希釈し、プレートに塗布する µTodd Hewitt寒天培地に接種液を L 分注し、プレートを37℃で培養する。 °正確な接種濃度を決定するため、24時間、Cで保持する。
  9. 各マウスに10[単位/量]を膣内接種する。 µ〜のL *S. agalactiae* PBS中で10に懸濁して9 CFU/mL (10^7 ステップ3.6.1～3.6.4と同じ手法を用いて、（CFU/マウス）を算出する。

7. 膣腔内におけるC. albicansおよびS. agalactiaeの菌量を定量する（+1日目より開始）。

  1. S. agalactiae接種の1日後から、腟洗浄液を100 µL採取し、ステップ5.1～5.5と同じ手法を用いて段階希釈します。
  2. 希釈懸濁液10 µLおよび未希釈の洗浄液25 µLを、Candida選択およびStrepB選択のクロモジェニック寒天培地プレートの両方に重複して塗抹します。
  3. Candidaプレートを30 °Cで48時間培養します。C. albicansのコロニーは、滑らかでティール色または緑色に現れます。
  4. StrepBプレートを37 °Cで24時間培養します。S. agalactiaeのコロニーは、滑らかでピンク色またはモーブ色に現れます。
  5. 腟腔内の微生物負荷をモニタリングするため、ステップ7.1～7.4を毎日、または適切な時間間隔で繰り返します。

8. 女性生殖管組織におけるC. albicansおよびS. agalactiaeの負荷量を定量する（実験エンドポイント）。

  1. 組織（腟、子宮頸部、子宮）を回収するため、マウス1匹につき、約0.4–0.5 gの1 mmジルコニアビーズと500 µLの滅菌PBSを入れた2 mLスクリューキャップチューブを3本用意する。また、洗浄液を回収するため、マウス1匹につき滅菌マイクロ centrifugeチューブ1本と100 µLの滅菌PBSを用意する。組織重量を算出する際の参照用として、各スクリューキャップチューブの重量を記録しておく。
  2. CO2窒息法および頸椎脱臼など、施設で承認された方法を用いてマウスを安楽死させる。70%エタノールを用いて、ハサミとピンセットを滅菌する。
  3. マウスの後端を尾を持って持ち上げ、手順5.3–5.4の技術を用いて腟洗浄液を回収する。
  4. マウスの腹部に70%エタノールをスプレーし、滅菌したハサミを用いて腹腔を開く。ピンセットで皮膚を後方に引き上げ、胃腸管をずらして生殖管組織を露出させる。
  5. 滅菌したハサミを用いて、膀胱および子宮を覆っている内臓脂肪と膜を除去する。子宮体と各卵巣の間を切断し、子宮角を卵巣から分離させる。
  6. 滅菌したピンセットを用い、子宮頸部より下方の腟管を把持する。腟管全体が見えるまで持ち上げ、皮膚組織を避けて、外陰部にできるだけ近い位置で滅菌したハサミを用いて横方向に切断する。生殖管全体を取り出し、滅菌済みの10 cmペトリ皿に入れる。
  7. 滅菌したカミソリの刃を用いて、子宮頸部の上下を横方向に2箇所切断し、腟、子宮頸部、子宮を分離させる。各組織に対してさらに2–5回の矢状切断および横切断を行い、各組織を細切にする。それぞれの組織を、準備しておいた対応するスクリューキャップチューブに入れる。
  8. 各スクリューキャップチューブを量り、手順8.1の値を差し引いて各組織の重量を算出する。各チューブのキャップをしっかりと閉め、3,450 rpmで1分間ビーズビーティングを行い、チューブを氷上に1分間置いた後、再び3,450 rpmで1分間ビーズビーティングを行う。
  9. 手順5.5–5.6に記載する方法に従って、各組織ホモジネートおよび洗浄サンプルを段階希釈してプレートに播種する。手順7.3–7.4に記載の方法でプレートを培養する。

結果

GBSおよびC. albicansによる膣内定着を特性解析するため、マウスの膣内にC. albicans株SC5314またはPBSコントロールを接種し、続いてGBS株COH1を接種した。この株は、新生児の侵襲性疾患や髄膜炎に最も頻繁に関連する、高病原性莢膜セロタイプIII、シーケンスタイプ17の分離株を代表するものである1。接種から1日後にGBSが定着しなかったマウスは解析から除外した。4日間の実験期間において、GBSのみが定着したマウスでは、膣腔からGBSが徐々に排除される。一方、C. albicansとの共定着が認められたマウスの大部分では、高いGBS負荷量が維持される（Figure 1A,B）。また、C. albicansもマウスの膣腔に約4日間定着し、その後排除される（Figure 1C）。このモデルを用いた先行研究では、膣、子宮頸管、および子宮を含む女性生殖器（FGT）組織におけるGBS負荷量についても、単独定着動物と比較して共定着マウスでより高いことが示されている22。

GBS定着グラフ。統計的比較、生存曲線、CFU/mL対数スケールデータ解析。
図1. B群連鎖球菌（Group B Streptococcus）定着の定量化。CD-1マウスにC. albicans (SC5314)を定着させるか、対照としてリン酸緩衝生理食塩水で処理した後、GBS (COH1)を膣内接種した。(A) 膣洗浄液中のGBS菌量（中央値を表示）。(B) 膣洗浄液中のGBS検出により評価した、経時的なマウスの定着率。(C) 膣洗浄液中のC. albicans菌量（中央値を表示）。独立した3回の実験。1群あたりn = 26-27匹のマウス。Holm-Sidakの多重比較検定を用いた多重t検定(A)またはログランク検定(B)により、* p < 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001。略語：GBS = B群連鎖球菌（Group B Streptococcus）、Ca = Candida albicans、CFU = コロニー形成単位。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

GBSの膣内定着は、母体・胎児および新生児の健康に重大なリスクをもたらします。定着の決定要因を理解し、予防的治療法を開発するためには、In vivoモデルが不可欠です。本稿では、マウスの膣内にGBSとC. albicansを共定着させ、膣腔および女性生殖管（FGT）における微生物量を評価し、さらなるダウンストリーム解析のために関連組織を採取するマウスモデルについて記述します。このモデルは、多種微生物による膣内定着の背景における真菌・細菌間および宿主・微生物間の相互作用を研究するために開発されました。当研究グループは本モデルを用いて、C. albicansがGBSの膣内定着および上行性感染を促進するメカニズムの解明に取り組んできました22。

宿主と微生物の相互作用を理解するために、動物モデルが有効に活用されてきました。しかし、これらのモデルに多種微生物コミュニティを組み込むことは、いくつかの特有の課題を伴う可能性があります。本モデルの開発における主な目的は、真菌の定着を確立させ、それに十分な時間をかけ、 *C. albicans* 菌糸を形成させ、GBSを接種して、いずれの微生物も宿主に排除される前の定着動態をモニタリングした。多型性真菌として、 *C. albicans* 菌糸形態形成を開始させることで、宿主に関連する多くの環境シグナルに応答することができる17フィラメント形成 in vivo 本研究において優先されました モデル 菌糸特異的なGBSとの相互作用がFGTにおける共生を促進するという証拠が蓄積しているため、～を用いて *C. albicans* 発現株 NRG1 抑制可能なTetOプロモーターの制御下において、GBSは酵母形態固定株と比較して、菌糸形態固定株でより高い共凝集能および上皮細胞への高い付着能を示すことを、当研究グループは以前に報告している。 *C. albicans*22〜との共凝集 *C. albicans* およびヒト膣上皮細胞との結合は、この宿主環境におけるGBSの適応度の重要な決定要因である。その他の細菌 含む 黄色ブドウ球菌, Pseudomonas aeruginosa、および多様な ストレプトコッカス属 種 〜における形態形成関連遺伝子の発現を調節することが示されている C. albicans および、菌糸と優先的に相互作用する24将来的には、フィラメント形成がもたらす影響を検証することが課題である。 in vivo このモデルを用いて、菌糸形態または酵母形態に固定された菌をマウスに定着させることで対処できる。 *C. albicans* 菌株

C. albicansを膣内に接種する既存のマウスモデルは、主に外陰膣カンジダ症（VVC）25に焦点を当てており、有症状の感染に伴う超炎症状態の特性評価26に使用されてきました。本稿で述べる我々のモデルは、よりコロニー形成に近い状態を再現しています。我々の研究グループによる先行研究では、このモデルを用いて、C. albicansとの共コロニー形成は、GBS単独のコロニー形成と比較して、前炎症性サイトカインであるIL-6、CXCL1、CXCL2、およびTNFαの量を減少させ、共コロニー形成マウスにおけるこれらのタンパク質レベルは、未処置（naïve）の動物と同等であることが示されています22。これは、膣腔内で真菌の菌糸形成が起こっているにもかかわらず、VVCに特徴的な超炎症環境は観察されないことを示しています。アウトブレッドCD-1マウスは、真菌の増殖を免疫介在的に適切に制御できるためか、VVCに対して耐性を持つことが報告されています27。さらに、CD-1マウスは、膣内へのGBS接種時に強力な免疫シグナルを誘導し、C. albicansが存在しない場合には、約1週間以内に細菌数を制御するのに十分な応答を示します28,29,30, ただし、我々は以前に他のマウス系統におけるGBSの膣内コロニー形成についても調査しています12。本稿で述べるモデルは、ヒトで観察されるC. albicansおよびGBSの両方のコロニー形成の一過性の性質を反映しています。加えて、ヒトではpHおよびマイクロバイオーム組成の両方に大きな個体差があります。本モデルは、ほぼ中性のpH条件（~6.5）となっています31。CD-1の膣内マイクロバイオームは、EnterobacteriaceaeおよびProteus属が支配的であり13、これらはGBSと同じ膣内微生物コミュニティ状態タイプに関連しています9,32。

真菌接種前にマウスに抗生物質と17β-estradiolを単回投与することで、C. albicansが定着しやすい環境を整え、コロナイゼーションを促進します。さらに、estradiol投与によって発情期を同期させ、接種時の局所免疫環境を統一することで、実験間の再現性を高めています。我々は、C. albicansの接種時にマウスを前発情期に同期させており、この時期は好中球数が減少し、FGT内での真菌負荷が増加することが示されています33,34。実験の早い段階で抗生物質を取り除き、新鮮な飲用水に交換することで、GBSのコロナイゼーションを促進させるだけでなく、膣管内に常在菌を再定着させることができます。さらに、estradiol投与を初期の単回投与に限定することで、マウスが通常の発情周期のダイナミクスに戻ることを可能にしています。なお、estradiolの継続的な投与がコロナイゼーションを促進することは示されていますが12、マウスFGT内の免疫細胞組成は発情周期を通じて変動し、粘膜免疫応答は性ステロイドホルモンに対して高い反応性を示します35,36,37。したがって、我々はestradiolの反復投与という交絡変数を排除することで、微生物のコロナイゼーションが宿主環境に及ぼす影響を特異的に解析しています。

本研究で提示されたデータは、C. albicans株SC5314およびGBS株COH1に基づいています。SC5314をモデル構築に選定したのは、菌類学において頻繁に使用されており、この背景で利用可能な遺伝学的ツールが豊富であること、またin vitroおよびin vivoにおける生物学的特性と動態に関する知見が確立されているためです。また、当研究グループは、C. albicans株529Lが女性生殖道（FGT）におけるGBS負荷を促進することを明らかにしています22。GBS株COH1は、薬剤耐性および新生児侵襲性疾患に関連するセロタイプIIIシークエンスタイプ17系統の代表として使用されました1,2。このモデルでは、選択培地および分画培地を用いて、腟洗浄液および組織中のGBSとC. albicansの量を定量します。本モデルを他の細菌種や真菌種に適応させるには、適切な選択的増殖条件を最適化する必要があります。

真菌と細菌の相互作用は、微生物のライフスタイルを決定づける重要な媒介因子として注目されています38,39。いくつかの研究により、こうした相互作用が共生関係や病原性に大きな影響を与えることが示されています。さらに、宿主環境は特有の圧力を加え、代謝プログラミング、転写因子レギュロン、薬剤耐性プロファイルなどの要因に影響を及ぼす可能性があります。したがって、微生物同士がどのように相互作用するかを特性評価するには、代表的なin vivoモデルを用いることが不可欠です。本稿で述べるマウスモデルは、目的とする細菌および真菌による膣内定着が、微生物量、遺伝子発現、および宿主応答にどのような影響を与えるかを研究するために利用可能です。

開示事項

著者は報告すべき利益相反がないことを宣言します。

謝辞

コロラド大学アンシュッツの実験動物資源局の施設マネージャーおよび献身的な動物飼育スタッフに感謝いたします。本研究は、K.S.D.に対するNIH助成金R01AI153332およびR21AI188719によって支援されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 µmフィルターSigma-AldrichSLGSR33SB
0.45 µmフィルターSigma-AldrichSLHAR33SB
1 mLルアーロックシリンジMcKesson16-S1C
1.0 mm ジルコニアビーズResearch Products International9835
10 mLルアーロックシリンジMcKesson16-S10C
17βエストラジオールSigma-AldrichE8875注意：17βエストラジオールは皮膚および粘膜表面から吸収される可能性があります。適切な個人用保護具（PPE）を着用し、取り扱いには十分注意してください。
18G 1.5" 針BD305196
2 mLスクリューキャップチューブFisher Scientific02-681-374
26G 0.5" 針McKesson16-N2605
寒天Alpha BiosciencesA01-102
アンピシリンResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
ジェンタマイシンVWRライフサイエンス0304
ネオマイシンResearch Products InternationalN20040
リン酸緩衝生理食塩水Fisher ScientificBP2944
ごま油Sigma-AldrichS3547
トッド・ヒューイット・ブロスResearch Products InternationalT47500
酵母ペプトンデキストロースブロスBD242810

参考文献

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

再版と許可

タグ

B
動画は近日公開
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。