プロテアーゼの指向性進化のための最適化された酵母表面表示ワークフロー

サマリー

このプロトコルは、表面ディスプレイベースの選択システムを用いて 、サッカロマイセス・セレビシア エにおけるウイルスプロテアーゼの指向性進化に最適化されたワークフローを提供します。DNAインサートライブラリおよび基板カセット設計、高い形質効率に最適化された電気穿孔、蛍光活性化細胞選別によるプロテアーゼ切断の選択、そして濃縮変異体のシーケンスについて概説しています。

要約

指向進化は、高速で制御された実験室環境で自然な進化過程を模倣し、望ましい機能や形質を持つタンパク質を進化させます。大量の変異タンパク質コード遺伝子をスクリーニングすることで、バイオテクノロジー、医学、合成生物学への応用のために望ましい変異体の機能的選択が可能になります。このプロトコルを用いて、 サッカロマイセス・セレビジア エにおいて指向進化を行い、非在来基底配列に対して高い特異性を持つプロテアーゼ変異体を設計しました。これらのプロテアーゼ変異体を酵母細胞表面に表示し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を通じて複数回の濃縮を経て望ましい変異の選定を容易にします。基質カセットの4つの主要要素はプロテアーゼライブラリと共発現しています。すなわち、(i) 酵母接着受容体サブユニットAga2、(ii)選択基材配列および(iii) カウンターセレクション基底配列、(iv) エピトープタグ配列、そしてオプションの小胞体(ER)回収シグナル配列からなる融合タンパク質です。選択基質配列のみが切断された酵母細胞は、蛍光(フィコエリスリン/フルオレセイン・イソチオシアネート標識)抗エピトープ抗体を介して多色FACSを用いて単離します。ここでは、DNAインサートライブラリ設計および基質カセット設計、高効率な酵母細胞電気穿孔(1マイクログラムあたり最大10⁹ 個のトランスポレーション)、FACSベースの選択、濃縮、進化型変異体のシーケンスを含むプロテアーゼ進化キャンペーンを実施するための最適化された段階的プロトコルの詳細を提供します。私たちは、タバコエッチウイルス核包含物であるプロテアーゼA(TEVp)を、自然な基質配列ENLYFQ↓Sを切断し、新たな配列ENLYFE↓Sを切断する進化へと進化させることで、指向進化プロトコルを示します。

概要

ポティウイルス科のシステインプロテアーゼ、特に核包有物A(NIa)プロテアーゼは、配列特異的エンドペプチダーゼのほとんどが未開発の供給源となっています。3,800以上の特徴的なファミリーメンバーを持つNIaプロテアーゼは、7アミノ酸からなる異なる基質配列を切断します。ポティウイルスファミリーは、プログラム可能なタンパク質制御システムの設計、直交プロテアーゼベースの遺伝子回路の構築、配列特異的バイオ^{テクノロジーツールの開発}など、多様なプロテアーゼ群^{を提供します。}この自然な多様性にもかかわらず、NIaプロテアーゼのうちTEVpとタバコ静脈モタリングウイルスプロテアーゼ(TVMVp)のみが、広範な実験室およびバイオテクノロジー用途向けに徹底的に特徴づけられ、設計されています^3,4。この限定プロテアーゼツールキットは、直交プロテアー^{ゼ活性を必要とする}多成分回路の設計空間を制限し、指向進化を通じたNIaプロテアーゼのさらなる拡張と特性評価の取り組みを促します。^6,7。

酵母表面ディスプレイは、蛍光活性化細胞選別(FACS^)6,7による高スループットタンパク質ライブラリースクリーニングを可能にする、指向性進化の最も強力なプラットフォームの一つとして台頭しています。例えば、酵母内質網隔離スクリーニング(YESS)システムは、S. cerevisiae ^6,7の分泌経路を通じてプロテアーゼ活性と表面ディスプレイを結合させます。YESSシステムは新規のプロテアーゼ-基質特異性の設計に応用されており、複数ラウンドの指向進化キャンペーンでの有用性が示されています。この系では、プロテアーゼ変異体がエピトープマーカーを持つ切断基質カセットを含む融合タンパク質と共発現し、Aga1p表面アンカーはEBY100酵母株で発現されます。蛍光抗体による差別標識により、細胞表面に表示される切断された基質カセットと非切断された基質カセットを区別します。この活動依存の表示機構は、10、⁷、またはそれ以上のバリアント^6,7のライブラリに対する反復FACSベースの選択と直接互換性があります。

指向進化の基本的な前提条件は、対象配列空間を十分にカバーできるほどの規模で変異ライブラリを導入できることです。複数のアミノ酸位置にまたがる部位飽和変異誘発ライブラリでは、ライブラリに導入された多様性が選別された集団に十分に反映されるために、10 8から10^{9の異なる}トランスポンタントの形質転換量が必要です。S. cerevisiaeに外因性DNAを導入する方法はいくつかあり、それぞれ異なるスループット上限があります。従来の化学変換法は、その簡便さと入手の容易さから酢酸リチウム/一本鎖キャリアDNA/ポリエチレングリコール(LiAc/ssDNA/PEG)を使用します。しかし、通常は1マイクログラムあたり10⁴–^{10 6}コロニー形成単位(CFU)の形質変換効率を達成し、大規模ライブラリキャンペーンに必要な配列変異には達^{しません。}これに対し、電気穿孔法は高電圧電場を適用して細胞膜を一時的に透過し、DNAの取り込みを促進します。電気穿孔は利用可能な変換法の中で一貫して最高の形質転換効率を達成しており、最適化プロトコルでは10⁸–10⁹ CFU⁹の収率が報告されています。S. cerevisiaeにおける電気穿孔効率は細胞増殖相、DNA量、バッファー組成に極めて敏感であることが観察されており、その後ライブラリ規模の指向進化に広く適応された枠組み^{となっています。}

ここで説明するプロトコルは、酵母表面ディスプレイに広く採用されている宿主株である S. cerevisiae 株EBY100を使用しています。EBY100は、ボーダーとウィットラップによって、ガラクトース誘導性GAL1プロモーターの制御下にあるAGA1発現カセットをプロテアーゼ欠損親株BJ5465¹⁰の染色体AGA1遺伝子座に統合することで設計されました。この品種はATCCから市販されています(カタログ番号はMYA-4941;遺伝子型 MATa AGA1::GAL1-AGA1:URA3-52 trp1 leu2-δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−)その結果、Aga1pとAga2p基質カセット融合は同じガラクトース誘導プロモーターから発現され、両サブユニットが共誘導され、ジスルフィド結合したAga1p–Aga2p複合体として組み合わされ、表示された融合を細胞壁に固定します。

EBY100は酵母ディスプレイ用途で広く使われていますが、ライブラリー規模の収率でこの株を電気ポラー化するために体系的に最適化された公表プロトコルはありません。収穫時の最適な成長段階、サブカルチャー中の培地組成、600nm(OD₆₀₀)の初期光学密度と変換効率の定量的関係など、EBY100特有のパラメータは、厳密に特徴づけられ最適化されるべきです。本研究では、EBY100における形質転換効率が収穫時のOD₆₀₀ とともに単調に増加し、後期ログ相の細胞は初期ログ段階で収穫された細胞よりもはるかに高い形質転換率を生み出すことを報告しています。接種時の初期OD₆₀₀ 値、サブカルチャーにおける2×酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)培地の使用、電気穿孔バッファーの製剤、電気穿孔後の成長条件など、重要なプロトコルパラメータを評価しました。ここに示すプロトコルは、最適化された段階的なワークフロー(図1A–C、 図2、 図3A–D、 図4A–E)を提供し、電気能力を持つEBY100細胞を準備し、高効率なDNAライブラリの電気穿孔を行うことで、変換率を一貫して10⁹ を超えますCFU。このプロトコルの検証のために、FACSに基づく選択および濃縮の4ラウンドにわたり切断特異性を変えたTEVpを工学的に設計する包括的な指向進化キャンペーンを実施しました。濃縮プロテアーゼバリアントのシーケンスにより、プロテアーゼの基質結合ポケット内の標的残基で著しい多様化が確認され、プロトコルが配列空間のライブラリカバレッジを十分に提供し、生産的な進化キャンペーンを支持していることが示されました。このプロトコルは、EBY100を酵母表面ディスプレイに基づく指向進化やFACS互換の高スループットスクリーニングに用いる研究者にとって、プロテアーゼ、^抗体9、キナーゼ¹¹、受容体¹²などのタンパク質に広く有用となります。

プロトコル

組換え S. cerevisiae を含むすべての実験は、テキサス大学ダラス校の機関バイオセーフティおよび化学安全委員会の方針と手順に従って実施されました。組換え酵母株は、確立された機関の微生物学的慣行に従い、バイオセーフティレベル1(BSL-1)の封じ込めのもとで取り扱われました。電気穿孔、培養、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、承認された機関のバイオセーフティ手順に従って実施されました。酵母培養および汚染された消耗品は、機関のガイドラインに従い除染され、生物有害廃棄物として処分されました。

1. ベクターおよび挿入準備

1. 部位飽和変異原作用によるポチウイルスプロテアーゼライブラリーの生成
   1. 30から50メルの順方向および逆方向オリゴヌクレオチドを重ね合わせたシーケンス設計ソフトウェアを用いて、変異したプロテアーゼライブラリを生成する。対応するオリゴヌクレオチドの野生型コドンを、変異誘発部位のNNS 縮退性コドンに置き換えます。ここでNはA、T、G、C、SはGまたはCを表します。
   2. 各順方向および逆方向オリゴヌクレオチドペア間の3′重なりを、融点(Tm)を55〜60°Cに設定します。 最初と最後のオリゴヌクレオチドは、制限部位を超えて酵母表面表示ベクターと50 NTの重なりを持つように設計します。
   3. 挿入物の少なくとも一端が線形化されたベクトルの一端と正確に重なり、相同組換えを促進すること¹³。隣接するオリゴヌクレオチド間の隙間を避ける^{こと 14}.
   4. オリゴを脱イオン化H₂Oで100μMまで再懸濁します。滅菌1.5 mLのチューブで、各オリゴを0.5 μLを最終体積200 μL(各オリゴに対して最終濃度250 nM)に結合します。
   5. 表1に記載された成分を用いてPCR反応を設定し、表2の熱サイクル条件を用いてプロテアーゼライブラリーを組み立てます。
   6. 最初の組み立て済みPCR生成物をテンプレートとして、最外側の順方向および逆方向オリゴ(表3)を用いて2回目のPCR反応を設定します。 表4に示すように積を増幅します。
   7. 2番目のPCR産物を1%アガロースゲルと臭化エチウム(0.5 μg/mL)で240 Vで30分間投与します。期待されるDNA長に対応するバンドを切除します。
      注意:注意:エチジウム臭化物は変異原であり、実験用コート、ニトリル手袋、安全メガネなどの適切な個人用防護具(PPE)を使用して取り扱う必要があります。皮膚への接触や吸入は避けてください。臭化エチウムを含むゲル、バッファー、消耗品は、機関の安全ガイドラインに従い有害化学廃棄物として処分してください。
   8. ジェル抽出キットを使って精製してください。脱イオン化水素50μLに溶出します。
   9. 分光光度計を使ってDNA濃度を測定します。DNAは−20°Cで保存します。
      注:第^2次 PCRの50μL反応ごとに約0.5〜1.0μgのDNAが得られます。各電気穿孔にはプロテアーゼライブラリー12μg(インサート)が必要なため、反応数をそれに応じて拡大します。
2. 基板カセットアセンブリ
   1. LB寒天プレートとLB-クロランフェニコール液体培地を準備します。レシピは 表5の参照。
   2. 基板カセットの組み立てのために、前後方向に重なり合う30マーオリゴヌクレオチドのセットを設計します。各逆オリゴヌクレオチドの5′端と次の断片の前方オリゴヌクレオチドを4ヌクレオチドの一致させる設計を行います。
   3. 去イオン化_H2Oを用いて凍虫乾燥オリゴを100μMまで再懸濁します。
   4. 表6のように試薬を混ぜます。
   5. 表7のサイクリングプログラムを使って、オリゴ混合物をアニールしリン酸化します。
   6. 希薄化されたオリゴを脱イオン化H₂Oで4倍アニーリングし、最終濃度1.25 μMに到達します。
   7. アニールされたオリゴ混合物をベクター(例:pDD1523)と組み合わせ、 表8に従います。
   8. 表9のサイクリングプログラムに従い、ゴールデンゲート組立を行います。
      注:例えば、pDD1523プラスミドはGAL1/10プロモーターの下流にタイプIIS制限部位(BsmBI)を持っています。組み立てが成功すると、基質カセット⁷のガラクトース誘導が可能になります。
   9. できたプラスミドを 大腸菌に変換します。
   10. LB寒天上の細胞をプレートにし、対応する抗生物質を投与します。37°Cで16〜18時間培養します。
   11. 分離したコロニーを選び、5mLのLB培地で接種します。37°Cで16〜18時間、振動(220rpm)で孵化させます。
   12. プラスミドのミニプレップキットを使って、一晩培養からプラスミドを抽出します。
   13. 分光光度計でプラスミド濃度を測定し、その後シーケンスに送ります。
3. 酵母表示ベクターの線形化
   1. 酵母ディスプレイプラスミドを線形化し、例えばpDD1524をSphIおよびPstI制限酵素で消化し、基質カセットを含む酵母ディスプレイベクターを電気穿孔用に準備します。 表10 に記載された試薬を混ぜ、37°Cで1時間培養します。
   2. 制限性消化生成物を1%アガロースゲルに240Vで30分間投与します。期待されるDNA長に対応するバンドを切除し、ゲル抽出キットで精製します。
      注:制限性消化1回あたり約0.5〜1.0μgの総DNAが得られます。各電気孔径には4μgの線形化ベクターが必要なため、消化反応のスケールをそれに応じて拡大します。

2. 電気穿孔

注意:生物材料や試薬の取り扱いに関しては、機関の安全手順を遵守し、適切なPPEを着用し、生物・化学廃棄物は機関のガイドラインに従って処分してください。

1. バッファー、プレート、培地の準備(電気穿孔の2日前)
   1. 成長培地を準備(1× YPD;2 × YPD;合成デキストロースカサミノ酸(SDCAA+);および合成ガラクトースカサミノ酸(SGCAA+)、プレート(YPDおよびSDCAA)、電気穿孔バッファー、そして 表5のレシピに従う滅菌水。保存温度は4°Cです。
2. EBY100のストリークプレートの準備。
   1. グリセロールストックからYPD寒天にEBY100酵母をストリークアウトします。30°Cで2日間育てます。
   2. 培養後は4°Cで保存します。
      注:ストリークプレートは最大1か月間使用可能です。プレートに連続記録日をマークしてください。
3. EBY100の前培養準備(電気穿孔1日前)
   1. 125mLの1×YPDを500mLのエルレンマイヤーフラスコに準備します。
   2. 1×YPDを25mLを50mLの円錐形チューブに準備します。マイクロピペットの先端を使って、2日間培養したEBY100細胞をプレートから採取します。次に、ピペットの先端から1× YPDを含む円錐形の管に酵母細胞を移します。
      注意:細胞の筋は約1〜2mmの長さのスミア状になります。
   3. マイクロピペットの先端を外し、円錐形のチューブをボルテックスで混ぜて十分な混合を確保してください。
   4. 酵母細胞を含む1×YPDの25mLを500mLフラスコに移し、150mLの前培養液を125mLの酵母細胞を含む1×YPDを準備します。混ぜるために渦巻きを流します。
   5. 分光光度計を用いて、1cmの経路長を持つ2つのマイクロキューベットを準備してOD₆₀₀ を測定します。1つは1× YPDの1mLをブランクコントロール、もう1つは1mLのプレカルチャーを含んでいます
   6. 150mLのプレカルチャーを30°Cで16〜20時間、270rpmの軌道振動で培養します。
4. 希望の初期_OD600 (電気穿孔当日)でのサブカルチャーの準備
   1. 表5に記載された条件バッファーと成長培地を準備 します。
   2. 夜間の前培養の_OD600 を測定します(予想OD₆₀₀は17–22)。分光光度計の直線範囲内に収まるには、前培養の希釈を1:20で測定します。
   3. 100mLサブカルチャーを接種するのに必要な前培養量を計算します。初期サブカルチャーOD₆₀₀は3.0〜4.0が推奨されます。
   4. 培養液を100mLの2×YPDの500mLのエルレンマイヤーフラスコで希望の初期_OD600 まで希釈します。
   5. 100 mLサブカルチャーを30°Cでインキュベートし、軌道振動を270 rpmで4時間行います。
5. 4時間の培養期間中の培地準備
   1. 氷のように冷たい電気穿孔緩衝材と滅菌水を準備しておきましょう(ステップ2.1.1より)。
   2. 表 5のレシピに従って、100mLの調整バッファーを準備します。1回の形質変換につき20mLの調整バッファーを使用します。それに応じてスケールアップしましょう。室温(20〜23°C)で保存してください。
      注意:注意:コンディショニングバッファーにはジチオスレイトール(DTT)と酢酸リチウム(LiAc)が含まれており、これらは皮膚や目の刺激を引き起こす化学的刺激物です。実験用コート、ニトリル手袋、安全メガネなどの適切なPPEを着用し、これらの試薬は機関の化学物質安全手順に従って取り扱ってください。未使用の溶液や使用済みバッファーは、機関のガイドラインに従って化学廃棄物として処分すること。
   3. 培養培地(50 mL)を準備します:2 × YPD 25 mLと 1 M ソルビトール 25 mLを混ぜます。1回の形換えごとに8mLの成長培地を使用。室温(20〜23°C)で保存してください。
6. 4時間の培養後の電気能力を持つ酵母細胞の製製。
   1. 100 mLのサブカルチャーを2つの50 mL円錐形チューブに分割します。4°C、1,500 × g で遠心分離して3分間細胞を採取し、その後培地をデカントします。ステップ2.6.4が完了するまでセルを凍結状態にしてください。
   2. 各細胞ペレットを氷のように冷たい滅菌水25mLで優しく再懸浮させます。4°C、1,500 × g で3分間遠心分離し、その後培地をデカントします。
   3. ステップ2.6.2を繰り返します。
   4. 各細胞ペレットを25mLの氷で冷やす電気孔育成バッファーで優しく再懸濁します。4°Cで1,500 g ×遠心分離機を3分間加熱し、その後培地をデカントします。
   5. 細胞を氷から取り出し、10mLの室温(20–23°C)調整バッファーで優しく再懸濁します。その後、125mLのエルレンマイヤーフラスコ1個にプールし、30°Cで270rpmの軌道振動を30分間インキュベートします。
   6. 細胞を50mLのチューブに注ぎます。遠心分離機で4°C、1,500 g × 3分間加熱します。メディアを移してください。
   7. 50mLの氷で冷たい電気穿孔バッファーで細胞ペレットを優しく再懸浮させます。4°Cで1,500 g × gで3分間遠心分離し、その後培地をデカントします。
   8. 約100〜200μLの電気穿孔バッファーを加えて、細胞ペレットを最終体積1mLに再懸浮させます。電気穿孔まで細胞を氷の上に置いてください。
      注意:電気適性セルは凍結(すなわち–80°Cの冷凍庫に入れる)ことができ、後から使用しても電気孔の効率を大きく損なうことはありません。
7. 電気穿孔、突起、メッキ
   1. 氷上で0.2cmの隙間を設けたプレチルの電気穿孔キュベット。
   2. 再懸濁ペレット380μLを無菌の1.5 mLチューブに移します。プラスミドDNA4μg、または線形化プラスミドベクター4μg、挿入12μgと混合します。ピペッティングで優しく混ぜます。
      注:電気孔細胞の数を最大化するために、ベクターおよび挿入DNA濃度は理想的には700〜800 ng/μLであるべきです。濃度がそれより低い場合は、真空濃縮器を使いましょう。
   3. 懸濁液を事前に冷却されたエレクトロポレーションキューベットに移します。5分間氷で冷やしておいてください。
   4. 5分後に糸くずのないラボラトリーワイプでキュベットの側面を拭き、電気穿孔中にアークが起きる可能性のある残留水分を取り除くと良いです。キューベットの金属板の上に気泡やセルは避けてください。これらはアークの原因になる可能性があります。キューベットの冷たい温度を維持するために、プレート電極には触れないでください。
   5. 50mLの円錐形チューブに8mLの成長培地を準備します。
   6. セルを以下の設定で電気孔化します:電圧2.5 kV、静電容量25 μF、抵抗200 Ω⁹。許容される時間定数範囲は2.8〜4.5 msです。
      注意:注意:電気穿孔は高電圧の電気パルスを含みます。キュベットが正しく装着され、メーカーの操作指示に従ってください。使用済みの電気穿孔キュベットは、機関のガイドラインに従って生物有害廃棄物として処分してください。
   7. すぐに円錐形チューブから約200μLの成長培地をクヴェットに注ぎ、電気孔出した細胞を50mLの円錐形チューブに移します。さらに200〜350μLの増殖培地を加え、キューベット内に液体が見えなくなるまで加えます。
   8. 50 mLの円錐形の電気孔細胞チューブを、8 mLの成長培地に30°Cで振動せずに1時間培養します。15分ごとにチューブを逆さにして混ぜます。
   9. 細胞を1,500 × g、25°Cで遠心分離し、3分間採取します。その後、メディアをデカントします。
   10. 細胞を適切な酵母ドロップアウト培地に再懸浮させ、形転細胞の選択を維持します。TRP1選択マーカーを含むプラスミドの場合、トリプトファンを含まない250mLのSDCAA+に細胞を再懸濁させ、プラスミドを保持した酵母を選択的に回収します。
   11. 30°Cで16〜20時間の夜間インキュベーションを行い、270rpmで軌道振動を行います。

3. 酵母細胞の誘導、染色、フローサイトメトリー選別

1. プロテアーゼライブラリーと基質カセットの誘導(選別1日前)
   1. ドロップアウト培地中の変質物の一晩の成長後、ステップ2.4.2のOD₆₀₀ を測定します。
   2. 酵母変質物質12mLをアリコートし、遠心分離機で3,200 × g で5分間加熱します。
   3. 上清液を除去し、細胞ペレットをSGCAA+誘導培地に再懸濁し、OD₆₀₀ 0.5にします。希釈式を用いて必要な懸濁容積を計算します。C₁V₁ = C₂V₂。
   4. 125 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、30°Cで18〜24時間、270 rpmで軌道振動を起こして一晩培養します。
2. 蛍光抗体染色(仕分け当日)
   1. 誘導後の細胞の_OD600 を測定してください。2種類のキュベットを使いましょう:1つはSGCAA+を1mL、もう1つは950μLのSGCAA+と50μLの細胞を混ぜたものです。測定されたOD₆₀₀ 値を20掛ければ、誘導後細胞の真のOD₆₀₀ が得られます。
   2. 抗体染色とFACS選別のために、各サンプルを3×10〜⁷ 細胞に正規化します。C₁V₁ = C₂V₂ を使って、誘導フラスコから移すセルの体積を計算します。
      注:4部位NNS飽和変異誘発の場合、理論ライブラリのサイズは10⁶ の変異です。ライブラリを十分にサンプリングするには、ライブラリサイズの少なくとも10倍、つまり10個^の7 セルをスクリーニングしてください。例:もしC₁V₁ = 3 × 10⁷ 細胞、C₂ = 誘導後OD₆₀₀/6(すなわち6 × 10⁷ cells/mL)を望む場合、誘導細胞500 μL(すなわち V₂ = 3 × 10⁷ 細胞 / 6 × 10⁷ cells/mL = 500 μL)を割り当てます。
   3. 計算された細胞体積を1.5 mLのチューブに移し、遠心分離機で5,000 × g で5分間投与しました。
   4. 上清液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+0.5%牛血清アルブミン(BSA)500μLに再懸濁します。
   5. 5,000 g ×遠心分離機で5分間行い、ステップ3.2.4を繰り返します。
   6. 5,000 g で遠心分離機を5分間行×その間にステップ3.2.7を完了してください。
   7. 抗HAフルオレセインイソチオシアネート(FITC)(0.5 μg/10⁷ 細胞)、抗FLAGフィコエリスリン(PE)(0.05 μg/10⁷ 細胞)、およびPBS + 0.5% BSA(100 μL/10⁷ 細胞)を含む抗体染色混合物を1.5 mLチューブに準備します。チューブは氷の上に置いておけ。
   8. 上澄液を取り除き、染色液で再懸濁します。染色液を3×10セル10個につき300μL使用してください。チューブを渦巻かないでください。インバートかフリックだけ。
   9. 再懸濁後、細胞を暗闇で1時間氷上に置いてください。
3. ステイン後のウォッシュ
   1. 遠心分離機で5,000 × g で細胞を5分間染色します。上清液を除去し、0.5% BSAを含むPBSに再懸濁します。10×⁷ 細胞あたり0.5 mL(例:10 ×⁷ 細胞に対して500 μL、3×10⁷ 細胞に対して1.5 mL)。
   2. 遠心分離機で5,000 g×5分。上清液を除去し、PBS750μL+0.5%BSAに再懸濁します。
   3. さらに750μLのPBS+0.5%BSAを10mLの採集管に移します。
4. FACS(連邦交通管制システム)
   1. 新しい実験のために必要なサイトメーターの起動と準備を行います。
   2. 3つのドットプロットを作成します。最初のドットプロットでは、X軸名を選択して前方散乱領域(FSC-A)チャネルを、Y軸名を選択して側面散乱領域(SSC-A)チャネルを表示します。
      注:これにより生細胞の選定が容易になります。
   3. X軸名はFSC-Aチャネルを表示するために保持し、Y軸チャネルは2番目のドットプロットで前方散乱高(FSC-H)を表示するように変更します。
      注:これによりシンクレットの選定が容易になります。
   4. 3番目のドットプロットでPEチャネルを表示するにはX軸名を選択し、FITCチャネルを表示するにはY軸名を選択してください。
   5. サイトメーターで530/30nm(FITC)および585/42nm(PE)チャネルを使ってネガティブコントロールを実行します。70μmノズル  70psiのシース圧力で選別を行います。4000〜5000イベント/秒の速度でサンプルを取得。
   6. 最初のドットプロット(FSC-A対SSC-A)で、FSC-AおよびSSC-A信号が低い破片や小さな粒子を除外するため、主要な無傷酵母細胞群の周囲にポリゴンゲートを描きます。
   7. このゲート内のFSC-H対FSC-Aプロット上のゲートシングレットは、FSC-HとFSC-Aの比率関係を示す線形母集団を選択することで分類されます。線形分布から逸脱し、二重線やセル集約に対応する事象は除外します。
      注:PEとFITCの3番目のドットプロットでは、陰性対照群(すなわち、完全な基質カセットを発現する酵母細胞)の点の斜めのクラスターを示します。
   8. サンプルを採取し、PE/FITC値に基づいて酵母細胞を選別します。理論ライブラリサイズの少なくとも10倍に対応するセル数を分析し、すべてのバリアントを適切に表現できるようにします(例:理論的多様性が~1 ×^{10 6}バリアントのライブラリに対して、10⁷セル× ~1を解析します)。
   9. ソートゲートをネガティブコントロール集団のPE/FITC対角線の下に位置させます。
      注:より厳格なゲートは望ましい変異の濃縮を改善するが、細胞の回復を減少させる。
5. FACS後
   1. 遠心分離機の集水管を3,200 g で5分間×上澄液を慎重に取り除き、1 mLを残し、PBSを5 mLに再懸浮させます。
      注意:遠心分離後は細胞ペレットが見えなくなるため、上清液は1mL残してください。
   2. 遠心分離機セルは再び3,200 g ×5分間使用しました。上澄液を取り除き、1mLを残します。SDCAA+4 mLで再懸浮します。
   3. 250 mLのエルレンマイヤーフラスコに15 mLのSDCAA+を加えます。ステップ3.5.2の再懸濁細胞をこのフラスコに移します。
   4. 30°Cで18〜24時間、270rpmで軌道振動を起こして一晩培養します。
   5. 各ラウンドの指示的進化について、ステップ3.1、3.2、3.3、3.4を繰り返します。

4. 個々のクローンのプラスミド回収およびシーケンス

1. 個々の群れを育てる
   1. ステップ3.5.4後に液体培養液500μLと滅菌50%グリセロール500μLを混ぜてグリセロールストックを作り、25%グリセロールストック溶液を作ります。渦を起こして細胞を徹底的に混ざらせます。
   2. -80°Cの冷凍庫で一晩保存します。長期保存の場合は液体窒素に移してください。
   3. グリセロールストックを無菌の1000μLチップで削り取り、100μLのSDCAA+に混ぜます。この混合物をSDCAAプレートにプレートし、30°Cで逆さまに培養します。
   4. 3日後にコロニーを摘み、14mLのチューブに1.5mLのSDCAA+を植えて一晩培養します。
2. 酵母ミニプレップを行いプラスミドを抽出します
   1. 16,000 × g で遠心分離して1分間ペレットし、酵母プラスミド精製キットから200μLの溶液1に再懸濁します。
   2. 溶解酵素溶液5μL(5 U/μL)を加えます。
   3. 37°Cのインキュベーターで4時間、エンドツーエンドのミキサーで孵化させます。
   4. 凍結解凍サイクルを行い、-80°Cで20分間冷凍し、42°Cで10分間水浴で解凍します。
   5. 酵母プラスミド精製キットから溶液2200μLを加え、2〜3回逆さまに混ぜて5分間置きます。
   6. 酵母プラスミド精製キットから溶液3を400μL加え、2〜3回反逆して混合します。遠心分離機で16,000 × gで5分間。
   7. 高DNA結合能力を持つ精製キットを用いてプラスミドDNAを精製します。
      注:溶解細胞から大量のせん断ゲノム酵母DNAが存在するため、低容量の酵母プラスミドDNA精製カラム(5μg)ではなく、DNA結合能力の高いシリカ系カラム(35μg)を使用する必要があります¹⁵。
   8. 分光光度計を使ってDNA濃度を測定します。DNAの収率は10〜30 ng/μLです。
3. 精製されたプラスミドを化学的に適格な大 腸菌 細胞に変換します
   1. 表5のレシピに従ってSOC培地とLB-クロルランプニコールプレートを準備します。また、水浴を42°Cまで予熱してください。
   2. 各プラスミドに対してLB-クロランフェニコールプレートを37°Cで20分間温めます。
   3. -80°Cの冷凍庫から化学的に適切な細胞のチューブを取り出し、氷の上で解凍します。
   4. 各プラスミドに対して30μLの適合細胞を氷上の1.5mLチューブにアリコートします。
   5. 3μLのプラスミドを正常な細胞にピペットで取り込む。混ぜるために軽く開いて、氷の上で5分間置きます。
   6. 熱ショックを行うために、細胞を42°Cの水浴で短時間40秒間培養します。
   7. 氷で2分間孵化します。
   8. 細胞に300μLのSOC培地を加え、37°C、220rpmで15分間インキュベークします。
   9. 50〜100μLの形質転換可能な細胞を予温プレートにプレートします。
   10. プレートを37°Cで逆さまに18時間孵化します。
4. コロニー採取
   1. 液体LB-クロランフェニコール培地5 mLを14 mLの丸底培養管に加えます。
   2. 無菌の1000μLチップでコロニーを選び、培養チューブに入れます。
   3. チューブをシェーカー(220rpm、エアレーション最大化のため30°–45°角度)に37°Cで18時間置きます。
5. 細菌液培養からのプラスミド抽出
   1. 液体培養液を3,200 × g で4分間遠心分離します。上清液をデカントします。
   2. プラスミド精製キットを使って一晩培養からプラスミドを抽出します。
   3. 分光光度計を使って精製されたプラスミドの濃度を測定します。
6. シーケンシングのためにプラスミドを提出してください
   注意:全プラスミドナノポアシーケンシングや、変異原領域の両側にプライマーを置いたサンガーシーケンシングなどのサービスをご利用ください。

結果

効率的なライブラリ構築は、突然変異空間の十分なカバレッジを確保するために不可欠です。希少な機能変異の喪失を避けるために、トランスポルタントの数は理論ライブラリサイズの少なくとも10×0から100に達するべきです× S. cerevisiae における形質転換効率は細胞濃度の影響を受け、初期から中期のログ^{相細胞で最も}高いため、電気穿孔前の初期細胞密度を最適化しました。酵母培養は初期のOD₆₀₀ 値(1.0–4.0の範囲)でサブ培養され、4時間(n = 2–4の独立した生物学的実験)インキュベートされました。その後、最終的なOD₆₀₀ 値は S. cerevisiae の成長曲線にマッピングされ、細胞が中間ログ成長段階に残っていることを確認します(図5A、 補足図1)。

これらの培養を4 μgプラスミドDNAでエレクトロポレーションした結果(n = 2件の独立した生物学的実験)、初期OD₆₀₀ 条件下で形質転換効率が有意に異なることが示されました(一方変量分析( ANOVA、p = 8.92 × 10⁻⁷)。OD₆₀₀ = 1.0で開始された培養と比べて、すべての初期細胞密度が高いほど、形質転換効率が有意に向上しました(ダネットの多重比較テスト;OD₆₀₀ = 1.5、調整後 p = 0.0020;OD₆₀₀ ≥ 2.0、 調整p < 0.0001)で、初期OD₆₀₀ で4.0の変換効率が観測されました。酵母細胞が持つ相同組換え能力を活かすため、線形化プラスミドベクター4 μgと挿入(プロテアーゼライブラリー)12 μgを酵母細胞に電気放孔しました(n=2件の独立した生物学的実験)。変換効率は、初期OD₆₀₀ 条件下で有意に異なっていました(一方移動ANOVA、 p = 0.0023)。OD₆₀₀ = 1.0で開始された培養と比べて、OD₆₀₀ = 3.0( 調整p = 0.0018)、3.5( 調整p = 0.0062)、4.0( 調整p = 0.0024)(ダネットの多重比較検定)で形質変換効率が有意に高かった。我々は、適度な初期サブカルチャー密度(OD₆₀₀ = 3.0)で最も高い形質転換効率を観測し、これらの条件下で細胞能力と組換え効率の最適なバランスを示しました(図5B)。プラスミド単独形質転換と比較して、線形化されたベクターおよびプロテアーゼライブラリーの挿入物(n=2個の独立した生物学的複製)を共エレクトロポレーションした場合、初期_OD600 条件下で有意に高い形質転換効率が得られました(log10形質転換効率の双方向ANOVA でp =9.40×10⁻¹²).平均的に、共エレクトロポレーションはプラスミド単独形質化に比べて平均121倍の形質転換効率向上(95%CI、63–233倍)をもたらしました(図5B)。

変異プロテアーゼライブラリーと基質選択カセットを含む酵母細胞のFACSラン(図6A)では、細胞は切断されたカセットか、カウンターセレクション基質を切断したプロテアーゼ(Q1)、機能性のないプロテアーゼ変異体を発現する(Q2)、または選択基質のみを切断することに成功するプロテアーゼ変異体(Q3)を示します。非機能性変異を発現する酵母細胞は、PEプロットとFITCプロットで対角線に沿って分布する優性集団として現れ、両シグナルの共保持を反映しています(図6A、Q2)。対照的に、選択基質を切断し、ネイティブ(カウンターセレクション)基質を残した機能的変異体は、高PEおよび中〜低FITC信号強度を特徴とする独自の対角外集団を形成しました(図6A、Q3)。この対角線外集団を厳格なゲート戦略で分離した結果、¹⁰の選別の連続ラウンドで機能的変異が徐々に豊かになっていきました。この濃縮は、斜めの細胞群から分離されていく、ますます明確な細胞群として視覚的に観察されます(図6B、左から右へ)。もし明確な対角線外集団が観察されない場合、それはライブラリの質が低い、発現が不十分、または染色条件が最適でないことを示しています。陰性対照として、図6C,Dは電気ポ孔化した誘導された染色されていない酵母細胞と対応するFITCおよびPE蛍光ヒストグラムを示しています。

富集化された対角外集団内で、FITC強度に基づいてサブ集団をさらに解析できます。中FITC信号を示すセルは、低いFITC信号を持つセルとは別にソートできます。これらの異なる集団の配列解析により、独自の変異プロファイルが明らかになりました(表11参照)。これは異なるプロテアーゼ変異体に切断効率の違いが関連していることを示しています。

図1:ベクターおよびインサートの準備。 (A) 部位飽和変異原誘発によるポチウイルスプロテアーゼライブラリーの生成。(B) 基質カセットの組み立ておよび酵母ディスプレイベクター(pDD1523)への統合。(C) 酵母ディスプレイベクター(pDD1524)の制限分解による線形化。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:基板カセットとPCR増幅された変異プロテアーゼライブラリーを正常なEBY100細胞にエレクトロポレーション化。 (破線のボックス)プロテアーゼと基質カセットの両方を含むプラスミドのin vivo円形化。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:酵母細胞の誘導、染色、フローサイトメトリーの選別。 (A) プロテアーゼライブラリおよび基質カセットの誘導。(B) 蛍光抗体染色:抗HAフルオレセインイソチオシアネート(FITC)および抗FLAGフィコエリスリン(PE)抗体による染色。(C) 染色された細胞は蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて選別されます。(D) 選択培地中のFACS選別細胞の回収。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:選別された酵母細胞のプラスミド回収と配列決定。 (A) 選別された酵母細胞のプレート。(B) 個々の酵母コロニーからのプラスミド抽出。(C) 抽出されたプラスミドの大腸菌形質転換。(D) 個々の大腸菌コロニーからのプラスミド抽出。(E) 抽出されたプラスミドのナノ孔シーケンシング。Flaskおよびチューブアイコンは、それぞれDBCLSおよびHelicase 11からBioicons(https://bioicons.com)経由で適応され、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンス(CC BY 4.0)の条件の下で適応されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:異なる培養培地における酵母成長曲線と、サブカルチャー600nm(OD₆₀₀)における初期光学密度が酵母の電気孔化効率に与える影響。 (A) 1 ×酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)、2 × YPD、抗生物質なし合成デキストロースカサミノ酸寒天(SDCAA-)、および抗生物質付き合成デキストロースカサミノ酸寒天(SDCAA+)における酵母の成長曲線。(B)4μgプラスミドベクターで電解した酵母の初期_OD600における形質転換効率、および線形化ベクター(4μg)およびプロテアーゼライブラリー挿入物(12μg)を用いた形質転換効率は、同じ初期_OD600 値でのもの。(A)のデータは、2つの独立した生物学的実験からのOD₆₀₀ ±SD(n=2)として提示されています。(B)のデータは、対数y軸上で1回の電解孔あたりの平均変換体数として示され、個々の生物学的複製は円(n = 2)で示されています。プラスミドおよびベクタープラスインサートによる電気穿孔最適化実験の統計的有意性は、log10変換エレクトロポーション効率に対する一方向ANOVAを用いて決定され、その後OD₆₀₀ = 1.0を対照としてダネットの多重比較検定を行った。ns(有意でない); p < 0.01 (**); p < 0.0001 (****)。プラスミド単独とベクタープラス挿入変換効率の差の統計的有意性は、log10変換された形質化効率に対する二方向ANOVAを用いて決定しました。 p < 0.0001 (****)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:酵母クローンの 蛍光活性化細胞選別 (FACS)による濃縮。 (A) ゲーティング戦略の図式表現。細胞は3つの領域に分けられました:Q1、フィコエリスリン(PE)低細胞、Q2、PE高/フルオレセインイソチオシアネート(FITC)高細胞;Q3はPE高細胞で、FITC蛍光は低〜中間です。Q3内の細胞を濃集のために採取しました。(B) 独立した進化キャンペーンの代表的なFACSプロットで、FITCゲート厳格性が増加する連続ラウンドのソートを示す。中FITCおよび低FITC細胞を別々に収集し、シーケンスを行った。パーセンテージは、ゲート集団内の生きた単一酵母細胞の割合を示します。(C) ネガティブコントロールとして電気穿孔された未染色酵母細胞を示す代表的なFACSプロット。 (D) FITC-A(左)およびPE-A(右)の蛍光強度のヒストグラム(C)に示されたデータに対応する。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:プロテアーゼライブラリーの1回目のPCR増幅反応混合物。 プロテアーゼライブラリーの第一回増幅に用いられたPCR反応の組成、50μL反応中の各試薬の最終濃度と量を含みます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:プロテアーゼライブラリーの第1ラウンドPCR増幅のサイクル条件。 この熱サイクルプログラムは、プロテアーゼライブラリーの初回PCR増幅に用いられました。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3:プロテアーゼライブラリーの2回目のPCR増幅反応混合物。 プロテアーゼライブラリーの第2回増幅に用いられたPCR反応の組成、50μL反応中の各試薬の最終濃度および量を含む。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表4:プロテアーゼライブラリーの2回目のPCR増幅のサイクル条件。 この熱サイクルプログラムは、プロテアーゼライブラリーの2回目のPCR増幅に用いられました。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表5:酵母の電気穿孔および成長のための培地および試薬。 各化学成分から、酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)、×および2×酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)、電気孔育バッファー、調整バッファー、成長培地、抗生物質付き合成デキストロースカサミノ酸(SDCAA+)、抗生物質付き合成ガラクトースカサミノ酸(SGCAA+)、溶原ブロス(LB)培地、LB-クロランフェニコール培地、スーパー最適ブロス(SOB)培地、およびカタボライト抑制付きスーパーオプティカルブロス(SOC)培地を製剤化するのに必要な質量の表状の記述。2Mソルビトール、1Mジチオスレイトール(DTT)、2Mリチウム酢酸(LiAc)などのストック溶液の調製手順も含まれています。SDCAA、LB、YPD寒天プレートの調製に関する追加の手順も提供されています。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表6:オリゴのアニーリングおよびリン酸化のための反応混合物。 基質カセット組立のためのオリゴヌクレオチドの同時アニーリングおよびリン酸化に用いられる反応混合物の組成。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表7:オリゴのアニーリングおよびリン酸化のサイクル条件。 基質カセット組立のためのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびリン酸化に使用される温度プログラム。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表8:基質カセットとベクタープラスミドのゴールデンゲート組立反応混合物。 基質カセットをベクタープラスミドに結びつけるために用いられたゴールデンゲートアセンブリ反応の組成。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表9:基質カセットとベクタープラスミドのゴールデンゲート組立のサイクル条件。 ゴールデンゲート組立に使用されたサーマルサイクリングプログラム。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表10:ベクタープラスミドの線形化用反応混合物。 ライブラリー構築前にベクタープラスミドを線形化するために用いられた制限分解反応の組成。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表11:ENLYFESを切断するTEVpバリアントのナノ孔シーケンシング結果。 4回目で最後のFACSセッション後に酵母細胞からプラスミドを抽出しました。各クローンの変異は野生型配列に対して示されています。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図1:サブカルチャー中の初期と最終EBY100の培養密度の関係。 EBY100培養は初期OD₆₀₀ 値でサブ培養され、最終OD₆₀₀ は同一の成長条件下(30°C、220 rpm)でインキュベーション後に測定されました。最終培養密度は初期OD₆₀₀ の増加に比例して線形に増加しました(R² = 0.969、 p = 5.77 × 10⁻⁵)。データポイントは、(n = 2–4)個の独立した生物学的複製±の平均標準差を表します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:TEVp変異誘発ライブラリの合理的設計。TEVp(PDB ID: 1LVB)のカートゥーン表現で、P1残基(紫色)から離れた4つの残基(金)<5Å)が部位飽和変異誘発を標的にしています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

指向進化は、多様化と選択の反復サイクルを用いて、増強または新規の生化学的機能を持つタンパク質を特定するハイスループット手法です¹⁷。本プロトコルでは、 S. cerevisiaeの細胞表面表示システムを用いてプロテアーゼ基質認識を進化させる最適化されたワークフローを詳述します。表面表示システムはプロテアーゼ活性を検出可能な蛍光ベースの表現型にマッピングし、目的のクローンのFACSベースの濃縮を可能にします。プロテアーゼライブラリーと基質カセットの組み立て、高効率の電気穿孔、FACSゲートと選別、プロテアーゼ変異体の最終シーケンスに関する詳細な手順を提供します。

指向進化における最も重要なステップの一つは、ライブラリの多様性と潜在的な突然変異のカバーを確保する^{ことです。}当社の電気穿孔効率実験では、初期サブカルチャーOD₆₀₀が3.0の変換効率を109^CFUを超えることが示されています。このスケールは、最適化された酵母電気孔孔によって達成され、従来の化学変換法を大幅に上回り、大規模な組合せライブラリを十分にカバーすることを可能にします^8,9。正確なFACSゲートと選別は、望ましい切断特性を示す細胞と非特異的切断を示す細胞を分離するために不可欠です。FACSに基づく選択の複数ラウンドでは、望ましいプロテアーゼ変異に対して選択的に濃縮するゲーティング戦略がますます厳格になります。ゲートが広すぎる場合、望ましくない細胞と目的の変異が並べ替えられることがあります。厳格なゲーティング(例:FITCシグナルの閾値をラウンドごとに下げる)により、細胞集団は新しい標的基質配列¹⁰に対して特異性と活性の高いプロテアーゼ変異体に濃縮されます。過去^{のキャンペーン7,18}に沿い、TEVpの基質結合ポケット内の4つの残基が基質P1残基Q(T146, D148, H167, S170)と相互作用するNNSコドン変異誘発を実施しました(補足図2)。図6Bに示されたFACSプロットは、ゲーティング戦略と濃縮ワークフローを示す単一の代表的なソーティング実験を表しています。興味深いことに、私たちのキャンペーン結果では異なるアミノ酸変異セットを持つTEVpバリアントが検出されました(表11)。これらの結果は、プロテアーゼ進化の重要な特徴を支持しています。すなわち、複数の進化経路が同じ目標に到達できるということです。

実験を行う際には修正やトラブルシューティングの戦略が必要になる場合があります。例えば、電気穿孔時には指示があれば氷の上で作業し、各段階で細胞ペレットを慎重に再懸垂し、電気穿孔前に細胞が生きて健康であることを確認します。酵母細胞はエレクトロポレーションの段階から成長回復段階まで繊細です。さらに、酵母細胞のフロック化を防ぐためにFACSシース流体の改良が必要になる場合があります。シース液はFACS機器で一般的に使用され、細菌や真菌の増殖を抑制する防腐剤が含まれている場合があります。したがって、鞘液は純粋なPBSに置き換えて選別中の細胞死を防ぐことができます。

酵母表面表示システムは、分泌経路を成功裏に通過するために適切に折りたたまれたタンパク質を必要とします。一部のプロテアーゼ変異体は誤折りによって活性を失い、非特異的切断や背景蛍光によるFACS選択中の偽陽性を引き起こすことがあります。このようなプラスミドベースのキャンペーンでは、誤検知の明確な原因が注目に値します。切断はC末端エピトープタグの喪失として読み取られるため、そのタグを破壊する変異は本物の切断イベントと同じ低FITC表現型をもたらします。このようなタグ変異は大規模な相同組換えの過程で生じ、連続するソートラウンドにわたって増殖することがあります。定数基質カセットの染色体統合により、この問題を緩和することが最近示されています¹⁹。このプロトコルは、ベクトル(基板カセットを含む)を一定に保ちながらインサートライブラリを使用することに依存しています。したがって、このプロトコルはプロテアーゼと基質ライブラリの両方を進化させたい人には適していません。

YESSプラットフォームはプロテアーゼ基質特異性¹⁸の再プログラミングの一般的な道を切り開きました。最近の改良点には、YESS2.0⁷における滴定酵素/基質制御の追加、次世代シーケンシングへの結合、高解像度特異性プロファイリングの実現²⁰、発現ノイズおよび偽陽性の低減のための染色体統合(¹⁹)が含まれます。ファージ支援連続進化などの他の直交戦略も、治療標的のプロテアーゼ特異性の工学に応用^{されています。}これらのツールはTEVプロテアーゼ工学を超えた応用が見られ、SARS-CoV-2主プロテアーゼの高解像度プロファイリングによる阻害^剤設計の指導にも活用されています。このようなキャンペーンの重要な決定要因は、EBY100 S. cerevisiae株では体系的に最適化されていなかった大規模な組合せライブラリ(>10⁹)をカバーする十分なトランスフォーマントを生成することです。EBY100の形質転換を10.9 CFU以上に誘導する成長段階および電気穿孔条件を定義することで、このプロトコルはボトルネックを排除し、数百万の変異の包括的なFACSベースのスクリーニングを可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software