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方法論記事

プロテアーゼの指向性進化のための最適化された酵母表面表示ワークフロー

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DOI:

10.3791/72559

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2026年8月4日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

この記事について

サマリー

このプロトコルは、表面ディスプレイベースの選択システムを用いて 、サッカロマイセス・セレビシア エにおけるウイルスプロテアーゼの指向性進化に最適化されたワークフローを提供します。DNAインサートライブラリおよび基板カセット設計、高い形質効率に最適化された電気穿孔、蛍光活性化細胞選別によるプロテアーゼ切断の選択、そして濃縮変異体のシーケンスについて概説しています。

要約

指向進化は、高速で制御された実験室環境で自然な進化過程を模倣し、望ましい機能や形質を持つタンパク質を進化させます。大量の変異タンパク質コード遺伝子をスクリーニングすることで、バイオテクノロジー、医学、合成生物学への応用のために望ましい変異体の機能的選択が可能になります。このプロトコルを用いて、 サッカロマイセス・セレビジア エにおいて指向進化を行い、非在来基底配列に対して高い特異性を持つプロテアーゼ変異体を設計しました。これらのプロテアーゼ変異体を酵母細胞表面に表示し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を通じて複数回の濃縮を経て望ましい変異の選定を容易にします。基質カセットの4つの主要要素はプロテアーゼライブラリと共発現しています。すなわち、(i) 酵母接着受容体サブユニットAga2、(ii)選択基材配列および(iii) カウンターセレクション基底配列、(iv) エピトープタグ配列、そしてオプションの小胞体(ER)回収シグナル配列からなる融合タンパク質です。選択基質配列のみが切断された酵母細胞は、蛍光(フィコエリスリン/フルオレセイン・イソチオシアネート標識)抗エピトープ抗体を介して多色FACSを用いて単離します。ここでは、DNAインサートライブラリ設計および基質カセット設計、高効率な酵母細胞電気穿孔(1マイクログラムあたり最大109 個のトランスポレーション)、FACSベースの選択、濃縮、進化型変異体のシーケンスを含むプロテアーゼ進化キャンペーンを実施するための最適化された段階的プロトコルの詳細を提供します。私たちは、タバコエッチウイルス核包含物であるプロテアーゼA(TEVp)を、自然な基質配列ENLYFQ↓Sを切断し、新たな配列ENLYFE↓Sを切断する進化へと進化させることで、指向進化プロトコルを示します。

概要

ポティウイルス科のシステインプロテアーゼ、特に核包有物A(NIa)プロテアーゼは、配列特異的エンドペプチダーゼのほとんどが未開発の供給源となっています。3,800以上の特徴的なファミリーメンバーを持つNIaプロテアーゼは、7アミノ酸からなる異なる基質配列を切断します。ポティウイルスファミリーは、プログラム可能なタンパク質制御システムの設計、直交プロテアーゼベースの遺伝子回路の構築、配列特異的バイオテクノロジーツールの開発など、多様なプロテアーゼ群を提供します。この自然な多様性にもかかわらず、NIaプロテアーゼのうちTEVpとタバコ静脈モタリングウイルスプロテアーゼ(TVMVp)のみが、広範な実験室およびバイオテクノロジー用途向けに徹底的に特徴づけられ、設計されています3,4。この限定プロテアーゼツールキットは、直交プロテアーゼ活性を必要とする多成分回路の設計空間を制限し、指向進化を通じたNIaプロテアーゼのさらなる拡張と特性評価の取り組みを促します。6,7。

酵母表面ディスプレイは、蛍光活性化細胞選別(FACS)6,7による高スループットタンパク質ライブラリースクリーニングを可能にする、指向性進化の最も強力なプラットフォームの一つとして台頭しています。例えば、酵母内質網隔離スクリーニング(YESS)システムは、S. cerevisiae 6,7の分泌経路を通じてプロテアーゼ活性と表面ディスプレイを結合させます。YESSシステムは新規のプロテアーゼ-基質特異性の設計に応用されており、複数ラウンドの指向進化キャンペーンでの有用性が示されています。この系では、プロテアーゼ変異体がエピトープマーカーを持つ切断基質カセットを含む融合タンパク質と共発現し、Aga1p表面アンカーはEBY100酵母株で発現されます。蛍光抗体による差別標識により、細胞表面に表示される切断された基質カセットと非切断された基質カセットを区別します。この活動依存の表示機構は、10、7、またはそれ以上のバリアント6,7のライブラリに対する反復FACSベースの選択と直接互換性があります。

指向進化の基本的な前提条件は、対象配列空間を十分にカバーできるほどの規模で変異ライブラリを導入できることです。複数のアミノ酸位置にまたがる部位飽和変異誘発ライブラリでは、ライブラリに導入された多様性が選別された集団に十分に反映されるために、10 8から109の異なるトランスポンタントの形質転換量が必要です。S. cerevisiaeに外因性DNAを導入する方法はいくつかあり、それぞれ異なるスループット上限があります。従来の化学変換法は、その簡便さと入手の容易さから酢酸リチウム/一本鎖キャリアDNA/ポリエチレングリコール(LiAc/ssDNA/PEG)を使用します。しかし、通常は1マイクログラムあたり104–10 6コロニー形成単位(CFU)の形質変換効率を達成し、大規模ライブラリキャンペーンに必要な配列変異には達しません。これに対し、電気穿孔法は高電圧電場を適用して細胞膜を一時的に透過し、DNAの取り込みを促進します。電気穿孔は利用可能な変換法の中で一貫して最高の形質転換効率を達成しており、最適化プロトコルでは108–109 CFU9の収率が報告されています。S. cerevisiaeにおける電気穿孔効率は細胞増殖相、DNA量、バッファー組成に極めて敏感であることが観察されており、その後ライブラリ規模の指向進化に広く適応された枠組みとなっています。

ここで説明するプロトコルは、酵母表面ディスプレイに広く採用されている宿主株である S. cerevisiae 株EBY100を使用しています。EBY100は、ボーダーとウィットラップによって、ガラクトース誘導性GAL1プロモーターの制御下にあるAGA1発現カセットをプロテアーゼ欠損親株BJ546510の染色体AGA1遺伝子座に統合することで設計されました。この品種はATCCから市販されています(カタログ番号はMYA-4941;遺伝子型 MATa AGA1::GAL1-AGA1:URA3-52 trp1 leu2-δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−)その結果、Aga1pとAga2p基質カセット融合は同じガラクトース誘導プロモーターから発現され、両サブユニットが共誘導され、ジスルフィド結合したAga1p–Aga2p複合体として組み合わされ、表示された融合を細胞壁に固定します。

EBY100は酵母ディスプレイ用途で広く使われていますが、ライブラリー規模の収率でこの株を電気ポラー化するために体系的に最適化された公表プロトコルはありません。収穫時の最適な成長段階、サブカルチャー中の培地組成、600nm(OD600)の初期光学密度と変換効率の定量的関係など、EBY100特有のパラメータは、厳密に特徴づけられ最適化されるべきです。本研究では、EBY100における形質転換効率が収穫時のOD600 とともに単調に増加し、後期ログ相の細胞は初期ログ段階で収穫された細胞よりもはるかに高い形質転換率を生み出すことを報告しています。接種時の初期OD600 値、サブカルチャーにおける2×酵母抽出ペプトンデキストロース(YPD)培地の使用、電気穿孔バッファーの製剤、電気穿孔後の成長条件など、重要なプロトコルパラメータを評価しました。ここに示すプロトコルは、最適化された段階的なワークフロー(図1A–C、 図2、 図3A–D、 図4A–E)を提供し、電気能力を持つEBY100細胞を準備し、高効率なDNAライブラリの電気穿孔を行うことで、変換率を一貫して109 を超えますCFU。このプロトコルの検証のために、FACSに基づく選択および濃縮の4ラウンドにわたり切断特異性を変えたTEVpを工学的に設計する包括的な指向進化キャンペーンを実施しました。濃縮プロテアーゼバリアントのシーケンスにより、プロテアーゼの基質結合ポケット内の標的残基で著しい多様化が確認され、プロトコルが配列空間のライブラリカバレッジを十分に提供し、生産的な進化キャンペーンを支持していることが示されました。このプロトコルは、EBY100を酵母表面ディスプレイに基づく指向進化やFACS互換の高スループットスクリーニングに用いる研究者にとって、プロテアーゼ、抗体9、キナーゼ11、受容体12などのタンパク質に広く有用となります。

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プロトコル

組換え S. cerevisiae を含むすべての実験は、テキサス大学ダラス校の機関バイオセーフティおよび化学安全委員会の方針と手順に従って実施されました。組換え酵母株は、確立された機関の微生物学的慣行に従い、バイオセーフティレベル1(BSL-1)の封じ込めのもとで取り扱われました。電気穿孔、培養、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、承認された機関のバイオセーフティ手順に従って実施されました。酵母培養および汚染された消耗品は、機関のガイドラインに従い除染され、生物有害廃棄物として処分されました。

1. ベクターおよび挿入準備

  1. 部位飽和変異原作用によるポチウイルスプロテアーゼライブラリーの生成
    1. 30から50メルの順方向および逆方向オリゴヌクレオチドを重ね合わせたシーケンス設計ソフトウェアを用いて、変異したプロテアーゼライブラリを生成する。対応するオリゴヌクレオチドの野生型コドンを、変異誘発部位のNNS 縮退性コドンに置き換えます。ここでNはA、T、G、C、SはGまたはCを表します。
    2. 各順方向および逆方向オリゴヌクレオチドペア間の3′重なりを、融点(Tm)を55〜60°Cに設定します。 最初と最後のオリゴヌクレオチドは、制限部位を超えて酵母表面表示ベクターと50 NTの重なりを持つように設計します。
    3. 挿入物の少なくとも一端が線形化されたベクトルの一端と正確に重なり、相同組換えを促進すること13。隣接するオリゴヌクレオチド間の隙間を避けること 14.
    4. オリゴを脱イオン化H2Oで100μMまで再懸濁します。滅菌1.5 mLのチューブで、各オリゴを0.5 μLを最終体積200 μL(各オリゴに対して最終濃度250 nM)に結合します。
    5. 表1に記載された成分を用いてPCR反応を設定し、表2の熱サイクル条件を用いてプロテアーゼライブラリーを組み立てます。
    6. 最初の組み立て済みPCR生成物をテンプレートとして、最外側の順方向および逆方向オリゴ(表3)を用いて2回目のPCR反応を設定します。 表4に示すように積を増幅します。
    7. 2番目のPCR産物を1%アガロースゲルと臭化エチウム(0.5 μg/mL)で240 Vで30分間投与します。期待されるDNA長に対応するバンドを切除します。
      注意:注意:エチジウム臭化物は変異原であり、実験用コート、ニトリル手袋、安全メガネなどの適切な個人用防護具(PPE)を使用して取り扱う必要があります。皮膚への接触や吸入は避けてください。臭化エチウムを含むゲル、バッファー、消耗品は、機関の安全ガイドラインに従い有害化学廃棄物として処分してください。
    8. ジェル抽出キットを使って精製してください。脱イオン化水素50μLに溶出します。
    9. 分光光度計を使ってDNA濃度を測定します。DNAは−20°Cで保存します。
      注:第2次 PCRの50μL反応ごとに約0.5〜1.0μgのDNAが得られます。各電気穿孔にはプロテアーゼライブラリー12μg(インサート)が必要なため、反応数をそれに応じて拡大します。
  2. 基板カセットアセンブリ
    1. LB寒天プレートとLB-クロランフェニコール液体培地を準備します。レシピは 表5の参照。
    2. 基板カセットの組み立てのために、前後方向に重なり合う30マーオリゴヌクレオチドのセットを設計します。各逆オリゴヌクレオチドの5′端と次の断片の前方オリゴヌクレオチドを4ヌクレオチドの一致させる設計を行います。
    3. 去イオン化H2Oを用いて凍虫乾燥オリゴを100μMまで再懸濁します。
    4. 表6のように試薬を混ぜます。
    5. 表7のサイクリングプログラムを使って、オリゴ混合物をアニールしリン酸化します。
    6. 希薄化されたオリゴを脱イオン化H2Oで4倍アニーリングし、最終濃度1.25 μMに到達します。
    7. アニールされたオリゴ混合物をベクター(例:pDD1523)と組み合わせ、 表8に従います。
    8. 表9のサイクリングプログラムに従い、ゴールデンゲート組立を行います。
      注:例えば、pDD1523プラスミドはGAL1/10プロモーターの下流にタイプIIS制限部位(BsmBI)を持っています。組み立てが成功すると、基質カセット7のガラクトース誘導が可能になります。
    9. できたプラスミドを 大腸菌に変換します。
    10. LB寒天上の細胞をプレートにし、対応する抗生物質を投与します。37°Cで16〜18時間培養します。
    11. 分離したコロニーを選び、5mLのLB培地で接種します。37°Cで16〜18時間、振動(220rpm)で孵化させます。
    12. プラスミドのミニプレップキットを使って、一晩培養からプラスミドを抽出します。
    13. 分光光度計でプラスミド濃度を測定し、その後シーケンスに送ります。
  3. 酵母表示ベクターの線形化
    1. 酵母ディスプレイプラスミドを線形化し、例えばpDD1524をSphIおよびPstI制限酵素で消化し、基質カセットを含む酵母ディスプレイベクターを電気穿孔用に準備します。 表10 に記載された試薬を混ぜ、37°Cで1時間培養します。
    2. 制限性消化生成物を1%アガロースゲルに240Vで30分間投与します。期待されるDNA長に対応するバンドを切除し、ゲル抽出キットで精製します。
      注:制限性消化1回あたり約0.5〜1.0μgの総DNAが得られます。各電気孔径には4μgの線形化ベクターが必要なため、消化反応のスケールをそれに応じて拡大します。

2. 電気穿孔

注意:生物材料や試薬の取り扱いに関しては、機関の安全手順を遵守し、適切なPPEを着用し、生物・化学廃棄物は機関のガイドラインに従って処分してください。

  1. バッファー、プレート、培地の準備(電気穿孔の2日前)
    1. 成長培地を準備(1× YPD;2 × YPD;合成デキストロースカサミノ酸(SDCAA+);および合成ガラクトースカサミノ酸(SGCAA+)、プレート(YPDおよびSDCAA)、電気穿孔バッファー、そして 表5のレシピに従う滅菌水。保存温度は4°Cです。
  2. EBY100のストリークプレートの準備。
    1. グリセロールストックからYPD寒天にEBY100酵母をストリークアウトします。30°Cで2日間育てます。
    2. 培養後は4°Cで保存します。
      注:ストリークプレートは最大1か月間使用可能です。プレートに連続記録日をマークしてください。
  3. EBY100の前培養準備(電気穿孔1日前)
    1. 125mLの1×YPDを500mLのエルレンマイヤーフラスコに準備します。
    2. 1×YPDを25mLを50mLの円錐形チューブに準備します。マイクロピペットの先端を使って、2日間培養したEBY100細胞をプレートから採取します。次に、ピペットの先端から1× YPDを含む円錐形の管に酵母細胞を移します。
      注意:細胞の筋は約1〜2mmの長さのスミア状になります。
    3. マイクロピペットの先端を外し、円錐形のチューブをボルテックスで混ぜて十分な混合を確保してください。
    4. 酵母細胞を含む1×YPDの25mLを500mLフラスコに移し、150mLの前培養液を125mLの酵母細胞を含む1×YPDを準備します。混ぜるために渦巻きを流します。
    5. 分光光度計を用いて、1cmの経路長を持つ2つのマイクロキューベットを準備してOD600 を測定します。1つは1× YPDの1mLをブランクコントロール、もう1つは1mLのプレカルチャーを含んでいます
    6. 150mLのプレカルチャーを30°Cで16〜20時間、270rpmの軌道振動で培養します。
  4. 希望の初期OD600 (電気穿孔当日)でのサブカルチャーの準備
    1. 表5に記載された条件バッファーと成長培地を準備 します。
    2. 夜間の前培養のOD600 を測定します(予想OD₆₀₀は17–22)。分光光度計の直線範囲内に収まるには、前培養の希釈を1:20で測定します。
    3. 100mLサブカルチャーを接種するのに必要な前培養量を計算します。初期サブカルチャーOD600は3.0〜4.0が推奨されます。
    4. 培養液を100mLの2×YPDの500mLのエルレンマイヤーフラスコで希望の初期OD600 まで希釈します。
    5. 100 mLサブカルチャーを30°Cでインキュベートし、軌道振動を270 rpmで4時間行います。
  5. 4時間の培養期間中の培地準備
    1. 氷のように冷たい電気穿孔緩衝材と滅菌水を準備しておきましょう(ステップ2.1.1より)。
    2. 表 5のレシピに従って、100mLの調整バッファーを準備します。1回の形質変換につき20mLの調整バッファーを使用します。それに応じてスケールアップしましょう。室温(20〜23°C)で保存してください。
      注意:注意:コンディショニングバッファーにはジチオスレイトール(DTT)と酢酸リチウム(LiAc)が含まれており、これらは皮膚や目の刺激を引き起こす化学的刺激物です。実験用コート、ニトリル手袋、安全メガネなどの適切なPPEを着用し、これらの試薬は機関の化学物質安全手順に従って取り扱ってください。未使用の溶液や使用済みバッファーは、機関のガイドラインに従って化学廃棄物として処分すること。
    3. 培養培地(50 mL)を準備します:2 × YPD 25 mLと 1 M ソルビトール 25 mLを混ぜます。1回の形換えごとに8mLの成長培地を使用。室温(20〜23°C)で保存してください。
  6. 4時間の培養後の電気能力を持つ酵母細胞の製製。
    1. 100 mLのサブカルチャーを2つの50 mL円錐形チューブに分割します。4°C、1,500 × g で遠心分離して3分間細胞を採取し、その後培地をデカントします。ステップ2.6.4が完了するまでセルを凍結状態にしてください。
    2. 各細胞ペレットを氷のように冷たい滅菌水25mLで優しく再懸浮させます。4°C、1,500 × g で3分間遠心分離し、その後培地をデカントします。
    3. ステップ2.6.2を繰り返します。
    4. 各細胞ペレットを25mLの氷で冷やす電気孔育成バッファーで優しく再懸濁します。4°Cで1,500 g ×遠心分離機を3分間加熱し、その後培地をデカントします。
    5. 細胞を氷から取り出し、10mLの室温(20–23°C)調整バッファーで優しく再懸濁します。その後、125mLのエルレンマイヤーフラスコ1個にプールし、30°Cで270rpmの軌道振動を30分間インキュベートします。
    6. 細胞を50mLのチューブに注ぎます。遠心分離機で4°C、1,500 g × 3分間加熱します。メディアを移してください。
    7. 50mLの氷で冷たい電気穿孔バッファーで細胞ペレットを優しく再懸浮させます。4°Cで1,500 g × gで3分間遠心分離し、その後培地をデカントします。
    8. 約100〜200μLの電気穿孔バッファーを加えて、細胞ペレットを最終体積1mLに再懸浮させます。電気穿孔まで細胞を氷の上に置いてください。
      注意:電気適性セルは凍結(すなわち–80°Cの冷凍庫に入れる)ことができ、後から使用しても電気孔の効率を大きく損なうことはありません。
  7. 電気穿孔、突起、メッキ
    1. 氷上で0.2cmの隙間を設けたプレチルの電気穿孔キュベット。
    2. 再懸濁ペレット380μLを無菌の1.5 mLチューブに移します。プラスミドDNA4μg、または線形化プラスミドベクター4μg、挿入12μgと混合します。ピペッティングで優しく混ぜます。
      注:電気孔細胞の数を最大化するために、ベクターおよび挿入DNA濃度は理想的には700〜800 ng/μLであるべきです。濃度がそれより低い場合は、真空濃縮器を使いましょう。
    3. 懸濁液を事前に冷却されたエレクトロポレーションキューベットに移します。5分間氷で冷やしておいてください。
    4. 5分後に糸くずのないラボラトリーワイプでキュベットの側面を拭き、電気穿孔中にアークが起きる可能性のある残留水分を取り除くと良いです。キューベットの金属板の上に気泡やセルは避けてください。これらはアークの原因になる可能性があります。キューベットの冷たい温度を維持するために、プレート電極には触れないでください。
    5. 50mLの円錐形チューブに8mLの成長培地を準備します。
    6. セルを以下の設定で電気孔化します:電圧2.5 kV、静電容量25 μF、抵抗200 Ω9。許容される時間定数範囲は2.8〜4.5 msです。
      注意:注意:電気穿孔は高電圧の電気パルスを含みます。キュベットが正しく装着され、メーカーの操作指示に従ってください。使用済みの電気穿孔キュベットは、機関のガイドラインに従って生物有害廃棄物として処分してください。
    7. すぐに円錐形チューブから約200μLの成長培地をクヴェットに注ぎ、電気孔出した細胞を50mLの円錐形チューブに移します。さらに200〜350μLの増殖培地を加え、キューベット内に液体が見えなくなるまで加えます。
    8. 50 mLの円錐形の電気孔細胞チューブを、8 mLの成長培地に30°Cで振動せずに1時間培養します。15分ごとにチューブを逆さにして混ぜます。
    9. 細胞を1,500 × g、25°Cで遠心分離し、3分間採取します。その後、メディアをデカントします。
    10. 細胞を適切な酵母ドロップアウト培地に再懸浮させ、形転細胞の選択を維持します。TRP1選択マーカーを含むプラスミドの場合、トリプトファンを含まない250mLのSDCAA+に細胞を再懸濁させ、プラスミドを保持した酵母を選択的に回収します。
    11. 30°Cで16〜20時間の夜間インキュベーションを行い、270rpmで軌道振動を行います。

3. 酵母細胞の誘導、染色、フローサイトメトリー選別

  1. プロテアーゼライブラリーと基質カセットの誘導(選別1日前)
    1. ドロップアウト培地中の変質物の一晩の成長後、ステップ2.4.2のOD600 を測定します。
    2. 酵母変質物質12mLをアリコートし、遠心分離機で3,200 × g で5分間加熱します。
    3. 上清液を除去し、細胞ペレットをSGCAA+誘導培地に再懸濁し、OD600 0.5にします。希釈式を用いて必要な懸濁容積を計算します。C1V1 = C2V2。
    4. 125 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、30°Cで18〜24時間、270 rpmで軌道振動を起こして一晩培養します。
  2. 蛍光抗体染色(仕分け当日)
    1. 誘導後の細胞のOD600 を測定してください。2種類のキュベットを使いましょう:1つはSGCAA+を1mL、もう1つは950μLのSGCAA+と50μLの細胞を混ぜたものです。測定されたOD600 値を20掛ければ、誘導後細胞の真のOD600 が得られます。
    2. 抗体染色とFACS選別のために、各サンプルを3×10〜7 細胞に正規化します。C1V1 = C2V2 を使って、誘導フラスコから移すセルの体積を計算します。
      注:4部位NNS飽和変異誘発の場合、理論ライブラリのサイズは106 の変異です。ライブラリを十分にサンプリングするには、ライブラリサイズの少なくとも10倍、つまり10個の7 セルをスクリーニングしてください。例:もしC1V1 = 3 × 107 細胞、C2 = 誘導後OD600/6(すなわち6 × 107 cells/mL)を望む場合、誘導細胞500 μL(すなわち V2 = 3 × 107 細胞 / 6 × 107 cells/mL = 500 μL)を割り当てます。
    3. 計算された細胞体積を1.5 mLのチューブに移し、遠心分離機で5,000 × g で5分間投与しました。
    4. 上清液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+0.5%牛血清アルブミン(BSA)500μLに再懸濁します。
    5. 5,000 g ×遠心分離機で5分間行い、ステップ3.2.4を繰り返します。
    6. 5,000 g で遠心分離機を5分間行×その間にステップ3.2.7を完了してください。
    7. 抗HAフルオレセインイソチオシアネート(FITC)(0.5 μg/107 細胞)、抗FLAGフィコエリスリン(PE)(0.05 μg/107 細胞)、およびPBS + 0.5% BSA(100 μL/107 細胞)を含む抗体染色混合物を1.5 mLチューブに準備します。チューブは氷の上に置いておけ。
    8. 上澄液を取り除き、染色液で再懸濁します。染色液を3×10セル10個につき300μL使用してください。チューブを渦巻かないでください。インバートかフリックだけ。
    9. 再懸濁後、細胞を暗闇で1時間氷上に置いてください。
  3. ステイン後のウォッシュ
    1. 遠心分離機で5,000 × g で細胞を5分間染色します。上清液を除去し、0.5% BSAを含むPBSに再懸濁します。10×7 細胞あたり0.5 mL(例:10 ×7 細胞に対して500 μL、3×107 細胞に対して1.5 mL)。
    2. 遠心分離機で5,000 g×5分。上清液を除去し、PBS750μL+0.5%BSAに再懸濁します。
    3. さらに750μLのPBS+0.5%BSAを10mLの採集管に移します。
  4. FACS(連邦交通管制システム)
    1. 新しい実験のために必要なサイトメーターの起動と準備を行います。
    2. 3つのドットプロットを作成します。最初のドットプロットでは、X軸名を選択して前方散乱領域(FSC-A)チャネルを、Y軸名を選択して側面散乱領域(SSC-A)チャネルを表示します。
      注:これにより生細胞の選定が容易になります。
    3. X軸名はFSC-Aチャネルを表示するために保持し、Y軸チャネルは2番目のドットプロットで前方散乱高(FSC-H)を表示するように変更します。
      注:これによりシンクレットの選定が容易になります。
    4. 3番目のドットプロットでPEチャネルを表示するにはX軸名を選択し、FITCチャネルを表示するにはY軸名を選択してください。
    5. サイトメーターで530/30nm(FITC)および585/42nm(PE)チャネルを使ってネガティブコントロールを実行します。70μmノズル  70psiのシース圧力で選別を行います。4000〜5000イベント/秒の速度でサンプルを取得。
    6. 最初のドットプロット(FSC-A対SSC-A)で、FSC-AおよびSSC-A信号が低い破片や小さな粒子を除外するため、主要な無傷酵母細胞群の周囲にポリゴンゲートを描きます。
    7. このゲート内のFSC-H対FSC-Aプロット上のゲートシングレットは、FSC-HとFSC-Aの比率関係を示す線形母集団を選択することで分類されます。線形分布から逸脱し、二重線やセル集約に対応する事象は除外します。
      注:PEとFITCの3番目のドットプロットでは、陰性対照群(すなわち、完全な基質カセットを発現する酵母細胞)の点の斜めのクラスターを示します。
    8. サンプルを採取し、PE/FITC値に基づいて酵母細胞を選別します。理論ライブラリサイズの少なくとも10倍に対応するセル数を分析し、すべてのバリアントを適切に表現できるようにします(例:理論的多様性が~1 ×10 6バリアントのライブラリに対して、107セル× ~1を解析します)。
    9. ソートゲートをネガティブコントロール集団のPE/FITC対角線の下に位置させます。
      注:より厳格なゲートは望ましい変異の濃縮を改善するが、細胞の回復を減少させる。
  5. FACS後
    1. 遠心分離機の集水管を3,200 g で5分間×上澄液を慎重に取り除き、1 mLを残し、PBSを5 mLに再懸浮させます。
      注意:遠心分離後は細胞ペレットが見えなくなるため、上清液は1mL残してください。
    2. 遠心分離機セルは再び3,200 g ×5分間使用しました。上澄液を取り除き、1mLを残します。SDCAA+4 mLで再懸浮します。
    3. 250 mLのエルレンマイヤーフラスコに15 mLのSDCAA+を加えます。ステップ3.5.2の再懸濁細胞をこのフラスコに移します。
    4. 30°Cで18〜24時間、270rpmで軌道振動を起こして一晩培養します。
    5. 各ラウンドの指示的進化について、ステップ3.1、3.2、3.3、3.4を繰り返します。

4. 個々のクローンのプラスミド回収およびシーケンス

  1. 個々の群れを育てる
    1. ステップ3.5.4後に液体培養液500μLと滅菌50%グリセロール500μLを混ぜてグリセロールストックを作り、25%グリセロールストック溶液を作ります。渦を起こして細胞を徹底的に混ざらせます。
    2. -80°Cの冷凍庫で一晩保存します。長期保存の場合は液体窒素に移してください。
    3. グリセロールストックを無菌の1000μLチップで削り取り、100μLのSDCAA+に混ぜます。この混合物をSDCAAプレートにプレートし、30°Cで逆さまに培養します。
    4. 3日後にコロニーを摘み、14mLのチューブに1.5mLのSDCAA+を植えて一晩培養します。
  2. 酵母ミニプレップを行いプラスミドを抽出します
    1. 16,000 × g で遠心分離して1分間ペレットし、酵母プラスミド精製キットから200μLの溶液1に再懸濁します。
    2. 溶解酵素溶液5μL(5 U/μL)を加えます。
    3. 37°Cのインキュベーターで4時間、エンドツーエンドのミキサーで孵化させます。
    4. 凍結解凍サイクルを行い、-80°Cで20分間冷凍し、42°Cで10分間水浴で解凍します。
    5. 酵母プラスミド精製キットから溶液2200μLを加え、2〜3回逆さまに混ぜて5分間置きます。
    6. 酵母プラスミド精製キットから溶液3を400μL加え、2〜3回反逆して混合します。遠心分離機で16,000 × gで5分間。
    7. 高DNA結合能力を持つ精製キットを用いてプラスミドDNAを精製します。
      注:溶解細胞から大量のせん断ゲノム酵母DNAが存在するため、低容量の酵母プラスミドDNA精製カラム(5μg)ではなく、DNA結合能力の高いシリカ系カラム(35μg)を使用する必要があります15。
    8. 分光光度計を使ってDNA濃度を測定します。DNAの収率は10〜30 ng/μLです。
  3. 精製されたプラスミドを化学的に適格な大 腸菌 細胞に変換します
    1. 表5のレシピに従ってSOC培地とLB-クロルランプニコールプレートを準備します。また、水浴を42°Cまで予熱してください。
    2. 各プラスミドに対してLB-クロランフェニコールプレートを37°Cで20分間温めます。
    3. -80°Cの冷凍庫から化学的に適切な細胞のチューブを取り出し、氷の上で解凍します。
    4. 各プラスミドに対して30μLの適合細胞を氷上の1.5mLチューブにアリコートします。
    5. 3μLのプラスミドを正常な細胞にピペットで取り込む。混ぜるために軽く開いて、氷の上で5分間置きます。
    6. 熱ショックを行うために、細胞を42°Cの水浴で短時間40秒間培養します。
    7. 氷で2分間孵化します。
    8. 細胞に300μLのSOC培地を加え、37°C、220rpmで15分間インキュベークします。
    9. 50〜100μLの形質転換可能な細胞を予温プレートにプレートします。
    10. プレートを37°Cで逆さまに18時間孵化します。
  4. コロニー採取
    1. 液体LB-クロランフェニコール培地5 mLを14 mLの丸底培養管に加えます。
    2. 無菌の1000μLチップでコロニーを選び、培養チューブに入れます。
    3. チューブをシェーカー(220rpm、エアレーション最大化のため30°–45°角度)に37°Cで18時間置きます。
  5. 細菌液培養からのプラスミド抽出
    1. 液体培養液を3,200 × g で4分間遠心分離します。上清液をデカントします。
    2. プラスミド精製キットを使って一晩培養からプラスミドを抽出します。
    3. 分光光度計を使って精製されたプラスミドの濃度を測定します。
  6. シーケンシングのためにプラスミドを提出してください
    注意:全プラスミドナノポアシーケンシングや、変異原領域の両側にプライマーを置いたサンガーシーケンシングなどのサービスをご利用ください。

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結果

効率的なライブラリ構築は、突然変異空間の十分なカバレッジを確保するために不可欠です。希少な機能変異の喪失を避けるために、トランスポルタントの数は理論ライブラリサイズの少なくとも10×0から100に達するべきです× S. cerevisiae における形質転換効率は細胞濃度の影響を受け、初期から中期のログ相細胞で最も高いため、電気穿孔前の初期細胞密度を最適化しました。酵母培養は初期のOD600 値(1.0–4.0の範囲)でサブ培養され、4時間(n = 2–4の独立した生物学的実験)インキュベートされました。その後、最終的なOD600 値は S. cerevisiae の成長曲線にマッピングされ、細胞が中間ログ成長段階に残っていることを確認します(図5A、 補足図1)。

これらの培養を4 μgプラスミ...

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ディスカッション

指向進化は、多様化と選択の反復サイクルを用いて、増強または新規の生化学的機能を持つタンパク質を特定するハイスループット手法です17。本プロトコルでは、 S. cerevisiaeの細胞表面表示システムを用いてプロテアーゼ基質認識を進化させる最適化されたワークフローを詳述します。表面表示システムはプロテアーゼ活性を検出可能な蛍光ベースの表現型にマッピングし、目的のクローンのFACSベースの濃縮を可能にします。プロテアーゼライブラリーと基質カセットの組み立て、高効率の電気穿孔、FACSゲートと選別、プロテアーゼ変異体の最終シーケンスに関する詳細な手順を提供します。

指向進化における最も重要なステップの一つは、ライブラリの多様性と潜在的な突然変異のカバーを確保することです。当社の電気穿孔効率実験では、初期サブカルチャーOD600が3.0の変換効率を109

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。このプロトコルをサポートする生データ、NanoporeシーケンスFASTQファイル、フローサイトメトリー(FCS)ファイル、図や表の作成に用いられたソースデータ、プラスミドpDD1523およびpDD1524はZenodoに保存され、10.5281/zenodo.20746804で一般公開されています

謝辞

ディンガル研究所の全メンバーの助言、専門知識、議論に感謝します。また、UTDフローサイトメトリーコアのインフラと支援にも感謝いたします。M.B.L.はUTDユージン・マクダーモット大学院フェローシップの支援を受けています。この研究は、UTDスタートアップ基金および国立衛生研究所NIGMSからP.C.D.P.D.(R35GM150967)の研究室への助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
10 mM dNTP MixNEBN0447SPCR反応（表1、3）
10X PBS、pH 7.4FisherBP3994染色バッファーベース（ステップ3.2–3.3）
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027S別売り；Q5ポリメラーゼに付属
Agar、BactoBD Difco281230-500gSDCAAアガープレート（表5）；15 g/L
Agarose（Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade）Fisher BioReagentsBP160-500ゲル電気泳動
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309FACS染色；PE結合抗FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621FACS染色；FITC結合抗HA
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120SDCAA+、SGCAA+、SCAA培地（表5）；5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0LB/SOB培地調製；YPD（表5）で20 g/L
BSA、Bovine Serum Albumin、Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% PBS中；染色バッファー（ステップ3.2–3.3）
BsmBI-v2（200 U）NEBR0739SGolden Gate組立の基質カセット（表8）
Calcium chloride solution（1M）Sigma-Aldrich21115-100mL電気ポアレーションバッファー：最終1 mM（表5）
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3試薬ボトルに入れ、121℃、15 psiで15分間オートクレーブして滅菌する。
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g；SGCAA+誘導用20% w/v ストック（表5）
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10電気ポアレーションバッファー（1 M）と成長培地（表5）
Dextrose（D-Glucose）、無水Sigma-AldrichG8270-1KGYPD、SDCAA+、20% w/v デキストローストック（表5）
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250GSDCAA/SGCAA（表5）で6.7 g/L
Difco YPD Broth（pre-mixed）BD242820-500gYPDの代替品；500 g
DL-Dithiothreitol（DTT）Sigma-AldrichD0632-1G調整バッファー：最終10 mM；250 μLずつ分液、-20℃で保存
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02PCR製品の精製
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01PCRおよび制限酵素消化後のゲル精製（ステップ1.1.8、1.3.2）
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02プラスミド精製（ステップ4.2）
Glycerol（≥99%）FisherBP229-4グリセロールストック用50% v/v ストック（ステップ4.1.1）
Kanamycin SulfateFisherBP906-5SDCAA+およびSGCAA+：最終50 μg/mL；Sigma K0879-5Gの代替
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI；重点突然変異
KLD Reaction BufferNEBB0554AKLD酵素ミックスと併用
LB Broth（Lennox）Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli液体培養
Lithium Acetate Dihydrate（LiOAc・2H2O）Thermo FisherA17921.30調整バッファー：最終0.1 M；DTTの前に加え（表5）
Luria Agar（Luria-Bertani Agar）RPIL24020-2000.0E. coliのプレート培養；Sigma LB Agar Lennox L2897-1KGの代替
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GM代替のカサミノ酸源
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI；Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution、100XCorning30-002-CISDCAA+、SGCAA+：最終1X
PstI-HF（5000 U）NEBR3140Sベクター線形化（表10）；HFバージョンを使用
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492S高忠実度ポリメラーゼ；Q5 Hot Startの代替
Q5 High GC EnhancerNEBB9028A高GC含有量PCR反応用
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LPCR組立と増幅（表1、3）
rCutSmart Buffer（10X）NEBB6004SPstI-HFおよびSphI-HF（表10）に付属
SalI-HFNEBR3138L追加の制限酵素
SOC MediumNEBB9020S形質転換後の回復
Sodium Chloride（NaCl）FisherS271-1LB/SOB培地調製
Sodium Hydroxide（NaOH）FisherS318-500培地のpH調整
Sodium Phosphate Dibasic（Na2HPO4）Sigma-AldrichS9763-500GSDCAAプレート、SCAA培地：38 mM（表5）
Sodium Phosphate Monobasic、無水VWR（BDH）BDH

参考文献

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

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