方法論記事

曲がりくねった血管および動脈瘤における内皮細胞機能の高解像度イメージングのための3Dプリント犠牲インクプラットフォーム

80 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

2026年9月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、押し出し方式のプリンターまたはペースト状の犠牲インクの手作業による塗布を用いて、屈曲部や動脈瘤様セグメントを持つ血管をin vitroで設計および構築する方法と、血行動態の流れおよび血管内皮細胞の応答を評価する方法について詳述します。

要約

血管の蛇行と動脈瘤は、ヒトのさまざまな組織や血管型において重大な健康リスクとなります。これらの血管形状の変化は血流ダイナミクスに異常を引き起こし、血管内皮機能に大きな影響を及ぼします。これらの血管疾患状態の動物モデルは、いくつかのケースで有用な知見を提供してきましたが、構築にコストがかかる上、動物種の生理学的特性に限定されるという課題があります。これを受けて、 in vitro 3Dオルガン・オン・ア・チップ（OOC）モデルは、ヒト細胞における血管機能および内皮細胞応答を評価するための強力なツールセットとなっています。それぞれのOOCモデルには独自の利点がありますが、よりアクセシビリティの高いシステムが求められています。 生理的なせん断速度および圧力条件下における、曲がった血管および動脈瘤の血管機能の重要な指標である血管透過性を研究するためである。本手法では、エントリーレベルのバイオプリンターを用いて、生理的な流体流速、透過性研究、高解像度光学顕微鏡観察、および生理的な剛性を有する細胞外マトリックス支持との適合性を持つ血管を作製し、経済的な曲管モデルシステムを用いて、血流異常に対するヒト血管内皮細胞の応答を研究することが可能となる。

概要

血管の形態は血管機能の重要な指標であり、血管の蛇行や動脈瘤はさまざまな疾患や健康リスクの主要な特徴となります。血管の蛇行は、Marfan1、Turner2、Loeys-Dietz3などの症候群に見られるように先天的な場合もあれば、高血圧、糖尿病、がん、そしておそらく動脈硬化4,5,6を含むいくつかの疾患の特徴として後年に発現する場合もあります。頸動脈7、冠動脈8、大腿動脈9、大動脈10、および脳動脈11を含む動脈組織の動脈瘤は、自然解離や破裂による罹患率および健康リスクに関連しています。血管の蛇行と動脈瘤は、血流の乱れやそれに伴う内皮炎症を引き起こすだけでなく、潜在的な組織機能不全や炎症を示すこともあります。例えば、新生児や小児において、動脈蛇行症は小児脳卒中12、持続性肺高血圧症、および大動脈解離4,13の臨床的予測因子となります。成人では、網膜血管炎において蛇行した網膜血管が見られますが、潜在的な炎症が解消されるにつれてその程度は軽減します14。蛇行がどのように感知され、疾患の進行を促進する異常なシグナルへと変換されるかは、依然として活発な研究分野です。血管の内壁を覆う内皮細胞が、このプロセスにおける一次センサーとして機能すると考えられています。血管の蛇行や動脈瘤によって誘発される乱れた流れや緩やかな流れは、剪断応力を変化させ、炎症シグナル伝達15やバリア機能16における内皮細胞の変化を引き起こします。内皮細胞は、一次繊毛17、メカノセンシティブな接着タンパク質18,19、およびイオンチャネル20,21が関与するメカニズムを通じて流体フローに非常に敏感であり、これが漏出、炎症、および内皮リプログラミングを活性化させるシグナル伝達を駆動します22,23,24。したがって、蛇行した血管形状に対する内皮細胞の応答を研究する手法は、血管治療法の開発にとって重要です。

血管疾患における内皮機能は、in vivo動物モデル、オルガンオンチップ（OOC）システム、およびバイオプリンティング手法を用いてモデル化されてきました。マウスモデルでは、既知の疾患遺伝子の発現制御が可能であり、壁細胞や免疫細胞の関与を含む組織構造や生理機能の複雑性を組み込むことができます。動脈硬化25、マルファン症候群26、およびさまざまな動脈瘤27,28,29のマウスモデルは、血管機能不全に関連する病理への知見を提供します。これらの利点がある一方で、RNAシーケンシングのようなバルク解析手法を除けば、内皮細胞の直接的な観察、実験的な操作、および定量化を実現することは困難です。さらに、動物モデルは倫理的およびコスト的な検討事項があり、種特有の生理機能による制限も伴います。

ヒト内皮細胞の層流および乱流に対する応答を研究するために、2D33,34および3D35,36,37の両方のシステムにおいて、いくつかのin vitro OOCアプローチが開発されてきた30,31,32。広範なOOCに関する文献38の多くは生物医学工学によって推進されており、特定の生物医学的な疑問を解決するための設計機能が盛り込まれている。多くの血管OOCモデルでは、血管構造を制御するためにポリジメチルシロキサン（PDMS）支持体を使用している38。これらのモデルは複雑な形状の高分解能制御を可能にし、肝臓39、脳40、肺41を含む臓器と血管の相互作用のモデル化を可能にする。しかし、依然として限界も存在する。PDMSや同様のポリマーは高分子に対する透過性が低いため、血管バリア機能の研究が制限される可能性がある。加えて、硬化後のPDMSの多くは剛性が約0.8–10 MPaであるが42、代替処方を用いることでより生理的な範囲である8–200 kPaを達成できる43。血管基底膜の剛性の推定値は、血管の種類や測定手法によって約350 Pa44から約70 kPa45まで幅があるが、ほとんどの健康な血管基底膜は2–3 kPaの範囲にある46。動脈硬化や高血圧などの血管疾患は、部分的に細胞外マトリックス（ECM）の剛性増加に関連しており47,48,49,50,51、また内皮細胞はECMの剛性に反応するため、in vitroモデルにおいて剛性を生理的範囲内で制御することは重要である。より最近のOOCアプローチでは、複雑な形状を可能にする生理的基材の使用52,53、臓器機能を再現するための複数種類の細胞の導入39,54,55,56,57や免疫-血管相互作用の導入58、患者固有の血管構造のモデル化59,60、および前臨床段階の薬物開発への支援61,62が行われている。他の細胞種との相互作用を含む多くの微小血管モデルでは、内皮細胞が比較的制御されていない形状で自発的に血管を形成する63。逆に、制御された流れの下で定義された血管形状を可能にするOOCシステムは、多くの場合、相当な工学的インフラ、材料、および専門知識を必要とする53,64。したがって、生理学的に妥当な条件下での血管細胞の挙動の研究を促進するために、専門家以外でも利用可能な堅牢な手法が必要とされている。

生理的なECMハイドロゲルと互換性のあるバイオプリンティングプラットフォームは、さまざまな血管形状における内皮機能の研究のための汎用性の高いin vitroモデルを提供します65。これらの手法では、血管の形状に内皮細胞を含むゲルを直接堆積させるか66、あるいは犠牲インクを用いてECM内に開いた管状の内腔を形成し、その後にインクを溶解させることで、内皮細胞を播種可能な内腔を残す方法が用いられます54。ゼラチン、コラーゲン、フィブリンなどの生物学的互換性を持つECM基質は、血管基底膜に近い剛性（1–3 kPa67）に調整可能であり、in vivoで使用されるものと同様の血管透過性アッセイを可能にします。これらのアプローチは、PDMS作製ほどの形状およびサイズ分解能には達しませんが、湾曲した血管、分岐した血管、および狭窄した血管を生成することができます52,66,68。したがって、このようなプラットフォームは、蛇行血管や動脈瘤血管を含む血管形状のモデリングに適しています。

本手法では、空気圧押し出しベースの3Dプリンティング手法、3次元ミクロン単位のポジショニング、プリントベッドおよびインク充填プリントヘッドの温度制御、および腎血管相互作用チップ用に以前に開発された犠牲インク67,69を使用します。犠牲インクを目的の血管形状にプリントし、直ちにECMに埋め込みます。その後、温度変化によってインクを除去し、開放されたECMルーメンを作成して、そこにヒト内皮細胞を播種します。ベースとなるECMはゼラチンとフィブリンで構成されており、迅速なゲル化とトロンビン介在性のフィブリン重合を可能にすると同時に、多くの血管基底膜に適した機械的剛性を提供します。血管基底膜の組成をより正確に模倣し70,71,72内皮細胞の接着を促進するために、ラミニンやフィブロネクチンなどの追加のECM成分を組み込むことができます。システムは、金属サポート、シリコンゴムガスケット、および高解像度顕微鏡用カバーガラスを含む再利用可能なRoseチャンバー73内で組み立てられ、ルアーロックニードルを介して流体ポンプに接続可能です。あるいは、上下のプレートをポリ乳酸または炭素繊維強化材料を用いた3Dプリンティングで製作することもできます。組み立てられたシステムは、生理的な流体流速によって発生する圧力に耐えることができます。また、パストリゼーション処理により、犠牲インクの物理的特性を変えることなく無菌性を向上させることができます。さらに、ニードルテンプレートとバイオインクを用いたアプローチにより、バイオプリンターなしで動脈瘤を含む直線状の血管を製作することが可能です。得られた内皮化された蛇行血管または動脈瘤血管は、高解像度光学顕微鏡を用いて生理的フロー下で約1週間観察することができ、血管形状の変化に対する内皮細胞の急性反応を調査することが可能になります。

このシステムの大きな利点は、光学顕微鏡との互換性があることです。このプロトコルを用いて作製されたin vitro血管は、いくつかのイメージング手法に適応しており、特にスピニングディスク型またはレーザースキャニング共焦点蛍光顕微鏡に適しています。イメージング条件を選択する際は、空間・時間分解能、感度、および対物レンズの作動距離を考慮する必要があります。本システムで作製されるほとんどの血管において、対物レンズはカバーガラスから約100–300 µmまで到達し、血管の中点を通して撮像できる十分な作動距離を備えている必要があります。オルガネラや細胞接着などの内皮構造の高解像度イメージングや、フロー下でのフィデューシャルビーズの追跡など、高い時間分解能を必要とするライブイメージングには、高開口数（High-numerical-aperture）の対物レンズ が必要です。蛍光ベースの内皮バリア測定など、光子捕捉効率がそれほど高くなくてもよい一部のアッセイでは、10–20×の空気用対物レンズのような低開口数の対物レンズで実施可能です。

本プロトコルでは、生理的な流体フローと高解像度顕微鏡観察をサポートするin vitroシステムにおいて、ヒト血管内皮細胞で構成される蛇行および動脈瘤様血管を作製する方法について説明します。ワークフローには、血管の設計、チャンバーの作製、犠牲インクの調製と3Dプリンティング、ECMの調製とインクの除去、血管内皮細胞の播種とフロー下での培養、血管漏出の評価、フローマッピング、および免疫蛍光染色が含まれます（図 1）。

プロトコル

1. 容器の設計

  1. 顕微鏡対応チャンバーに収まる血管セグメントを選択します。Roseチャンバーを使用する場合、入口リザーバーと出口リザーバーの間隔を1.6cm以内に維持してください。
  2. 造影CT血管造影（図 2A）、磁気共鳴血管造影、または透視血管造影画像をImageJ/FIJIまたはその他の画像解析プログラムにインポートします。
  3. 点計測ツールを使用して、血管の軸中心に沿ったXY座標を定義します。座標をスプレッドシートプログラムにエクスポートします（図 2B）。
    注：CT血管造影由来のSTLファイルは、ほとんどのプリンターソフトウェアに直接インポートできますが、ポリゴンベースの印刷では複数回のパスが必要となり、編み込まれたような形状の血管が生成される可能性があります（付随図1）。シングルパス印刷にはダイレクトG-codeを使用してください。そのため、G-codeによる座標マッピングと設計が推奨されます。付随ファイルのG-code例を参照してください。
  4. スプレッドシートでXY座標を修正し、血管の中心を図形原点に配置します。必要に応じてチャンバーの境界線をインポートし、最終的な造形物がチャンバー内に収まることを確認します。
  5. 血管のXY座標を使用して、最初のプリントレイヤーにおける血管を設計します（図 2C）。血管およびそれに隣接する入口・出口リザーバーを含む第1レイヤーの高さを200µmに設定します。
  6. 針を容易に挿入できる入口および出口リザーバーを作成します。流入時の乱流を最小限に抑え、液体を効率的に血管入口へ導くために、適宜ダイヤモンド型のリザーバーを使用してください（図 2）。
  7. リザーバーが血管と連続した状態で維持されるよう、印刷の第1レイヤーに含めます。入口および出口の針を配置するための十分な容量を確保するため、ベースレイヤーの上に5～9レイヤーを追加します。 G-code設計では、以下の詳細が重要になります：
    1. 温度制御が可能な場合は、プリンターソフトウェアまたはプリントファイル冒頭の適切なG-codeコマンドを使用して、プリントヘッドとプリントベッドを37°Cに設定します。
    2. 複数のプリントヘッドが利用可能な場合は、G-codeでプリントヘッドまたはエクストルーダーを指定します。G-codeは、絶対座標と押出距離を使用するように設定してください。
    3. 針のサイズと形状、インクの流動圧、およびプリントヘッドの速度に基づいてレイヤーの高さを調整します。ここで説明する例では、第1レイヤーより上の各リザーバーレイヤーに200µmのレイヤー高さを適用します。
    4. リザーバーには14～17psiの背圧と6mm/s（G-code: F360）のプリントヘッド速度を使用します。血管の部分では、プリントヘッド速度を15mm/s（G-code: F900）に上げます。
  8. 最終的な血管を印刷する前に、チャンバーなしのガラススライド上で各新しい血管設計をテストしてください。

2. サクリフィシャルインクの調製

  1. 滅菌スターバーを入れた滅菌済みの蓋付き容器に、2.1gのポリエチレンオキシド（PEO）と60mLの冷滅菌水を加え、3.5% w/v溶液を調製する。4°Cで少なくとも48時間撹拌し、粉末が完全に溶解したことを定期的に確認する。
    注：PEO溶液は気密容器に入れ、4°Cで最大1ヶ月間保存すること。
  2. 滅菌スターバーを入れた滅菌済みの蓋付き容器に、17.5gのPluronic F-127と50mLの冷滅菌水を加え、35%溶液を調製する。4°Cで少なくとも48時間撹拌し、粉末が完全に混和したことを定期的に確認する。
  3. 滅菌済みの50mLコニカルチューブに、冷やした3.5% PEOを11.4mL、冷やした35% Pluronic F-127を28.6mL合わせて加える。ロータリーミキサーを用いて4°Cで少なくとも24時間混合する。
  4. チューブを4°Cで一晩直立させて置き、溶液から気泡が上昇して抜けるようにする。
  5. インクの入ったコニカルチューブをウォーターバスに入れ、63°Cで3時間インキュベートする。加熱中は、膨張した空気が逃げるように、キャップをわずかに開けておく。
  6. チューブをウォーターバスから取り出し、室温まで徐々に冷却させる。溶液が冷却した後、キャップをしっかりと締める。
  7. パストゥリゼーション済みのインクを氷上に2分間置き、気泡が入らないように時々静かに撹拌する。
  8. シリンジのプランジャーを外し、針ポートにキャップをして、シリンジ容量の60%–70%まで充填する。プランジャーを挿入し、シリンジを逆さまにして針ポートのキャップを取り外し、内部に溜まった空気をすべて排出する。
    注：充填済みのシリンジは室温で最大1ヶ月間保存すること。

3. Roseチャンバーの作製と配管の準備

  1. アルミニウムから上下のクランププレートを作製するか、提供されたCAD/STLファイルを用いてプレートを3Dプリントする（図2）。高開口数対物レンズがアクセスできるよう、十分に大きな面取りされた底部ポートを設け、カバーガラスをガスケットにしっかりと圧縮して固定するためのネジ用サポート縁を設ける。
    注意：加熱ステージ顕微鏡観察では、アルミニウムの方が熱伝導率が高い。3DプリントしたPLAまたは炭素繊維強化パーツはプロトタイプ作成には適しているが、熱伝導率が低く、繰り返しの加熱により変形する可能性がある。
  2. 38mm × 51mmのクランププレートに合わせてシリコンシートをカットする。18mmのホールパンチを用いて、中央の観察窓を作成する。
  3. 選択したネジ径に適した穴を開ける。完成したガスケットを水で十分にすすぎ、残留したシリコンの破片を除去する。
  4. 金属製クランププレート、ネジ、ナット、およびシリコンガスケットを密閉したアルミホイルポーチに入れ、20分の乾燥サイクルでオートクレーブ滅菌する。
  5. 3Dプリントしたプレートを70%エタノールに1分間浸漬させる。無菌領域でプレートを乾燥させる。
  6. ルアーロックコネクタとインラインチューブクランプを備えた10–30cmのチューブ、適切なペリスタルティックポンプ用チューブ、三方コック、パルスダンパー、および2ポート培地リザーバーを用意する（図3）。
  7. 耐熱性のあるチューブおよびリザーバー部品は、オートクレーブによって滅菌する。オートクレーブ不可の部品は、エタノール処理を用いて滅菌する。

4. 細胞外マトリックス試薬の調製

  1. 37°Cに温めたPBS 12.5mLを1gのヒト血漿フィブリノゲンに加え、80mg/mLのストック溶液を調製する。37°Cでインキュベートし、ボルテックスせずに時々緩やかに撹拌する。
  2. フィブリノゲンが溶解し、濁った溶液になるまで1～2時間置く。溶液を滅菌チューブに分注し、−20°Cで最大3か月間保存する。
  3. マグネチックスターラーを入れた滅菌ボトルの中で、135mLの滅菌PBSに22.5gのゼラチンを加える。70°Cで16時間撹拌し、完全に溶解させるために定期的にボトルを振る。
  4. 1M NaOHを用いて、ゼラチン溶液のpHを7.5に調整する。溶液が温いうちに真空ろ過し、分注して4°Cで最大6か月間保存する。
    注：ろ過前にゼラチンを少なくとも16時間膨潤させること。真空ろ過中のフィルターの目詰まりを最小限に抑えるため、溶液およびろ過装置を37°Cに維持する。
  5. ヒト血漿トロンビンを滅菌PBSに溶解し、1,000 U/mLにする。緩やかに混合して分注し、−20°Cで最大1年間保存する。
  6. 300mgのトランスグルタミナーゼを5mLのPBSに溶解し、時々混合しながら37°Cで1時間インキュベートする。溶液を新しいチューブに滅菌ろ過し、室温で保持する。
    注：トランスグルタミナーゼ溶液は毎日調製すること。粉末のトランスグルタミナーゼは乾燥状態で4°Cで保存する。
  7. 塩化カルシウムを水に溶解し、1M溶液を調製する。溶液を滅菌ろ過し、室温で最大1年間保存する。

5. カバーガラスの準備と活性化

  1. 洗浄済みのカバーガラスをエタノールに浸し、ブンゼンバーナーの炎に注意深く通してエタノールを蒸発させる。
    注意：エタノールは可燃性である。大量のエタノールを裸火から遠ざけ、適切な研究室の防火手順に従って火炎滅菌を行うこと。
  2. ガラスにひびや欠けが入らないように、カバーガラスをステンレス製のラックに配置する。
  3. 水で希釈した0.5% (3-aminopropyl) trimethoxysilaneに、カバーガラスを室温で30～60分間浸漬させる。インキュベーション中は緩やかに撹拌する。
    注意：(3-aminopropyl) trimethoxysilaneを取り扱う際は、適切な化学防護具およびエンジニアリングコントロールを使用すること。
  4. 緩やかに撹拌しながら、水を6回交換してカバーガラスを洗浄する。ラックを移動させる際にカバーガラスが脱落しないように注意する。
  5. ラックを水から取り出し、余分な水分を吸い取り、50°Cで30分間乾燥させる。
  6. PBSで0.5% glutaraldehydeを調製している間に、カバーガラスを室温まで冷却させる。
    注意：Glutaraldehydeは毒性と刺激性がある。適切な個人用防護具を着用し、適切な化学薬品用ドラフトチャンバー内で溶液の調製および取り扱いを行うこと。
  7. 気泡の蓄積を最小限に抑え、均一な活性化を促進するため、カバーガラスを0.5% glutaraldehyde中で緩やかに撹拌しながら60分間インキュベートする。
  8. 滅菌水を3回交換してカバーガラスをすすぎ、室温で自然乾燥させる。
    注：活性化させたカバーガラスは、真空デシケーター内で最大2か月間保存可能である。

6. カバーガラスを細胞外マトリックス基底層でコートする

  1. 1× PBS、ゼラチンストック、およびフィブリノゲンストックを37°Cで30～60分間温める。
  2. 滅菌済みの15cmペトリ皿に清潔なパラフィルムを敷き、表面に70%エタノールをスプレーして余分な液を切り、バイオセーフティキャビネット内で自然乾燥させる。
  3. 15mLコニカルチューブに、温めたPBS 1.68 mL、ゼラチンストック 2.5mL、1M CaCl₂ 12.5µL、フィブリノゲンストック 625µL、およびトランスグルタミナーゼ溶液 167µLを順に加える。
  4. ECM混合液を37°Cの恒温水槽で30分間静置する。
  5. カバーグラス1枚につき、5µLのトロンビンストックを含む1.7mLチューブを1本用意する。
  6. トロンビンチューブにECM調製液 400µLを加え、気泡の形成を最小限に抑えながらピペッティングで1回混ぜる。
  7. 直ちに混合液 200µLを滅菌済みのパラフィルム上に分注し、ピンセットを用いて活性化済みカバーグラス1枚を液滴の上に置く。軽く押さえて完全に覆われるようにする。
    注：このステップは、ECM混合液とトロンビンを混合してから約20秒以内に完了させること。
  8. ペトリ皿に蓋をし、コーティングしたカバーグラスを室温で10分間、続いて加湿インキュベーターにて37°Cで2時間インキュベートする。
  9. パラフィルムをカバーグラスから反対方向に曲げることで、各カバーグラスをパラフィルムから慎重に剥がす。
  10. コーティング直後のカバーグラスを、ゲル面を上にして清潔なペトリ皿に入れ、加湿インキュベーターで保存し、1日以内に使用する。
  11. あるいは、コーティングしたカバーグラスを非加湿インキュベーターで一晩インキュベートし、2日以内に使用する。

7. サクリフィシャルインクのバイオプリントおよびECMによる封入

  1. 血管をプリントする前にテストプリントを行い、インクとプリントパラメータが目的の血管寸法を実現することを確認します。プリントファイルをプリンターソフトウェアにロードします。
    注：25% Pluronic F127/1% PEOインクと32 Gテーパー型ディスペンスニードルを使用すると、ここに記載された条件下で約150µmまでの血管径を安定して作製できます。ガラス上での単純なラインプリントを用いて、プリントヘッドの速度と背圧を最適化してください。
  2. ボトムクランププレート、ECMコート済みボトムカバーガラス、シリコーンガスケット、トップカバーガラスなしのトップクランププレート、および2本のネジを組み立てます。このアセンブリを蓋付きの100 mmペトリ皿に入れ、使用当日まで37 °Cで保持します。
  3. プリントニードルをインクシリンジに取り付け、シリンジを空気圧押し出しプリンターに設置します。プリントステージ、プリントヘッド、および隣接する加熱プレートを37 °Cに予熱します。
  4. セクション6に記載の方法でECMマトリックスを調製し、37 °Cのウォーターバスで保持します。Roseチャンバー1つあたり1.5 mLのマトリックスを、5 mLずつのバッチで調製します。
  5. 各チャンバー用に、滅菌済みの1.7または2 mLチューブに5 µLのトロンビンストックを分注します。追加の活性化済み非コートカバーガラスをバイオセーフティキャビネット内に準備しておきます。
  6. ECMコート済みカバーガラスを含むチャンバーをプリンターステージに配置し、XY原点に中心合わせをします。ニードルを下げて、チャンバーウィンドウの中央でECMまたはガラス表面に接触させ、この位置をXYZ原点として定義します。
  7. ニードルを上げ、最大圧力をかけて内部をインクで完全に満たし、目に見える気泡をすべて排出します。滅菌済みラボティッシュでニードルの先端を拭き取ります。
  8. アップロードしたGコードファイルを使用して、血管およびリザーバーの形状をプリントします。プリント後、直ちにニードルを上げ、チャンバーを取り出します。
  9. プリントされた血管に気泡や不連続部がないか確認します。どちらかの欠陥がある構造体は破棄し、再プリントしてください。
  10. チャンバーを37 °Cの加熱プレートに置き、ネジとトップクランププレートを取り外して、調製したECMマトリックス1 mLとトロンビン分注液をピペッティングで1回混ぜ合わせます。
  11. 活性化させたECM混合液を、気泡を導入しないように血管チャンバーへ移し、直ちに活性化カバーガラスをECMの上に裏返して配置します。トップクランププレートを戻し、締めすぎない程度にネジをしっかりと締めます。
  12. 完成したチャンバーを蓋付きの100 mmペトリ皿に入れ、37 °Cで2時間インキュベートします。

8. ワイヤーテンプレートを用いた動脈瘤の作製

  1. 21ゲージの針をシリコーンガスケットの反対側に挿入し、位置を合わせます。
  2. 15 mLコニカルチューブに入れ、1% BSAを含むPBS中で、直径0.0190インチの304ステンレス製医療用マンドレルワイヤーを超音波洗浄します。ワイヤーを取り出し、バイオセーフティキャビネット内の滅菌ペトリ皿で自然乾燥させます。
  3. BSAでコーティングされたワイヤーを、ガスケットにある両方の針に通します（図 2）。後の回転を容易にするため、突き出た端の一方をわずかに曲げます。
  4. ガスケット、針、ワイヤー、およびクランププレートの組み立て体をアルミホイルポーチに入れ、オートクレーブで滅菌します。
  5. 針/ガスケットの組み立て体を、活性化されECMでコーティングされたカバーガラスの上に配置します。
  6. パストライズしたPluronic/PEOインクが入ったシリンジに21 Gの針を取り付けます。
  7. チャンバー中央のワイヤーの側面に、犠牲インクを少量滴下します。密封するため、各針とワイヤーの接合部にインクを少量滴下します。
  8. ECM混合液を調製し、セクション7.10～7.12の説明に従ってチャンバーを組み立てます。
  9. ECMがゲル化した後、ワイヤーの曲がった端をゆっくりと回転させて、ECMと犠牲インクから切り離します。デバイスからワイヤーをゆっくりと引き抜きます。
  10. 200 µLピペットを用いて、入口側の針にPBSを満たし、ルミナ（内腔）を通してPBSを排出させます。この操作をもう一度繰り返し、セクション9に進みます。

9. 容器チャンバーから犠牲インクを洗い流す

  1. 抗生物質を添加した冷（4 °C）PBSを含むリザーバーにチューブを接続し、三方コックを組み込み、チューブの末端にオス・ルアーロック継手と滅菌済み23 G針を装着する。
  2. ストップコックシリンジを用いて、PBSが針の内腔から出るまで供給チューブに冷PBSを満たす。チューブをクランプする。
  3. 2本目のチューブにPBSを満たし、末端に23 G針を装着する。チューブをクランプし、充填用シリンジを取り外す。
  4. 供給用針をガスケット経由で入口リザーバーに、排水用針を出口リザーバーに挿入する。倒立顕微鏡または実体顕微鏡を用いて、正しく配置されていることを確認する。
  5. アセンブリを4 °Cに移動させ、供給リザーバーを入口から30 cm上に配置する。出口リザーバーは、廃棄容器上の容器出口針から5～10 cm下に配置する。
  6. クランプを外し、少なくとも250 mLの冷PBSをチャンバー内に流す。フラッシング中に、システムに漏れや気泡がないかを確認する。

10. 血管腔内をさらなるECM成分でコーティングし、前処理する

  1. フィブロネクチンを20 µg/mLに、ラミニンを10 µg/mLに、または基底膜マトリックスを1:30の希釈倍率に、3 mLのPBSで希釈する。
  2. 調製したばかりのトランスグルタミナーゼを、希釈したECM試薬に加える。
  3. 血管の直近にあるチューブを、入口および出口に接続したままにする。
  4. 1 mLシリンジを用いて、ECM/トランスグルタミナーゼ溶液を血管内にゆっくりと注入する。3 mLすべてが血管を通過するまでこれを繰り返す。
  5. コネクタをクランプし、入口と出口を滅菌済みのルアーキャップで密閉し、37 °Cで1時間から一晩インキュベートする。
  6. ペニシリン/ストレプトマイシンを含む完全血管内皮細胞培地100 mLで血管内を洗浄する。チューブコネクタをクランプし、出口をキャップで密閉する。
    注：培地を満たした血管を4 °Cで最大1週間保存できる。管腔内に気泡が残っていないことを確認すること。

11. 容器への細胞播種

  1. ECM血管テンプレートが入ったチャンバーを37 °Cで2時間インキュベートする。ペニシリン/ストレプトマイシンを含む完全内皮細胞培地を37 °Cに温めておく。
  2. 10 cm培養皿1枚またはT75フラスコ1本の内皮細胞をトリプシン処理し、完全培地でトリプシンを中和する。懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、細胞計数用に分注して取り出す。
  3. 細胞を1,000 × gで5分間遠心分離する。ペレットを再懸濁し、5 × 106 cells/mLの細胞懸濁液を150 µL調製する。
  4. 流出チューブを滅菌済みの廃棄リザーバーに接続し、チューブクランプを閉じたままにする。
  5. 流入チューブを取り外し、流入針ハブから残った培地を除去する。血管を垂直に保持し、細胞懸濁液を針ハブにピペットで注入する。
  6. 流出クランプを緩め、細胞懸濁液を血管内に流入させる。懸濁液がすべて管腔に入った後、再び流出側をクランプする。
  7. 温めた完全培地を流入針ハブに加え、滅菌済みルアーキャップで閉じる。流出側を切り離してキャップを付ける。
  8. チャンバーを正立させた状態で37 °Cで3時間インキュベートする。
  9. セクション11.5～11.8を繰り返し、チャンバーを倒立させた状態で37 °Cで3時間インキュベートする。
  10. 完全培地1 mLで血管内を穏やかにフラッシュし、37 °Cで3時間インキュベートする。
  11. 顕微鏡で内皮細胞の接着を確認し、新鮮な培地で接着していない細胞を穏やかに洗い流した後、37 °Cで12～24時間インキュベートする。

12. フロー下での容器内の培養

  1. 完全培地 200 mL を 1 時間温め、滅菌フィルターユニットを用いて真空脱気を行う。その後、加湿 CO₂ インキュベーター内で培地を再加温する。
  2. 滅菌済みのバイオセーフティキャビネット内で、培地リザーバー出口、三方活栓、ポンプチューブ、パルスダンパー、バブルトラップ（任意）、入口チューブ、ベッセルチャンバー、出口チューブ、および培地リザーバーへの戻りチューブを順に接続する（図 3）。
  3. 流路回路全体に培地を満たしてプライミングを行い、気泡やエアポケットが残っていないことを確認する。
    注：再接続する前に、コネクターとニードルハブに液体を満たすこと。細胞を播種したベッセルに気泡が混入すると、急激なせん断力によって血管内皮細胞が脱落する可能性がある。
  4. アセンブリを 37 °C のインキュベーターに移し、ベッセル内に 1 dyn/cm2 の流速を開始する。この流れを 12 時間維持する。
  5. 流速を上げ、12–16 dyn/cm2 のせん断応力を発生させ、ダウンストリームアッセイを行うまで 18–24 時間維持する。使用するベッセルに必要な流速を算出するには、プリントされたベッセルの長さと平均直径を測定する。オンライン計算機を使用し、測定したパラメータを入力するとともに、円形断面、10% serum 含有培地、およびチューブ抵抗は無視できる（チューブ径がプリントベッセルよりも十分に大きいため）として設定する。
    注：フローコンディショニング後、できるだけ速やかにベッセルを使用すること。1 週間を超えて培養すると、血管内皮細胞の脱落や内皮プロテアーゼによる ECM の修飾に伴い、細胞間に隙間が生じる可能性がある。

13. 血管透過性アッセイの実施

  1. Alexa 647標識BSAまたは10 kDa Alexa 647デキストランを35 mLの完全培地に加え、最終濃度が5 mg/mLになるようにします。この溶液を37 °Cに温めます。
  2. 250 ng/mL TNFαなどの試験剤を用いて、血管を1〜2時間前インキュベートし、アッセイ培地にも同剤を加えます。
  3. 37 °Cのウォーターバスを準備し、ポンプを顕微鏡の近くに配置します。顕微鏡、撮像ソフトウェア、およびステージ加熱システムを起動し、イメージングの30分前にステージを37 °Cに平衡化させます。
  4. インキュベーター内の流れを止め、培地リザーバーを取り外し、チャンバーと関連するチューブを予熱した顕微鏡ステージに移動します。
  5. ポンプを、未標識培地を含むガラス製マイクロピペットが装着された約20 cmのチューブに接続します。マイクロピペットチューブを蛍光リポーター培地に挿入し、流出口チューブを回収容器に入れます。
  6. ポンプを0.2 mL/minに相当する流速に設定し、イメージングの準備が整うまでフローを開始しないでください。
  7. 位相差イメージングを用いて血管の中心線に焦点を合わせ、647蛍光チャンネルに切り替えます。セクション13.6で設定した速度でフローを開始し、予想される応答時間に応じて1〜5分ごとに画像を撮像します。
  8. 取得した画像からカイモグラフを作成し、しきい値を適用した強度値に線形スロープを当てはめます。漏出量を、リポーターが血管外表面から1分間に移動した距離（µm）として報告します。

14. 流体フローのマッピング

  1. 10 µm 蛍光ビーズを1分間ボルテックスした後、バス型超音波洗浄機で1分間ソニケーションする。完全培地10 mLを用いて、ビーズを1.8 × 105beads/mLに希釈する。
  2. セクション13に従い、血管漏出アッセイ用に顕微鏡ステージ上のフローシステムを構成する。流出液回収容器を設置し、流速を0.2 mL/minに設定する。
  3. 適切な作動距離を持つ対物レンズを用いて、血管の中心面に焦点を合わせる。露光時間、検出器の感度、励起強度、および集光効率で許容される最大限の実用的周波数で画像をキャプチャする。
  4. 粒子画像流速測定法（PIV）ソフトウェアを用いて、タイムラプス画像シーケンスを解析する。

15. 内皮細胞化された血管の固定および免疫染色

  1. 10 mM CaCl₂および10 mM MgCl₂を含むPBSで、4%パラホルムアルデヒド溶液を40 mL調製する。
    注意：パラホルムアルデヒドは毒性がある。パラホルムアルデヒド含有溶液の調製および取り扱いは、適切な個人用保護具を着用し、適切な化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うこと。
  2. フローを停止させ、入口チューブをクランプしてポンプから切り離し、血管漏出アッセイに使用した吸引チューブに接続する。吸引チューブを固定液に挿入し、重力により35 mLの固定液を血管内に通過させる。
  3. チューブをクランプし、固定液中で室温にて30分間インキュベートする。
  4. 0.4% Triton、20 mM PIPES (pH 6.1)、138 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl₂、2 mM EGTA、および5.5 mM glucoseを含む透過化バッファー25 mLを重力により血管内に流す。チューブをクランプし、室温で10分間インキュベートする。
  5. 1% BSA、0.05% Tween 20、20 mM Tris (pH 7.4)、140 mM NaCl、および5 mM KClを含むブロッキングバッファーを血管内に流す。室温で2時間、または4 °Cで一晩インキュベートする。
  6. 選択した一次抗体をブロッキングバッファー100–500 µLで1:50–1:500に希釈する。入口チューブを取り外し、セクション11の細胞播種で説明した手順を用いて抗体溶液を導入する。
  7. 血管を4 °Cで一晩インキュベートする。
  8. 入口チューブを再接続し、20 mLのPBSで血管内を洗浄する。
  9. 適切な二次抗体をブロッキングバッファーで1:200–1:1,000に希釈し、必要に応じて蛍光ファロイジンを1:250で添加する。セクション15.6で説明した手順を用いて溶液を導入し、室温で2時間インキュベートする。
  10. 40 mLのPBSで血管内を洗浄し、チューブクランプを閉じてチューブにキャップをする。
    注：染色した血管は4 °Cで保存し、2週間以内にイメージングを行うこと。
  11. F-アクチンを蛍光ファロイジンで、ゴルジ体をanti-GM130で、核をDAPIで染色する。
  12. FibrilTool74を用いてファロイジンの画像を解析し、F-アクチンストレスファイバーの平均的な配向を決定する。
  13. 各核の重心とゴルジ体の重心の間の軸を決定する。得られた配向を、既報75のとおり数値計算ソフトウェアを用いて解析およびプロットする。

結果

犠牲インクを用いてさまざまな管状組織をプリントする手法は、多くの研究グループによって確立されており、特にLewis研究室では、血管とともに腎尿細管を作製しています67,76。同様のアプローチが、肺胞構造77や血管新生を伴う腫瘍78のプリントにも利用されてきました。本研究では、これらの手法を応用して、生理的な流体フロー下での内皮細胞の応答を調査するための血管形状を生成しました（図 2）。血管形状は、血管画像から座標マップへと変換され、続いてプリントパスを定義するためのGコードへと変換されました（図 2A–C）。この手法により、蛇行血管や動脈瘤によって内皮機能や細胞骨格の構築がどのように変化するかを研究するための血管テンプレートの作製が可能になりました（図 2D–G）。また、機械加工サービスの利用を不要にするため、3Dプリント可能なRoseチャンバー設計も組み込まれました（図 2H）。血管プリント用のGコードファイルの例を補足ファイル 1に、対応するRoseチャンバーおよびステージマウントのCADファイルをそれぞれ補足ファイル 2および補足ファイル 3に提供しています。STLベースのプリントでは、プリントヘッドを複数回通過させる必要がある場合があり、その結果、ルーメンが分離した編み込み状の血管形状になることがあります（補足図 1）。構築されたプラットフォームは、バイオエンジニアリングの専門知識が最小限であっても血管細胞生物学者が利用でき、かつ生理的な圧力と流量をサポートし、高解像度顕微鏡へのアクセスを可能にするように設計されています（図 2I）。

血管の作製と細胞化の後、制御された培地循環を可能にするため、血管デバイスを閉ループ灌流システムに組み込んだ（図3）。このシステムは、ペリスタティックポンプ、プライミング用シリンジに接続された三方活栓、バブルトラップ、パルスダンパー、血管デバイス、および培地リザーバーで構成され、これらが流路内で順次配置されていた（図3A）。この構成により、システムのプライミング、気泡の除去、およびペリスタティックポンプによって生じる脈動の抑制を行うコンポーネントを組み込みつつ、構築した血管内に培地を連続的に循環させることができた。組み立てられたシステムは、図3Bに示すように、血管デバイスを実験セットアップ内に配置して動作させることができ、制御されたフロー条件下での細胞化血管へのその後の灌流に適した実用的な構成となった。

前述の犠牲インクの手法に対する1つの変更点は、プリント前にインクをパストリゼーション（低温殺菌）したことである。既報のインク調製プロトコルを適用したところ、培養物にカビの汚染が生じたため、この変更が必要となった。本用途に使用される他のプルロニックベースのインクと同様に、25% Pluronic F127/1% PEOインクは低温では液状を維持し、温度が上昇すると密充填ミセルゲルへと転移する。この処方の転移温度は 15°C、これはインキュベーター温度での構造のテンプレート作成および、〜でのインクの除去に便利である 4°C純粋なPluronicと同様に、この材料もプリント温度において顕著な剪断減粘性を示します（図4A）。しかし、低温であっても、このインクは粘度が高すぎるため、標準的な組織培養用フィルターと真空ポンプを用いたフィルター滅菌を行うことができません。このインクは、以下の温度でのパストリゼーション（低温殺菌）によって滅菌することが可能ですが、 70°C 20秒間、またはそれ以上の時間で、これらの温度はインクを不可逆的に変化させ、印刷温度における粘度を低下させます（データは示さず）。より低温で、より長時間の加熱殺菌を 63°C ～のために >1時間の処理により、印刷に適した温度におけるインクの複素粘度を変化させることなく、真菌およびその他の微生物による汚染を低減できる。25 mmのコーンプレート型ジオメトリを備えたレオメーターを用いたレオロジー特性評価により、印刷温度におけるさまざまな変形速度の範囲において、未処理のインクとパストリゼーション処理済みのインクが同様の粘度を示すことが明らかになった（図 4B）、これにより、パストリゼーション（低温殺菌）がプリント性能を損なわないことが示された。また、パストリゼーション済みのインクを使用することで、血管内皮機能に影響を及ぼす可能性のある抗真菌薬を用いることなく、より長期的な血管培養が可能になる。

血管の細胞化が完了すると、図に示すように、コンフルエントな内皮細胞が血管全体を覆っているはずです。 図5、および〜における最大強度投影法（MIP）を用いて 図5A および～における断面 図5Bその後、培地の流量を生理学的なせん断速度まで増加させることができます。ほぼ円形の管におけるせん断速度は、ハーゲン・ポアズイユ式を用いて推定可能です。79実際には、目的のせん断応力を達成するために必要な流速は、培地の粘性とマイクロ流路の抵抗を考慮することで推定できます。一般的な2次元培養では in vitro、12 dyn/cm²の培地流速2ほとんどの血管内皮細胞型において、流れの軸に沿った配向を誘導します。この反応は、F-アクチンの蛍光ファロイジン染色によって可視化できます（図5D,E)またはゴルジ体-核軸の解析により（図5D,F）、これらはいずれも、既報の通り内皮細胞の極性と一致する異方性配向を示している18せん断応力が40 dyn/cm²を超えると2 発生する in vivo、そのような条件はここではモデル化していません。

血管幾何学の変化による主要な結果は流体フローの変化であり、内皮細胞はいくつかのシグナル伝達経路を通じてこれに反応します80,81。血流速度をモニタリングするための方法として、4Dドップラー超音波82、4D flow磁気共鳴画像法83、レーザースペックル画像法84など、いくつかの手法が利用可能です。これらの技術は in vivo において重要な利点を提供しますが、単一の血管における局所的なフローの差を解明することは困難な場合があります。本プラットフォームの高開口数イメージング能力により、直接的な蛍光粒子追跡（図 6B）や、粒子画像流速計（PIV）を用いた血管曲率によって誘導されるフロー異常の高空間分解能マッピング（図 6C）が可能になります。例えば、血管の外側曲率よりも内側曲率に沿って血流が遅くなることが観察され（図 6C）、これが内皮反応の変化に寄与している可能性があります85。

コンフルエントな血管が構築された後、管腔内にデキストランやタンパク質などの蛍光標識高分子を灌流させることで、開通性とバリア機能などを評価できる。HUVECで裏打ちされた開通血管は、蛍光標識デキストランの透過に抵抗する(Figure 6D,F)。対照的に、TNFαなどのバリア破壊刺激に曝露させると、血管漏出が増加する(Figure 6H, J)。局所的な漏出速度は、カイモグラフ解析を用いて可視化できる(Figure 6E,G,I,K)。カイモグラフのX軸は距離、Y軸は時間を表しているため、分画した蛍光強度にフィットさせた直線の傾きを定量化することで、相対的な漏出速度を比較できる(Figure 6E,G,I,K)。これらの解析により、特定の刺激に対する内皮バリア機能に局所的な血管幾何学構造がどのように影響するかを評価することが可能となる。

このプラットフォームの主な利点は、in vivoで可能な範囲と比較して、顕微鏡によるアクセスが向上していることです。また、本システムは血管内皮の分子組織、特にアクチン細胞骨格の免疫組織化学的解析を容易にします。血管内皮細胞は非常に薄く、in vivoでは平滑筋細胞に囲まれているため、内皮細胞内に特異的な細胞骨格構造を局在化させることは困難な場合があります。このプラットフォームでは、血管内皮細胞における接着分子およびフィラメント状アクチンの簡便な染色とイメージングが可能であり（図5）、生理学的フロー条件下での内皮細胞の極性化や分裂の評価など、in vivoでは困難な多成分解析をサポートしています（図5D–F）。これらのアッセイを単一のプラットフォームで組み合わせることで、血管の形状、血流の変化、バリア機能、内皮の分子組織、および細胞間接着の相互関係を直接的に検討することが可能になります。

figure-results-1
図1: チップ上での3D血管のプリントおよび利用のワークフロー。チップ上の3D血管の作製および利用に関するプロトコルのフローチャート。黒い円は対応するプロトコル番号を示す。ボックスの色は、各プロトコルの実施温度またはサンプルのインキュベーション温度を示す。ワークフローには、血管形状のモデリング、インクの調製、細胞外マトリックス（ECM）の調製、チャンバーの準備、血管のプリント、血管のフラッシングおよびコーティング、細胞導入、フロー培養、機能解析、および組織学的解析が含まれる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2: 血管のプリントおよびチャンバーの設計。 血管は、患者固有の血管形状を再現するためにin vivo血管画像から設計することができる。（A）造影コンピュータ断層撮影（CT）により撮影された小冠状血管。Parekhら86の許可を得て再現。スケールバー = 2 mm。（B）FIJIのポイントレコーディングによって作成された、パネルAに示した血管の一部における基準点の座標マップ。（C）プリンター制御ソフトウェアを用いて座標マップから生成されたGコード出力。右下にX、Y、Z座標を示す。（D）バイオプリントされた血管を含むRoseチャンバーの概略図。上部のサムナットを備えた設計は、3Dプリントされたポリ乳酸（PLA）チャンバーと互換性がある。（E）ECMコーティングされたカバーガラス上に、犠牲バイオインクでプリントされた血管およびリザーバーを含むRoseチャンバー。スケールバー = 9 mm。（F）動脈瘤モデル用に構成されたRoseチャンバーの概略図。入口および出口の針に通されたワイヤーが血管のテンプレートとなり、ワイヤー上に堆積させた犠牲バイオインクが動脈瘤のテンプレートとなる。（G）ECMコーティングされたカバーガラス上に、ワイヤーと犠牲バイオインクのテンプレートを含むRoseチャンバー。（H）3DプリントされたPLA顕微鏡ステージアダプター（左）およびRoseチャンバー（右）。これらは機械加工されたアルミニウム部品の代替となる。ステージアダプター上の金属クランプはアダプタープレートに固定されている。スケールバー = 30 mm。（I）入口および出口の針とチューブが接続され、顕微鏡ステージに設置されたアルミニウム製Roseチャンバー内の、プリントおよびフラッシュ済みの血管。スケールバー = 20 mm。略語：CT = computed tomography（コンピュータ断層撮影）、ECM = extracellular matrix（細胞外マトリックス）、PLA = polylactic acid（ポリ乳酸）。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-3
図3Roseチャンバー内における細胞化血管のための流体流動システム (A) 細胞化された血管を含むRoseチャンバー内に流体フローを構築するために使用したチューブ構成の概略図。矢印は流れの方向を示す。番号付きのコンポーネントは、(1) ペリスタルティックポンプ、(2) プライミング用シリンジ付き3方活栓、(3) バブルトラップ、(4) パルスダンパー、(5) 血管デバイス、(6) 培地リザーバーである。培地に接触するすべてのコンポーネントは、使用前に滅菌処理を行う。 (B) 組織培養インキュベーター内のローズチャンバーに設置された、細胞化血管を含む流体流動システム。数字はパネルAに示す構成要素に対応する。安定性を確保するため、流入および流出針はテープで固定されている。スケールバー = 40 mm。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4: 犠牲バイオインクのレオロジー特性評価。(A) 5 °C、10 °C、14.4 °C、15 °C、および 23 °C における、非パストリゼーション処理済み 25% Pluronic F127/1% ポリエチレンオキシド (PEO) インクのせん断速度に対するせん断粘度の変化。(B) 25 °C および 37 °C における、非パストリゼーション処理済みおよびパストリゼーション処理済み Pluronic F127/PEO インクの角周波数に対する複素粘度の変化。略語：PEO = ポリエチレンオキシド。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-results-5
図5: 固定および染色した内皮化血管のイメージングと定量分析。 (A) 初期播種後、低せん断応力（1 dyn/cm2）下で培養し、完全に細胞化した血管の回転円盤共焦点蛍光画像の最大強度投影図。血管はVE-cadherin（緑）、F-actin（赤）、およびDAPIによるDNA（青）で染色されている。スケールバー = 50 µm。 (B) F-actinをラベルするための蛍光ファロイジンで染色した、完全に細胞化した血管の回転円盤共焦点蛍光画像zスタックの再構成xz断面図。スケールバー = 50 µm。 (C) 12 dyn/cm2で24時間のフロー後における、完全に細胞化した血管の回転円盤共焦点蛍光画像zスタックの最大強度投影図。F-actinは蛍光ファロイジン（赤）でラベルされている。スケールバー = 100 µm。 (D) 16 dyn/cm2のせん断応力下で24時間培養した後の血管領域の回転円盤共焦点蛍光画像。血管はVE-cadherin（黄）、F-actin（マゼンタ）、ゴルジ体マーカーGM130（緑）、およびDAPIによるDNA（青）で染色されている。矢印はフローの方向を示す。スケールバー = 30 µm。 (E) FibrilTool74を用いて、パネルDのF-actinチャネルから算出した平均ストレスファイバー配向の代表的な定量結果。面積1,600 µm2の領域45箇所からなるグリッドを分析し、平均ファイバー配向をフロー方向に対する放射状ヒストグラムとして表示している。 (F) 内皮細胞の極性の指標として、パネルDから算出した核-ゴルジ軸の代表的な定量結果。各核の中心から対応するゴルジ体中心へのベクトルを、フロー方向に対する放射状ヒストグラムとしてプロットしている。n = 75 vectors。略語：DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6流体フローおよび血管漏出の解析 (A) パネルB～Kの解析に使用した血管形状の模式図。文字は、それぞれのパネルに対応する血管のおおよその領域を示す。 (B) 曲がった血管領域を流れる蛍光ビーズのタイムラプス回転円盤共焦点蛍光画像シーケンスを、色で時間軸を符号化した時間投影法で示したもの。色はフレーム番号（1から100）を示しており、外側および内側の曲率が示されている。 (C) 湾曲血管領域における相対流速を示す粒子像流速測定法（PIV）解析。色は相対速度を表し、矢印は流れの方向と大きさを的に示す。スケールバー = 50 µm. (D–G) Alexa 647標識10 kDaデキストランを灌流させた未処理血管の代表的な血管バリアアッセイ。 (D,D′,D″) それぞれ0分、70分、150分に取得した直管領域の画像。白線はパネルEのカイモグラフに使用した領域を示す。(EパネルDの直線領域のカイモグラフ。漏出率は 0.39 µm/min、これは破線の傾きである。 (F,F′,F″) 0、70、および150分に取得した湾曲血管領域の画像。白線はパネルGのカイモグラフに使用した領域を示す。スケールバー = 150 µm. (G）パネルFの湾曲領域のカイモグラフであり、以下の漏出率を示している。 1.01 µm/min、これは破線の傾きである。（H–K250 ng/mLの腫瘍壊死因子アルファ（TNF）で前培養した後の代表的な血管バリアアッセイα). (H,H′,H″) それぞれ0分、200分、400分に取得した直線血管領域の画像。白線はパネルIのカイモグラフに使用した領域を示す。スケールバー = 250 µm. (IパネルHの直線血管領域のカイモグラフ解析により、漏出率は以下の通りであることが示されました。 2.1 µm/min、これは破線の傾きである。（J,J′,J″) 0、200、および400分に取得した湾曲血管領域の画像。白線はパネルKのカイモグラフに使用した領域を示す。スケールバー = 250 µm. (KパネルJの湾曲した血管領域のカイモグラフ解析により、漏出率が次のように示されました。 6.7 µm/min、これは破線の傾きである。パネルD〜Kのアスタリスクは、カイモグラフを作成するために使用した線の対応する端点を示している。略語：PIV = 粒子像流速計；TNFα = 腫瘍壊死因子アルファ この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1：STLベースのプリンタープログラミングを用いた血管プリント。 (A) STLベースのプリンタープログラミングを用いて作製されたプリント血管の微分干渉コントラスト像。プリンターヘッドに2回パスさせることで、編み込まれた血管構造が形成されている。スケールバー = 250 µm。 (B) Alexa 647標識したウシ血清アルブミン（BSA）を満たし、フラッシングした編み込み血管の3Dレンダリング像。2本の編み込まれたストランドのルーメン間に隙間が確認できる。スケールバー = 100 µm。略語：BSA = ウシ血清アルブミン、STL = standard tessellation language。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1：ベッセルプリント用Gコード こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル2：RoseチャンバーのCAD図面 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足資料 3：ステージマウントアダプターのCAD図面 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

蛇行血管、動脈瘤、分岐点など、乱れた血流に関連する血管幾何学構造をモデル化するための堅牢なシステムについて解説します。本手法は、バイオエンジニアリングの経験が少ない細胞生物学者でも利用可能なプラットフォーム内で、高解像度イメージング、血流マッピング、および血管バリア機能の評価を可能にします。主要なアプローチにはバイオプリンターが必要ですが、市販の押出成形方式プリンターには、オープンソースシステムから複数のプリントヘッドを備えた高度なプラットフォームまで幅広く存在します。プリンターの主要な機能には、プリントヘッドおよびインクの温度制御、精密な圧力調節、およびプリントベッドの温度制御が含まれます。バイオプリントによる蛇行血管や分岐血管に加えて、本手法にはバイオプリンターなしで作製可能な動脈瘤モデルも含まれています。これらのアプローチを組み合わせることで、細胞生物学研究室で一般的に利用可能な顕微鏡法を用いて、蛇行血管における血管内皮細胞機能の解析が容易になります。

血管機能を研究するために、数多くのin vitroモデルシステムが利用可能であり87,88、それぞれに異なる長所と限界があります。先行研究54,67,69を適応させた本システムは、患者由来の血管形状を直接的にモデル化し、単一のデバイス内で血管の曲率を系統的に変化させることができるため、血管の蛇行が内皮機能に及ぼす影響を調べるのに特に適しています。他の手法では、光硬化性ゼラチンメタクリレートを用いて、生理学的フロー条件下で縮小した血管構造を生成し、患者の冠動脈をモデル化した例があります60。このようなシステムは、正確な血管モデル化、フロー解析、および中膜層を組み込む可能性を提供します。しかし、全体のサイズやガラス製支持体の必要性により、高解像度イメージングや局所的なリークアッセイが制限される場合があります。対照的に、iPSC由来内皮細胞の自己組織化に基づく小型システムでは、高解像度イメージングが可能であり、内皮細胞と血管平滑筋細胞の両方を組み込むことができます89。しかし、これらのモデルは血管形状の制御能が低く、高い流速やせん断速度を確立することが困難な場合があります。したがって、本システムは、定義された血管形状と血管蛇行の高解像度イメージングを組み合わせた、実用的な中間的アプローチとなります。

本プラットフォームの大きな利点は、湾曲部と直線部の両方を含む血管を生成できることであり、これにより、他の実験変数を一定に保ったまま、同一サンプル内で局所的な血管形状を直接比較することが可能になります（図6参照）。もう一つの利点は、アンギオグラフィーや造影CTで得られた患者由来の血管画像を使用できることです。患者の血管を再現する際の主な制限はサイズです。直径150µm未満の血管は再現性高くプリントすることが困難であり、一方で数センチメートル以上にわたる血管セグメントには、より大きなマウントチャンバーが必要となります。また、血管セグメントは3次元的に比較的平坦である必要があり、これによりベースマトリックス層へのプリントが可能となり、顕微鏡イメージング中に目的レンズの作動距離内に維持することができます。

今後の研究において、本論文で述べたシステムをさらに改良し、血管の形状が病態生理に寄与する可能性がある動脈硬化などの疾患をモデル化できる可能性があります。生理学的な複雑性を高めるために、遺伝子改変内皮細胞や、平滑筋細胞および免疫細胞を含む追加の細胞種を組み込むことが考えられます。より単純なシステムで実証されているように、内皮層の下に平滑筋細胞を組み込むことで、血管の蛇行や疾患における平滑筋と内皮の相互作用について、さらなる知見が得られる可能性があります90。また、腫瘍細胞を導入して脈管内侵入68,91およびこのプロセスに対する蛇行の影響を調査するなどの追加的な改良も考えられます。本プラットフォームは、乱れた血流が炎症反応をどのように変化させ92,93、COVID-19などの感染症に関連する血管合併症にどのように寄与し得るかを検討するためにも利用できるでしょう94。ヒトの健康と疾患における血管系の広範な関与を考慮すると、このような簡便なシステムは、多様な疾患状況における内皮機能のさらなる研究を促進するものと期待されます。

開示事項

コンテンツの内容は完全に著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所（NIH）の公式な見解を表すものではありません。著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

著者は、本研究の初期探索における助言をいただいたハーバード大学のJennifer Lewis研究室のメンバーと、フィードバックおよび助言をいただいたWaterman研究室のメンバーに感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778ECM付着前のガラスカバースリップのシラン化および活性化に使用される。
1mL滅菌シリンジFisher Scientific14-823-434試薬の添加、容器のコーティング、および液体操作に使用される。
1xリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.AP試薬調製、洗浄、および容器のフラッシングに使用されます。
10mL滅菌済みシリンジFisher Scientific14-955-459試薬の調製および液体の移送に使用します。
キャップ付き15mLコニカルチューブFisher Scientific05-538-59A試薬の調製、細胞の操作、および溶液の保存に使用されます。
150mmポリスチレン製ペトリ皿Fisher ScientificFB0875714滅菌済みの作業用または培養用容器として使用する。
21G針Fisher Scientific14-817-227容器テンプレートの調製およびチャンバーへのアクセスに使用します。
23G針Fisher Scientific14-817-237フラッシングおよび灌流時の血管入口および出口の接続に使用します。
27Gクリアテーパー分注針Nordson7018417犠牲インクの押出および印刷中の気泡の可視化に使用されます。
3mL 滅菌シリンジFisher Scientific14-955-459液体の移送および試薬の注入に使用します。提供されているカタログ番号は10 mLシリンジのものとしても記載されているため、カタログ番号を確認してください。
直径0.0190インチ、304ステンレス鋼製医療用マンドレルワイヤーコンポーネント供給GWX-0190-36ワイヤーベースの動脈瘤モデルにおける直線管の取り外し可能なテンプレートとして使用。
キャップ付き50mLコニカルチューブFisher Scientific05-526B試薬の調製、混合、低温暖滅、および保存に使用されます。
Alexa 488 反マウス二次抗体Thermo Fisher ScientificA32723TR免疫染色に使用される蛍光二次抗体。
Alexa 555標識抗ウサギ二次抗体Thermo Fisher ScientificA-21428免疫染色のために使用される蛍光二次抗体。
Alexa 647標識ウシ血清アルブミンThermo Fisher ScientificA34785血管バリア／漏出アッセイに使用される蛍光高分子トレーサー。
Alexa 647標識デキストラン, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914血管内皮バリア機能および血管漏出の評価に使用される蛍光トレーサー。
Alexa 647-ファロイジンThermo Fisher ScientificA22287細胞骨格のイメージングおよび配向解析のために、F-アクチンを蛍光標識するために使用される。
ウシ血清アルブミン、分画V、脂肪酸フリーSigma-Aldrich126575-10GMタンパク質含有溶液のブロッキングおよび調製に使用されます。
抗生物質・抗真菌剤, 100倍濃縮Thermo Fisher Scientific15240062ECMおよび培地用の任意の抗菌剤添加物。
抗GM130抗体、クローン4A3Sigma-AldrichMABT1363内皮細胞の極性解析のためにゴルジ体を標識するために使用した一次抗体。
抗VE-カドヘリンウサギモノクローナル抗体、D87F2Abcam65707血管内皮細胞間の接合部を可視化するために使用した一次抗体。
塩化カルシウムSigma-AldrichC7902ECM調製および固定バッファーに使用されます。意図した試薬が無水塩化カルシウムであるか、または含水塩化カルシウムであるかを確認してください。
コネクタキットWorld Precision Instruments504954マイクロ流体灌流回路の組み立てに使用されるルアー・チューブコネクター。
カバーガラス染色ラック電子顕微鏡科学72240洗浄、シラン化、活性化、および洗浄の間にカバーガラスを保持するために使用します。
D-(+)-グルコースSigma-AldrichG7021-100G免疫染色に使用される透過化バッファーの成分。
DAPIThermo Fisher Scientific62248細胞イメージングおよび極性解析に使用される蛍光核染色剤。
デジタルホットプレートFisher Scientific11-475-028容器チャンバーおよび試薬を約（以下）に維持するために使用される 37 °C 組み立て中に。
EGTA四ナトリウム塩Sigma-AldrichE8145-10G透過化バッファーに使用されるキレート剤。
内径1/16インチチューブ用メスバーブ付きルアーコネクタScientific Commodities Inc.BB330Aマイクロフルイディクス回路内のチューブの接続に使用される。
1/16インチ内径バーブ付きメスルアー, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123チューブおよび容器室の接続に使用します。
フィブリノゲンSigma-AldrichF8630血管支持ハイドロゲルを形成するためにゼラチンおよびトロンビンと共に使用されるECM成分。ソースを確認すること：原稿ではヒト血漿フィブリノゲンと記載されているが、提供された表ではウシ血漿となっている。
流体パルスダンパーDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31ペリスタルティックポンプによって生じる脈動変動を低減するために使用されます。
食品業界用高耐熱シリコーンゴムストリップMcMaster-Carr8417K51Roseチャンバー用ガスケットの作製に使用。
豚皮由来ゼラチン、ゲル強度300、タイプASigma-AldrichG2500血管腔を囲むハイドロゲル形成に使用される主要な細胞外マトリックス成分。
ガラスカバーガラス、No. 1.5VWREN-MAS-25X25-1-5-CS高解像度顕微鏡用基板およびチャンバー表面。
グルタルアルデヒド 25%電子顕微鏡科学16220ECM接着前のカバーガラス活性化のために希釈した。
増殖キット-BBEATCCPCS-100-040血管内皮細胞培養用の血管細胞基礎培地と併用するサプリメントキット。
Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041必要に応じて、血管細胞基底培地とともに使用される内皮細胞成長サプリメント。
ヒト血漿フィブロネクチンSigma-AldrichFC010内皮細胞の接着を促進するために使用される、オプションの管腔内ECMコーティング。
インラインチューブクランプSigma-AldrichZ503371-1PAKチャンバーの操作およびインキュベーション中のチューブ内の流れを停止および調節するために使用します。
Ismatec Reglo Digital ペリスタルティックポンプMasterflex78018-12細胞化された血管内に制御された流体フローを生成するために使用されます。
ラミニンSigma-AldrichL2020-1MG内皮細胞の接着および極性の修飾のための、任意の管腔側細胞外マトリックス（ECM）コーティング。
ルアー・チューブ継手アソートキットWorld Precision Instruments504954チューブ、シリンジ、およびチャンバーの入口・出口部品の接続に使用します。コネクターキットのカタログ番号と重複しています。同一の場合は、1つのエントリのみを保持してください。
塩化マグネシウム六水和物Sigma-AldrichM2393-100G固定および透過化バッファーの組成。
内径1/16インチチューブ用オスバーブ付きルアーコネクターScientific Commodities Inc.BB329Aマイクロ流路チューブの接続に使用します。
オス・ルアーフィッティング、内径1/16インチWorld Precision Instruments13160-100チューブをシリンジおよびチャンバー構成部品に接続するために使用します。
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EA内皮細胞の接着に使用される、任意で選択可能な管腔内細胞外マトリックス（ECM）コーティング。
培地ボトルキャップFisher Scientific05-719-310流路回路用の滅菌培地リザーバーを構築するために使用される2ポートキャップ。
Nalgene Pharma-Gradeシリコーンチューブ、内径1/16インチThermo Fisher Scientific8600-0020マイクロ流体灌流および洗浄回路に使用される柔軟なチューブ。
Parafilm電子顕微鏡科学70990-125カバーガラス上へのECMコーティングの重合時に、非粘着性表面として使用される。
PBS, 10倍濃度, pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044ワーキングPBS溶液の調製に使用される濃縮バッファー。
ペニシリン/ストレプトマイシンThermo Fisher Scientific15140122血管内皮細胞培養培地および洗浄液に使用される抗生物質サプリメント。
PIPESSigma-AldrichP1851-25G透過化溶液の緩衝成分。
プルロニック F-127Sigma-AldrichP2443犠牲プリントインクの温度応答性成分。
オスルアー付きポリカーボネート製3方コックFisher ScientificNC9593742灌流回路における流路のプライミング、切り替え、および制御に使用されます。
ポリエチレンオキシド (PEO)Sigma-Aldrich372781犠牲インク処方のポリマー成分。
ロータリーミキサーFisher Scientific88861050PEO/Pluronic犠牲インクを混合するために使用する 4 °C.
スライドユニット染色皿MSE SuppliesDWK90020カバーガラスの洗浄、染色、または試薬によるインキュベーションに使用します。
正方形カバーガラス、No. 2、25mm x 25mmSigma-AldrichCLS285525-1000EAチャンバー用カバーガラス；厚みのあるNo. 2ガラスは破損への耐性が高く、適切な空気浸漬または水浸対物レンズと併用可能です。
ステンレス製鈍針分注針、21 G、1インチコンポーネント供給NE-212PL流体輸送またはワイヤーテンプレート血管モデルの構築に使用されます。
Steriflip真空ろ過ユニットMilliporeSigmaSE1M179M6温めたゼラチンおよびその他の適合溶液の除菌ろ過に使用します。
滅菌済みプラスチック製5mLシリンジ軽減PSYR5-S気圧式押し出しプリント用の犠牲インクを充填するために使用されます。
トロンビン、ヒト血漿、高活性Sigma-Aldrich605195ECMゲルの形成時にフィブリン重合を開始させるために使用される。
トランスグルタミナーゼMoo Gloo1201ゼラチン/フィブリンECMの調製および修飾に使用される架橋酵素。
Triton X-100Sigma-Aldrich648466免疫染色前の血管内皮細胞の透過化に使用される界面活性剤。
TrypLE Express Enzyme, 1x, フェノールレッドThermo Fisher Scientific12605010血管播種前に血管内皮細胞を回収するために使用される細胞解離剤。
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001免疫染色ブロッキングバッファーの界面活性剤成分。
血管細胞基礎培地ATCCPCS-100-030血管内皮細胞の培養および灌流実験に使用される基礎培地。

参考文献

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

再版と許可

タグ

3Dプリント血管血管蛇行血管瘤オルガンオンチップ血管透過性生理学的せん断速度光学顕微鏡法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。