方法論記事

蠕動によるマクロファージの機械的活性化

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DOI：

10.3791/72607

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2026年8月18日

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1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

この記事について

サマリー

本プロトコールでは、メカノ免疫調節研究に特許取得済みのバイオリアクターのセットアップおよび操作方法について説明します。本稿では、生理学的力を再現するカスタムバイオリアクターを用いて、マクロファージが機械的刺激に対して明確な前炎症性反応を示すことを実証します。

要約

炎症は、急性および慢性疾患の両方を引き起こす複雑なプロセスである。それは、免疫細胞の活性化をもたらす一連の生化学的および生物物理学的なシグナルによって調節される。マクロファージは、がん、線維症、自己免疫疾患を含む多くの炎症状態に関与する主要な免疫細胞種である。マクロファージの活性化を調査する従来の方法では、定義されたサイトカインまたはケモカインシグナルを用いた生化学的刺激が行われ、マクロファージを前炎症性または抗炎症性の状態へと活性化させていた。組織内の生化学的シグナルに加えて、生物物理学的シグナルもマクロファージの活性化に役割を果たすことが、新たな証拠によって示唆されている。このような普及している機械的シグナルのひとつに、胃腸管、子宮、発達中の気道、および尿管で発生する、多軸方向のひずみとせん断応力からなる蠕動運動がある。本研究では、蠕動運動がマクロファージを活性化し得るという仮説を検証した。本プロトコルでは、マクロファージの機械的活性化を調査するための蠕動バイオリアクターの使用について記述する。マクロファージの接着性を高めるため、ポリジメチルシロキサン膜にフィブロネクチンをコーティングした。不死化マウス骨髄由来マクロファージ（iBMDM）をフィブロネクチンコーティング膜上に播種し、静止対照群として維持するか、あるいは4時間の間、蠕動運動に曝露させた。蠕動運動はマクロファージを活性化し、以下の遺伝子発現に有意な差が認められた。 Il6 （静止対照群と比較して50.9倍； p < 0.0001, t検定）および Nos2 （静止対照群に対して19.8倍； p = 0.0046）。興味深いことに、～において有意な変化は観察されなかった。 Chil3 （静止対照群に対し1.22倍； p = 0.9726) または Mrc1 （静止コントロールと比較して1.16倍； p = 0.9810) 静的コントロールと比較して、炎症性活性化は主に力学的刺激によって誘導されたことが示された。本知見は、マクロファージのメカノ免疫調節という概念を支持するものであり、特に多くの平滑筋組織に共通して見られる蠕動運動のメカニクスに対する反応において顕著である。

概要

マクロファージは自然免疫細胞であり、食作用やサイトカイン分泌を通じて、宿主防御、組織リモデリング、および炎症調節において不可欠な役割を果たします1,2,3,4。 in vivo微小環境内の刺激に応じて、未分化マクロファージ（M0）は、前炎症性（M1）または抗炎症性/前再生性（M2）の表現型へと可塑的に分極します5,6。 マクロファージ分極を駆動する複雑なメカニズムをより深く理解するために、通常、これらの異なる刺激を分離させたin vitroモデルが用いられます。 古典的に活性化されたM1マクロファージは、通常、リポ多糖（LPS）やインターフェロンガンマ（IFN-γ）などの生化学的刺激によってin vitroで誘導され、その結果、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）、インターロイキン-6（IL6）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）を含む炎症性メディエーターの発現が増加します7,8。 一方、代替的に活性化されたM2マクロファージは、一般的にインターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）への曝露によって誘導され、組織リモデリングや創傷治癒反応を促進します8,9。 M2マクロファージは、さらに異なる活性化経路と表面マーカーの発現プロファイルに基づいて、M2a、M2b、およびM2cの表現型に細分されます10,11。 マクロファージ分極の生化学的調節については、in vivoおよびin vitroの両方の系で広範に特性解析が行われてきましたが、マクロファージは相当な生物物理学的刺激も含まれる、非常にダイナミックな微小環境内に存在しています12。 可溶性サイトカインやケモカインに加えて、マクロファージは細胞外マトリックスや細胞間相互作用、基質の剛性、流体せん断応力、静水圧、および周期的な組織変形にさらされています12,13,14。 メカノセンシティブ（力学的刺激感受性）な細胞であるマクロファージは、これらの物理的な手がかりに応じて炎症性表現型を変化させることができ、免疫調節におけるメカノバイオロジーの重要性が浮き彫りになっています。

単独の機械的刺激が、ということを示した文献が数多く報告されている。 in vitro マクロファージの活性化状態に大きな影響を及ぼす可能性があります（図1）。より硬い基質への曝露は、再生促進的な表現型を誘導したより柔らかい基質と比較して、M1極性化および炎症性サイトカイン産生を増加させた。15,16,17,18,19,20同様に、流体剪断応力はマクロファージの表現型を強度依存的に調節し、低レベルの間質液流はしばしば再生促進的な活性化を促します。21,22 動脈で見られる値に近いより高い剪断応力は、炎症性反応を誘導する可能性がある一方で、23,24,25,26,27,28周期的なストレッチング in vitro 筋骨格、心筋、肺、および腸管組織の力学特性を模倣して設計されたモデルにおいても、炎症性メディエーターの発現増加が示されているが、その結果は印加される力の大きさ、持続時間、頻度、および次元によって異なる。29,30,31,32さらに、マクロファージのメカノセンシティビティ（機械刺激感受性）は種や細胞源によって異なり、メカノバイオロジー研究において適切な実験モデルを選択することの重要性が強調されている。13,14.

マクロファージ活性化ダイアグラム；生化学的・生物物理学的刺激；表現型の変化；ストレス要因
図1～を示す模式図 in vitro マクロファージを前炎症性または前再生性のいずれかの状態へと活性化させる生化学的および生物物理学的刺激。 マクロファージは刺激によって前炎症性状態へと誘導することができる。 in vitro 化学的刺激（リポ多糖（LPS）またはインターフェロンγ（IFN-γ））の添加、あるいは、せん断応力、剛性の増加、高頻度および静的な一軸伸展誘導ひずみ、圧縮、および多軸圧縮誘導ひずみを含む機械的刺激への曝露により、マクロファージを親再生状態で刺激することができる。 in vitro 化学的刺激であるインターロイキン-13（IL-13）およびIL-4の添加。また、振動剪断応力、間質流、軟らかい基質、または低レベルの一軸周期的な歪みといった形態の機械的刺激にさらされることで、これらは前再生的な状態になることもある。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

単独の機械的刺激を個別に調べることに加え、マクロファージが（～であるため）、複合的な物理的力の及ぼす影響を研究し始めるために、本研究を基盤として発展させることが重要である。 in vivo 一般的に、複数の力が同時に作用する環境にさらされています。蠕動運動は、平滑筋の収縮によって生じる多軸的な周期的な伸張力と流体剪断応力が同時に作用する、そのような複雑な力学的環境の一例です。33これらのメカニズムは、胃腸管、発達中の気道、血管系、子宮、尿管を含む、複数の器官系にわたって存在しています。34,35,36重要なことに、線維症、炎症性腸疾患、がん、および気道リモデリング疾患を含む炎症性疾患では、蠕動機能が頻繁に乱れており、これらすべてにおいてマクロファージが媒介する実質的な炎症が関与しています。33,37,38,39これらの疾患におけるマクロファージの役割は認識されているものの、蠕動による機械的な力がマクロファージの活性化にどのように直接影響を与えるかについては、依然として重要な解明すべき課題が残っている。

本プロトコルでは、生理学的に適切な機械的条件下でマクロファージのメカノ・免疫変調を調査するための、蠕動バイオリアクターシステムの利用について説明します。従来の静的な培養システムや単一方向の機械刺激プラットフォームと比較して、本手法では周期的多軸伸展と流体剪断応力を同時に適用することが可能であり、平滑筋ベースの組織におけるin vivoの機械的微小環境をより忠実に再現できます。本プロトコルにおいて、蠕動条件下でバイオリアクター内で培養された不死化マウス骨髄由来マクロファージ（iBMDMs）は、M1活性化マーカーの上昇を示し、一方でM2活性化への傾向は見られませんでした。これらの知見は、蠕動による力学的刺激がマクロファージの炎症挙動を調節するのに十分であり、動的な平滑筋駆動の力にさらされる組織におけるメカノ・免疫変調というより広範な概念を支持することを証明しています。本手法は、メカノバイオロジー、炎症、組織工学、胃腸生理学、肺の発達、線維症、およびマクロファージが複雑な機械的微小環境にさらされるその他の疾患を研究する研究者に特に有用です。慎重な組み立て、一貫したキャリブレーション、および継続的なモニタリングを行うことで、ユーザーは再現性のあるバイオリアクターの性能を確保し、本手法における一般的な制限を回避することができます。

プロトコル

本プロトコルでは、メカノ免疫調節研究のための特許取得済み40バイオリアクターシステムの組み立てと操作について説明します。使用した試薬および装置は、材料表に記載されています。

1. 細胞培養

  1. 不死化マウス骨髄由来マクロファージ（iBMDMs）を、10% 熱不活化FBS、1% HEPES緩衝液、1% ピルビン酸ナトリウム、および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した完全RPMI 1640培地を用い、37 °C、5% CO2条件下で維持する。

2. ポリジメチルシロキサン (PDMS) の作製

  1. シリコーンエラストマーキットのベースと硬化剤を10:1（w/w）の比率で計量し、混合する。
  2. 混合物を5分間攪拌し、均一に混ざっていることを確認する。
  3. 混合したPDMSを、高さが3mmになるまで100 mm x 15 mmの正方形ペトリ皿に慎重に注ぐ。
  4. PDMSを入れたペトリ皿をデシケーターに配置する。
  5. 真空状態で1時間脱気し、気泡を除去する。
  6. PDMSをデシケーターから取り出し、気泡が残っていないことを確認する。
  7. 未硬化のPDMS膜を60 ˚ Cに予熱したオーブンに移し、4時間硬化させる。
  8. PDMS膜をオーブンから取り出し、ベンチトップで一晩冷却する。
  9. 18～24時間後、硬化したPDMS膜をペトリ皿から慎重に剥離し、70 mm x 40 mm x 3 mmのサイズにカットしてPDMS膜を作成する。

3. PDMSメンブレンの滅菌

  1. バイオセーフティキャビネット内で、PDMSメンブレンを70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット（BSC）の表面に直接置きます（補足資料 図1).
  2. UVで10分間滅菌した後、PDMSメンブレンを、UV照射した面を上にして、非組織培養処理済みの90 mm培養皿に移す。
    注意：汚染のリスクを軽減するため、PDMSは必ず側面を持って保持し、PDMSの上方で手を交差させないようにしてください。
  3. 蠕動実験には、元の寸法のままのPDMSメンブレンを使用してください。
  4. 静置培養条件では、70 mm x 40 mmのPDMSメンブレンをそれぞれ等分に切り、35 mm x 40 mmの半分ずつのサイズにする。

4. PDMSメンブレンのフィブロネクチンコーティング

  1. BSC内で、メンブレン1枚あたり100 µL使用するのに十分な量の、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した滅菌済み0.5 mg/mL フィブロネクチン溶液を調製する。
  2. このコーティング溶液100 µLを各PDMSメンブレンの中央に分注し、コーティング領域がPDMSとスクリューのメンブレン接触領域と正確に一致するようにする。
    注：ピペットチップを使用して、溶液を薄く均一な層にゆっくりと広げる。
  3. 吸着させるため、蓋を外した状態で、コーティングしたPDMSメンブレンを培養皿に入れたまま45分間放置する。
    注：連続的な気流を維持するため、BSCのサッシを開けたままにする。
  4. 45分後、各メンブレンから残りのフィブロネクチン溶液を吸引除去する。
  5. 滅菌済みPBS 1 mLでメンブレンを優しく洗浄する。

5. PDMSメンブレンへのiBMDM細胞の播種

  1. T25フラスコで培養したiBMDM細胞が70%～80%のコンフルエンシーに達した時点で、トリプシン処理を行い、細胞を表面から剥離させる。
  2. ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定し、培地中で100,000 cells/mLの細胞密度となるように調製する。
  3. フィブロネクチンでコートした各PDMSメンブレンに、調製した細胞懸濁液を1枚あたり1 mLずつ播種する。
  4. 条件間の並行比較を確実にするため、各実験において、少なくとも1枚の静的なメンブレンと1枚の蠕動（ぜんどう）メンブレンに細胞を播種してください。
  5. 播種したPDMSメンブレンを、加湿インキュベーター内の以下の条件に設置します。 37 °C 5% CO含有2 静止条件およびペリスタルティックポンプ条件下（の両方）で、細胞を接着させるため、少なくとも24時間（付録 図1B).

6. バイオリアクター

  1. バイオリアクターの特許（US12522795）40に記載されているコンピュータ支援設計（CAD）ファイルおよび仕様に基づきバイオリアクターを製作するか、あるいは著者から組み立て済みのユニットを入手してください。

7. Arduino回路の組み立てとキャリブレーション

  1. 回路構築
    1. ポテンショメータ、抵抗器、トランジスタ、および導電性配線を用い、図に示す通りにブレッドボード上で制御回路を組み立てます。 補足資料 図2.
    2. コンピューターにArduino IDEをインストールし、新しいスケッチを開きます。
    3. モーター速度を5 rpmに、ペリスタルティックポンプを28 mL/minに設定してください。
    4. Arduinoボードをコンピュータに接続します。 経由で USBに保存し、提供されたコードをアップロードしてください。 補足ファイル1 IDEのアップロードボタンを使用して。
      注：アップロード中はArduinoのLEDがオレンジ色に点灯し、実行準備が整うと緑色に戻ります。アップロード完了後、電源が投入されるとArduinoは自動的にプログラムを実行します。
  2. モーターのキャリブレーション
    1. モーターを始動させ、ストップウォッチを使用して1分間の回転数をカウントします。
      注：5 RPMを実現するために、必要に応じてArduinoコードのモーター速度パラメータを調整してください。
    2. 希望の速度が得られるまで、調整を行うたびにコードを再アップロードしてください。
  3. ポンプの校正
    1. ポンプを30秒間作動させ、回収された質量を測定して、流量が28 mL/min（30秒間で約14 g）であることを確認する。
    2. ポテンショメータを調整し、30秒間の出力が安定して14g付近になるまでこの操作を繰り返します。
  4. モーターとポンプの両方の校正が完了したら、それらをバイオリアクターユニットとペアリングしてください。
    注：校正済みのモーター・ポンプ・バイオリアクターアセンブリが、これで実験に使用可能な状態になりました（図2).

マクロファージ培養セットアップのためのバイオリアクター概略図、および細胞研究結果のイメージングおよびPCR解析。
図 2: 蠕動バイオリアクター装置の概略図およびダウンストリーム解析。iBMDM細胞を、バイオリアクター内に設置されたフィブロネクチンコートPDMSメンブレン上に播種する。4時間の蠕動刺激への曝露、または静的なコントロールとしての維持後、細胞を回収し、qPCR、免疫蛍光染色、イメージングなどのダウンストリーム解析を行う。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8. ペリスタルス・バイオリアクターの組み立てとセットアップ

  1. コンポーネントの調製
    1. 培地ボトル、培地キャップ、3Dプリント製培地ボトルトップ、3Dプリント製バイオリアクタートップ、3Dプリント製バイオリアクターボトム、3Dプリント製スクリュードライブ、結束バンド（バイオリアクター1台につき3本）、スリップジョイントプライヤー、ニッパー、150 mm組織培養皿、シリコングリス、および3Dプリント製モーターサポートを含む、すべての必要部品を準備します。各アイテムに70%エタノールをスプレーしてから、BSC内に配置してください。
    2. DCモーター、ペリスタルティックポンプ、および追加のポンプチューブをBSC内に配置します。
    3. BSCの蓋を閉め、UVランプを10分間点灯させてすべてのコンポーネントを滅菌します（補足図 1C).
  2. 細胞の接着および生存率の確認
    1. 播種した静止状態および蠕動運動状態の両方のPDMSメンブレンを顕微鏡下で観察し、確認する。 >フィブロネクチンコーティングしたPDMS表面への細胞接着率を80%とし、細胞形態を観察して生存率を確認する。
    2. 必要に応じて、アセンブリ前に細胞の代表的な画像を撮影してください。
  3. 静的コントロールの調製
    1. 各静止膜から完全RPMI培地を1 mL吸引する。
    2. 各メンブレンに、新鮮な完全RPMI培地を1 mLずつ加える。
    3. ディッシュに「静止」とラベルを貼り、インキュベーターに戻す。
  4. 蠕動バイオリアクターの組み立て
    1. バイオリアクターに使用する各培地ボトルに、培地を15 mLずつ加える。
    2. 3Dプリントされたボトルトップ（inlet/outletポート付き）を装着した培地キャップを、培地ボトルに取り付けます。これらを脇に置いておきます（付録 図1D).
    3. バイオリアクターのベースを組み立てる。
      1. 3Dプリントしたスクリュードライブを、バイオリアクター底面の中心ウェルに挿入します。
      2. DCモーターをバイオリアクター底面のモーター用スロットに挿入します。
      3. モーターのドライブシャフトが、3Dプリントされたスクリュードライブの中央孔にしっかりと固定されていることを確認してください。
      4. モーターホルダーをスライドさせて位置を合わせ、モーターを固定します。
  5. 組み立てを完了させた後、BSCからインキュベーターへ移動させやすくするため、部分的に組み立てたバイオリアクターを150 mmの組織培養ディッシュに入れます（補足資料 図1E).
  6. PDMSメンブレンがスクリュードライブに接触するスクリュードライブの溝に、シリコングリースを薄く塗布します。これにより、ネジがスムーズに回転し、摩擦が軽減されます。
  7. 細胞播種済みPDMSメンブレンの装着
    1. 細胞を播種した蠕動運動PDMSメンブレンを、インキュベーターから生物安全キャビネット（BSC）内へ慎重に移動させてください。
    2. 各メンブレンから培地を吸引し、細胞が播種された面を上向きに（グリスを塗布したスクリュードライブインターフェースと反対側に）して、メンブレンをバイオリアクター内に配置する。
    3. バイオリアクターの上部を、細胞チャンバーのくぼみがPDMSメンブレンと一致するように配置します。その後、上部をバイオリアクター下部のガイド溝に沿ってスライドさせて挿入します。
  8. バイオリアクターの固定
    1. 結束バンドと斜行ペンチを使用して、バイオリアクターの上下部を固定します。
    2. プライヤーで結束バンドの余分な長さを切り取ります。
  9. 流体接続およびシステムのセットアップ
    1. ペリスタルティックポンプを調整し、金属コネクタがモーターコネクタと同じ方向を向くようにしてください。
    2. バイオリアクターに最も近いポンプチューブを、バイオリアクター上部のモーターに最も近い入口ポートに接続します。チューブを入口ノズルに完全に押し込んでください。
    3. このチューブの反対端を培地ボトルの中に浸します。
    4. 予備のポンプチューブを使用し、一方の端をバイオリアクター上部の出口ノズルに取り付け、もう一方の端を培地ボトル内の培地液面より上の位置に配置して、逆流させることなく再循環できるようにします（補足資料 図1F).
  10. インキュベーションおよび操作
    1. バイオリアクターアセンブリ全体（150 mmディッシュ内）をインキュベーターの中に入れます（付録 図1G)とし、回路基板およびArduinoは電源に接続した状態で外部に保持します。
    2. ワニ口クリップを接続します。
      1. ポンプ：正極を正極に、負極を負極に接続してください。
      2. モーター：回路設計に従って極性を反転させる。
    3. 後でサンプルを回収するため、滅菌済みの空のペトリ皿をインキュベーターに入れておく。
    4. ペリスタルシスバイオリアクターシステムを4時間（または任意の時間）作動させます（補足資料 図1H）インキュベーター内の標準培養条件下で。

9. バイオリアクターの解体

  1. インキュベーターを開き、培地ボトルからインレットチューブを持ち上げてシステム内に空気を導入し、バイオリアクターから残りの培地を完全に排出させる。
  2. 培地の流れが止まったら、回路基板からモーターおよび／またはポンプのリード線を外し、機械的な動作を停止させる。
  3. バイオリアクターアセンブリ全体をBSC（バイオセーフティキャビネット）に移動させ、チューブを取り外し、結束バンドを切断し、バイオリアクターの上部を取り外す。
  4. PDMSメンブレンから残った培地を吸引し、メンブレンを準備時に使用したのと同じペトリ皿に戻す。
  5. 細胞培養顕微鏡で細胞の形態を評価し、細胞の接着状態と生存率を確認した後、必要に応じて後続の解析を行う。

10. ダウンストリーム解析

  1. qPCRサンプルの回収
    1. BSC内で、細胞種や実験条件を含むサンプル識別子を1.5 mLマイクロ遠心チューブに記入する。
    2. 細胞培養顕微鏡を用い、静止条件および蠕動条件の両方において、PDMS上に細胞が存在することを確認する。
    3. 各PDMSメンブレンから残留培地を吸引除去する。
    4. Buffer RLTにβ-メルカプトエタノールを1:100の割合で添加し、RNA溶解バッファーを調製する。
    5. 細胞を溶解させるため、各PDMSメンブレンにBuffer RLT + β-メルカプトエタノールを370 µL添加する。
    6. 滅菌済みのセルスクレイパーを用い、PDMSの細胞播種領域を強くスクレイピングしてすべての細胞を剥離させる。
    7. 溶解液 約350 µLを対応する1.5 mLチューブに移す。
    8. RNA抽出を行うか、または使用時までサンプルを-80 °Cで保存する。
    9. BSCを汚染除去する。
      注：Buffer RLTおよびβ-メルカプトエタノールは、それぞれのSDSに従って取り扱い、適切な廃棄物容器に廃棄すること。
  2. 免疫蛍光染色
    1. 各メンブレンに4%パラホルムアルデヒド（PFA）を1 mL添加し、室温で20分間インキュベートする。
    2. PFAを吸引し、指定の有害廃棄物容器に廃棄する。
    3. 各メンブレンにPBSを1 mL添加し、残留した固定液を除去する。
    4. ターゲットマーカーに適した免疫蛍光染色プロトコルに従って操作を続ける。

11. バイオリアクターおよび関連部品の洗浄

  1. バイオリアクターの入口および出口ポートを含め、培地、細胞、またはPDMS膜に接触するすべてのバイオリアクター構成部品に70%エタノールをスプレーする。
  2. 培地ボトルから残りの培地をすべて吸引し、その後、内部に70%エタノールを十分にスプレーして再度吸引することで洗浄する。
  3. 滅菌済みのすべての構成部品をBSCから取り出し、指定のクリーンエリアに保管する。
  4. 培地ボトルの場合：
    1. 20%漂白剤で洗浄し、撹拌した後、流水を出しながら内容物をシンクに捨てる。
    2. 1:10に希釈した酢でこすり洗いし、石鹸と超純水で洗浄した後、70%エタノールでリンスし、逆さまにして乾燥させる。
    3. 培地キャップとポンプインサートを70%エタノールで洗浄する。
  5. ペリスタルティックポンプの洗浄
    1. 250 mLビーカーを用意し、(1) 70%エタノール、(2) 超純水、または (3) 空の廃棄容器をそれぞれ入れる。
    2. 閉回路の流路になるようチューブでポンプを接続し、Arduino制御の回路基板を使用して電源を入れる。
    3. ポンプを70%エタノールで1分間、その後超純水で1分間運転させ、空の廃棄ビーカーに流し込む。

結果

本プロトコルの目的は、蠕動性の機械的力がマクロファージの活性化をどのように直接的に調節するかを決定するための再現可能な手法を実証することである。バイオリアクターを用いた実験に先立ち、iBMDMsが標準的な生化学的刺激条件下で適切に極性化することを確認した。本プロトコルに従い、PDMSメンブレンにフィブロネクチンをコーティングし、iBMDMsを播種した。細胞を24時間静置して接着させた後、視覚的検査を行い、接着の成功、メンブレン表面への均一な分布、およびベンダーの説明にある不規則な「目玉焼き状」の形態による生存を確認した（Figure 3A,B）。接着不良、播種ムラ、または細胞剥離が認められるメンブレンは、機械的刺激が不均一となり、下流のシグナリングにばらつきが生じる可能性があるため、実験から除外した。正常に播種されたメンブレンは、蠕動性刺激を行うためにバイオリアクターシステムに組み込むか、静止コントロールとして維持した。4時間の培養後、サンプルを再評価し、機械的刺激後も細胞が接着したままであることを確認した（Figure 3C,D）。すべての条件下で細胞の保持が確認された後、qPCRおよび免疫蛍光染色を用いてマクロファージの活性化を評価した。

炎症性M1関連遺伝子であるIl6、Nos2、Cd40、およびM2関連遺伝子であるChil3とMrc1の発現変化を評価するために、qPCR解析を行った（Table 1）。これらの結果から、蠕動刺激がマクロファージを炎症性表現型へと活性化させることが示された。蠕動培養により、静止対照群と比較してIl6の発現は50.9倍に有意に増加し（p < 0.0001, unpaired t-test）、Nos2の発現は19.8倍に増加した（p = 0.0046, unpaired t-test）（Figure 4A）。Cd40の発現も7.7倍に増加したが、この変化は有意ではなかった（p = 0.1106, unpaired t-test）（Figure 4A）。対照的に、Chil3（静止対照群の1.22倍；p = 0.9726, unpaired t-test）およびMrc1（静止対照群の1.16倍；p = 0.9810, unpaired t-test）に有意な変化は見られなかった（Figure 4B）。以上の結果は、適用した蠕動力が、代替活性化経路よりも優先的に炎症性マクロファージの活性化を促進したことを示している。

マクロファージの極性化をさらに評価するため、全マクロファージマーカーであるF4/80および、M1関連マーカーのCD40 (図 5A) またはM2関連マーカーのYM1/YM2 (図 5B) に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。各条件間で比較が可能となるよう、サンプルをDAPIで対比染色し、同一の取得設定で撮影した。各マーカーの平均蛍光強度 (MFI) を定量化し、同一画像内の対応するF4/80シグナルで正規化した。蠕動性マクロファージは1.74 ± 0.72の正規化CD40 MFIを示し、静止対照群と比較して64.80%の増加が認められたが、この増加は統計的に有意ではなかった (図 5C)。qPCRの結果と一致して、蠕動刺激後の正規化YM1/YM2発現に有意な変化は見られず、静止対照群に対してわずか5%の増加にとどまった (図 5D)。これらの代表的な結果は、本プロトコルが機械的刺激のみによって、再現性よく主に炎症性マクロファージ応答を誘導することを実証している。

静止状態と蠕動運動における細胞分散の比較（0時間および4時間）、および顕微鏡画像解析。
図3明視野画像により、蠕動運動の前後の細胞接着が視覚的に確認できる。 静止画（A,C）および蠕動運動（B,D）バイオリアクター設置前（t = 0 h）および実験完了後（t = 4 h）の条件。スケールバー = 200 µm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子発現棒グラフ；静止条件および蠕動条件におけるM1およびM2のフォールドチェンジ。
図4遺伝子発現解析により、マクロファージの前炎症性活性化が示される 経由で 蠕動刺激 （の）遺伝子発現の倍率変化A) M1マーカー Il6, Nos2, および Cd40、 および（BM2マーカー Chil3 および Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0.0001、ns = 有意差なし。すべてのデータは平均値 ± 標準偏差（SD）で示し、各群 n = 3 とする。 この図の拡大表示を見るには、ここをクリックしてください。

マクロファージ分極実験；CD40、YM1/2マーカー、蛍光顕微鏡、データ解析チャート。
図 5: 免疫蛍光染色により、蠕動運動の活性化後のマクロファージの前炎症性活性化が確認された。汎マクロファージマーカーF4/80（緑）および（A）M1マーカーCD40（ピンク）または（B）M2マーカーYM1/YM2（赤）で染色したマクロファージの代表的な免疫蛍光画像。スケールバー = 20 µm。（C）F4/80で正規化したCD40の平均蛍光強度（MFI）の定量値。（D）F4/80で正規化したYM1/YM2のMFI定量値。すべてのデータは平均値 ± SDで示されており、各群の n = 3 である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子プライマー配列 (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhRGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
IL-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
IL-6RGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

表1：qPCRで解析した遺伝子のプライマー配列。

付録図1：PDMSの調製、バイオリアクターの組み立て、および灌流セットアップのワークフロー。(A) BSC内でのPDMS調製。(B) 細胞播種。(C) バイオリアクター構成部品のUV滅菌。(D) バイオリアクターの組み立て。(E) 固定されたバイオリアクター。(F) ポンプの接続。(G) 0時間時点でのインキュベーターセットアップ。(H) 4時間時点でのインキュベーターセットアップ。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図2： ブレッドボード、ポンプ、モーター、および配線を備えたバイオリアクター回路。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補完ファイル 1：バイオリアクター Arduinoコードこちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

炎症性疾患において蠕動運動の調節不全が一般的であるにもかかわらず、蠕動力がマクロファージ機能にどのような影響を与えるかについての現在の理解は依然として限られています。せん断応力や周期的な歪みなどの個別の機械的刺激がマクロファージの活性化を調節することは知られていますが、蠕動運動を構成する多軸的な歪みと流体フローが同時に作用した際の影響については、マクロファージのメカノバイオロジーの観点から十分に研究されていません。本プロトコルでは、生理学的に適切な条件下で、これらの複合的な機械的力がマクロファージの炎症挙動をどのように制御するかを研究するための再現可能なプラットフォームを提供します。本システムを用いた検証により、4 hの蠕動刺激への曝露が、Il6およびNos2の発現が有意に増加することを特徴とする、主に前炎症性のマクロファージ表現型を促進することが示されました。

重要な点として、マクロファージのメカノセンシティビティ（機械刺激感受性）は、印加される力の大きさ、周波数、および持続時間に強く依存します12,13,14。単一の機械的刺激を調査した先行研究では、これらのパラメータによってマクロファージの活性化状態が大きく異なることが示されています。したがって、蠕動運動の力学によって誘発されるマクロファージ応答のスペクトラムをより正確に定義するためには、今後の研究において、歪みやせん断応力の変化、および機械的刺激にさらされる時間の延長を含む、より広範な蠕動条件を検討する必要があります。さらに、本研究では、流体せん断応力や周期的な歪みを個別に扱うのではなく、機械的入力として蠕動運動に焦点を当てた点に限界がありました。今後の研究では、このバイオリアクタープラットフォームを利用して、単一のプラットフォームによる厳密な条件下で、様々な機械的入力の関数としてのマクロファージ活性化を探索できる可能性があります。これらの研究を拡大することで、異なる組織環境において炎症性または再生促進性の表現型を促進する機械的閾値を特定できると考えられます。

マクロファージのメカノセンシティブ性は、基質の剛性とトポグラフィーにも強く依存します。本研究で選択したPDMSの剛性は、蠕動力の効果とは別に、マクロファージの活性化に影響を及ぼす可能性があることに注意することが重要です15,16,17,18,19。変数としての剛性を制御するため、我々は蠕動にさらされたマクロファージと、静的な条件下で同等の剛性を持つPDMS上のマクロファージを比較しました。今後の研究では、PDMSの比率を変更する、基質に別の材料を使用する、あるいは比較のために2D組織培養皿でマクロファージを培養することで、変数としての剛性をさらに精密に制御できる可能性があります。また、本研究ではPDMSのトポグラフィーは変更しませんでしたが、我々のデバイスは今後の研究においてこの変数を検討することを可能にします。

本プロトコルの大きな強みは、幅広い炎症研究に適応可能である点にあります。本研究では不死化骨髄由来マクロファージ（iBMDMs）を使用していますが、このシステムは、初代マクロファージ、単球、組織常駐性マクロファージ、または多細胞共培養系に対応させるために容易に修正可能です。例えば、胃腸管、子宮、または尿管の細胞微小環境をより正確に再現するために、上皮細胞、間質細胞、または平滑筋細胞を組み込むことができます。さらに、PDMSメンブレンに適用するコーティングを変更することで、細胞外マトリックスの組成を目的の組織に合わせて調整できます。本研究では、蠕動刺激中のiBMDMの接着を維持するためにフィブロネクチンが必要でしたが、コラーゲンIおよびコラーゲンIVのコーティングでは大幅な細胞剥離が生じました。ただし、最適なマトリックスコーティングは、マクロファージの由来や共培養の構成によって異なる場合があります。したがって、再現性のある機械的刺激および下流解析を確実にするためには、推奨されるチェックポイントで細胞接着を慎重に検証することが不可欠です。

このプロトコルを正常に実施するには、いくつかの技術的な考慮事項が不可欠であり、そこには最も一般的な故障を防ぐための日常的なメンテナンスが含まれます。特に、結束バンドを用いたバイオリアクターの適切な組み立てと密封は極めて重要です。密封が不十分な場合、培地の漏出、せん断応力および歪みプロファイルの変化、コンタミネーションのリスク、あるいは細胞生存率の低下を招く可能性があります。さらに、再現性のある蠕動刺激を維持するために、ポンプとモーターには安定したキャリブレーションが必要です。また、ポンプチューブをエタノールと超純水で定期的にフラッシングすることで、残留物の蓄積を防ぎます。最後に、PDMSメンブレン上に播種した細胞は、バイオリアクターに設置する前に、適切に接着し80%のコンフルエンシーに達しているかを確認する必要があります。これらのトラブルシューティングの手順とシステム上の制約は、再現性のあるバイオリアクターの性能を確保するために、慎重な組み立て、一貫したキャリブレーション、および継続的なモニタリングが必要であることを示しています。

総じて、本プロトコールは、複雑で動的な機械的環境下におけるメカノ免疫調節を研究するための、汎用性が高く生理学的に妥当なプラットフォームを提供します。周期的な多軸方向の伸展と流体せん断応力を同時に適用することを可能にする本システムは、従来の単一的な力を用いたin vitroモデルを拡張するものであり、平滑筋駆動組織における炎症を研究するための有用なツールとなります。このアプローチは、マクロファージが動的な機械的微小環境にさらされる胃腸疾患、線維症、癌、およびその他の病態の研究に広く適用できる可能性があります。

開示事項

著者は開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、米国国立科学財団（National Science Foundation）の助成金（Award Number 2440798）による支援を受けて行われました。図1および図2は、BioRender.comのライセンス版を用いて作成されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% Trypsin-EDTAFisher25200056
1.5 mL マイクロ遠心チューブUSA Scientific1615-5510
100 mm x 15 mm ペトリ皿Fisher50-190-0276
150 mm 培養皿FisherFB012925
4% パラホルムアルデヒドSanta Cruzsc-281692
90 mm 培養皿FisherFB012923
Alexa Fluor 488 Anti-F4/80 抗体Abcamab204266
Alexa Fluor 647 Anti-CD40 抗体Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
ブレッドボードAmazon
Buffer RLTQiagen79216
セルスクレイパーFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
デシケーターMilliporeSigmaZ119008
斜め pliers（ニッパー）Amazon
ウシ胎児血清Innovative Biosciences11-01-500
フィブロネクチンMilliporeSigmaF1141-1MG
HEPES バッファーFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
モーター RobotshopFT-SPARK16-360
PE Anti-Ym-1 + Ym-2 抗体Abcamab211621
ペニシリン-ストレプトマイシンFisher15140122
ペリスタルティックポンプDigiKey1150
リン酸緩衝生理食塩水Fisher14190250
PLA フィラメントAmazonB0D7ZYCVTY
ポテンショメータ B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
シリコングリースAmazonB000XBH9HI
ジョイントプライヤーAmazon
ピルビン酸ナトリウムCytiva HycloneSH3023901
Sylgard 184 シリコンエラストマーキットFisherNC9285739
T-25 培養フラスコFisher229331
トランジスタDigiKeyIRF520NPBF-ND
配線/ワニ口クリップAmazon
結束バンド 18 インチAmazon
β-メルカプトエタノールFisherAC125472500

参考文献

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