研究記事

周術期の麻酔関連薬剤標的遺伝子に基づく卵巣がんの予後モデリング：バイオインフォマティクス的アプローチ

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DOI:

10.3791/72629

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2026年8月14日

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1Shanghai Key Lab of Reproduction and Development, Shanghai Key Lab of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Obstetrics & Gynecology Hospital of Fudan University, 2Department of Critical Care Medicine, Aerospace Center Hospital, 3Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4Department of Anesthesiology, Peking Union Medical College Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、周術期の麻酔関連薬標的遺伝子を卵巣がんのマルチオミクスデータと統合することで、予後予測モデルを構築・検証し、関連する免疫学的、空間的、および調節的な特徴を明らかにします。

要約

卵巣がん（OV）の不均一性は、疾患のサブタイプ分類、リスク層別化、および精密な臨床管理において大きな課題となっています。そこで本研究では、周術期麻酔関連薬標的遺伝子（PARDTGs）に基づく予後予測モデルを開発し、OV患者におけるPARDTGsの臨床的意義を検討しました。本研究では、バルクトランスクリプトームデータ、単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）データ、および空間トランスクリプトームデータを含むマルチオミクスデータを統合することで、OVにおけるPARDTGsを包括的に解析しました。PARDTGsの発現特性に基づき、stepAIC Cox比例ハザードモデルを用いて予後予測シグネチャーを構築しました。このモデルはTCGA-OVデータセットで構築され、GSE26193、GSE30161、およびGSE63885データセットを用いて検証されました。さらに、PARDTGの特徴と臨床因子を組み合わせたノモグラムを作成しました。また、リスクスコアと機能濃縮、シグナル伝達経路、および腫瘍免疫微小環境との相関を解析しました。その結果、OVの予後と強く関連する17個のPARDTGsを特定しました。TCGA-OV、GSE26193、GSE30161、およびGSE63885コホートで検証されたこの予後予測シグネチャーは、OSに対して堅牢な予測精度を示しました。遺伝子シグネチャーのみの場合と比較して、予後予測モデルと臨床パラメータを統合したノモグラムは、より優れた予後予測性能を示しました。さらに、腫瘍微小環境の解析により、低リスク患者では免疫関連経路の有意な濃縮とTIDEスコアの低下が認められ、これらの患者が免疫療法の恩恵を受ける可能性が高いことが明らかになりました。本研究は、卵巣がんにおけるPARDTGsの予後との関連性と臨床的有用性を実証しています。遺伝学的特性を臨床検査に統合することは、臨床治療と予後の改善に有望であると考えられます。

概要

OVは、潜在的な初期症状、強い浸潤性、および非特異的な早期臨床徴候を特徴とする、一般的かつ悪性度の高い腫瘍です。研究により、ほとんどの患者が診断時にすでに臨床的後期段階にあり、全体的な5年生存率は45%を下回っていることが示されています1。手術、化学療法、および標的療法の進歩にもかかわらず、腫瘍の再発、化学療法耐性、および免疫逃避などの課題が依然として存在し、治療効果を制限しています2。したがって、腫瘍の不均一性に対処し、個別化された臨床戦略を支援するために、新規の分子バイオマーカーの特定と、堅牢なリスク評価ツールの開発が急務となっています。

外科的切除および周術期管理は、依然として卵巣がん（OV）治療の基盤である。しかし、周術期の生理学的ストレス、炎症反応、および免疫調節が生物学的挙動に影響を与え、結果として長期予後に影響を及ぼす可能性を示す根拠が増えている3。周術期介入の主要な構成要素として、麻酔薬の効果は中枢神経系の抑制にとどまらない。現在の研究では、麻酔手技および麻酔薬が神経内分泌反応、炎症カスケード、および免疫エフェクター細胞の活性を調節し、それによって術後の腫瘍微小環境を再形成し、腫瘍細胞の遊走能、免疫監視、および転移関連プロセスに影響を与えることが示されている4。特に、特定の麻酔薬は腫瘍細胞の運命を直接的に変化させる。例えば、プロポフォールはNrf2を介したフェロトーシスの抑制を通じて循環腫瘍細胞の生存を増強し、それによって転移を促進する5。ケタミンはlncPVT1/miR-214-3p/GPX4軸を制御することで肝細胞がん細胞にフェロトーシスを誘導し、麻酔薬が腫瘍細胞の運命決定に直接影響を与えうることを示唆している6。さらに、GABA受容体のポジティブ・アロステリック・モジュレーターであるベンゾジアゼピン系薬剤は、化学療法と免疫療法の併用による抗腫瘍効果を減弱させる可能性がある7。しかし、現在の研究は主に単一の麻酔薬に焦点を当てており、遺伝子ターゲットネットワークレベルでの潜在的な影響に関する体系的な検証が不足している。

麻酔作用の直接的な分子基質である周術期麻酔関連薬剤標的遺伝子（PARDTGs）は、神経伝達物質受容体の調節、カルシウム恒常性の維持、アクチン細胞骨格のダイナミクス、内分泌ストレス軸におけるフィードバックなど、いくつかの重要なシグナル伝達経路に関与しています8,9。周術期の外科的ストレス下では、これらの経路が活性化または抑制され、免疫細胞の分極や腫瘍関連微小環境のリモデリングに影響を及ぼす可能性があります8,10。しかし、卵巣癌（OV）におけるPARDTGsの発現状況、機能的特性、および臨床的関連性は、依然として十分に解明されていません。同時に、scRNA-seqおよび空間トランスクリプトーム解析の登場により、空間的な局在を伴う細胞解像度での遺伝子発現プロファイリングが可能となり、腫瘍組織における麻酔標的遺伝子の空間分布、微小環境への嗜好性、および細胞特異的な影響に関する新たな視点が得られています11。

本研究では、PARDTGsを卵巣がん（OV）のマルチオミクスデータセットと統合し、発現変動遺伝子を体系的に特定して、汎用性のある予後リスクモデルを構築しました。さらに、免疫浸潤、幹細胞能特性、変異ランドスケープ、および機能パスウェイの観点から、リスク層別化の生物学的根拠を詳細に解析しました。マルチモーダルシーケンシングデータを組み合わせることで、細胞型の起源と空間的な生態学的ニッチを明らかにし、miRNA/転写因子調節ネットワークを構築するとともに、パンキャンサー検証を行い、腫瘍横断的な重要性を実証しました。本研究は、卵巣がんにおける麻酔標的ネットワークの潜在的な役割を理解するための機序的な根拠を提供し、臨床的なリスク層別化、予後予測、および周術期管理戦略に向けたトランスレーショナルな示唆を与えるものです。

プロトコル

データ収集

先行文献12に基づき、周術期麻酔関連の薬物標的遺伝子120個をスクリーニングし、Supplementary Table S1にリスト化した。続いて、UCSC Xena TCGA TARGET GTEx Toil recomputeリソース（http://xena.ucsc.edu/）から、遺伝子発現プロファイル、臨床情報、および生存データを取得した。発現データセットは、The Cancer Genome Atlas (TCGA-OV)由来の卵巣漿液性嚢胞腺癌原発サンプル420検体と、Genotype-Tissue Expression (GTEx)プロジェクト由来の正常卵巣サンプル88検体で構成された。遺伝子発現値は、Toilパイプライン13によって生成されたRSEM遺伝子レベルのFPKM値として取得した。各ダウンストリーム解析におけるTCGAサンプルの組み入れを示す詳細なサンプルフローの説明は、Supplementary Table S2に記載している。さらに、外部バリデーションのため、GEOデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）からGSE2619314（n = 107サンプル）、GSE3016115（n = 58サンプル）、およびGSE6388516（n = 70サンプル）のデータセットをダウンロードし、一致する患者の遺伝子発現プロファイルと生存率を解析した。データの整合性を確保するため、ENSEMBL遺伝子識別子を公式遺伝子シンボルに変換した。サンプルの半分未満でしか発現していない遺伝子は除外した。加えて、GEOデータベースからヒト卵巣癌シングルセルトランスクリプトームデータセットGSE15460017および卵巣癌空間トランスクリプトームデータセットGSE211956-GSM6506110-SP118を取得した。

卵巣がんの空間トランスクリプトームシーケンシングデータの解析

空間トランスクリプトームデータは、Seurat19（バージョン5.4.0）を用いて処理した。スポットのフィルタリングには、シングルセルRNAシーケンシング解析と同じ品質管理基準（nFeature_RNA: 200–5,000、ミトコンドリア遺伝子比率 < 10%）を適用した。正規化および高変動遺伝子の特定後、PCAベースの次元削減を行い、Seuratのグラフベースのクラスタリングアルゴリズムを用いてクラスタリングを実施した。サブグループおよび遺伝子発現パターンは、SpatialFeaturePlot関数を用いて可視化した。さらに、空間トランスクリプトームレベルでの遺伝子発現量は、「AUCell」19（バージョン1.32.0）を用いて可視化および解析した。

scRNA-seqデータ解析

GSE154600から得られたシングルセルRNAシーケンシングデータを、Seuratパッケージ（バージョン5.4.0）19を用いて解析した。品質管理基準に基づき、低品質な細胞を除去した。具体的には、検出遺伝子数が200未満または5,000超の細胞、あるいはミトコンドリア遺伝子の割合が10%を超える細胞を除外した。NormalizeData関数を用いて正規化した後、VST法を用いて変動性の高い上位2,000個の遺伝子を同定した。これらの変動遺伝子に基づいてPCAを行い、上位15個の主成分をクラスタリングと次元削減に使用した。細胞クラスターの同定には、分解能0.5のFindNeighborsおよびFindClustersを用い、その後UMAPおよびt-SNEによる可視化を行った。また、FindAllMarkers関数を用いて、異なる細胞クラスターのマーカー遺伝子を同定した。さらに、CellMarker 2.020データベースを用いて細胞クラスターのアノテーションを行い、GSVAパッケージ（バージョン2.4.9）のssGSEA関数を用いて遺伝子活性の定量解析を実施した。

差分発現遺伝子（DEG）および機能解析

卵巣癌組織と正常卵巣組織の間におけるPARDTGsの発現プロファイルに基づき、「limma」パッケージ21（バージョン 3.56.2）を用いて差分的発現解析を行った。解析前に、FPKM発現値を数式 log2(FPKM+1) を用いてlog2変換した。差次的に発現しているPARDTGsを特定するために、limmaパッケージに実装されている標準線形モデルを適用した。偽発見率（FDR）が < 0.05 かつ |log2 fold change (FC)| が > 1 の遺伝子を有意に差次的に発現していると見なした。差次的に発現しているPARDTGsに対し、ClusterProfiler22（バージョン 4.8.3）を用いてGOおよびKEGGエンリッチメント解析を実施した。卵巣癌におけるPARDTGsの体細胞突然変異を検出するため、「maftools」23（バージョン 2.16.0）を用いてウォーターフォールプロットを作成した。次に、デフォルトパラメータを用いてSTRINGリポジトリ（バージョン 12.0）によりPARDTGsのPPIネットワークを構築した。

PARDTGに基づくリスクスコアリングシステムの開発

最適なPARDTGsを特定するために、段階的なCox比例ハザード回帰分析を行い、差発現PARDTGsの中から予後的に有意な遺伝子をスクリーニングし、卵巣がん（OV）の全生存期間への寄与度を決定しました。最終的な多変量Cox回帰モデルの比例ハザード仮定は、R survivalパッケージ（バージョン3.5.5）のcox.zph関数に実装されているSchoenfeld残差検定を用いて評価しました。シグネチャー遺伝子の発現レベルとそれに対応するCox回帰係数に基づいて、予後リスクスコアを算出しました。トランスクリプトームプラットフォーム間の不均一性を考慮し、予後モデルをTCGA-OV、GSE26193、GSE30161、およびGSE63885コホートにおいて独立して評価しました。各コホートについて、シグネチャー遺伝子の発現プロファイルを用いてコホート固有のリスクスコアを算出し、リスクスコアの中央値をカットオフ値として、患者を高リスク群と低リスク群に層別化しました。2群間の全生存期間（OS）をKaplan-Meier分析を用いて比較し、統計的有意性はログランク検定により評価しました。その後、リスクスコアの独立した予後価値を、単変量および多変量Cox比例ハザード回帰分析の両方を用いて評価しました。

卵巣がんの予後臨床モデルの開発

提供されたリスクスコアが従来の臨床変数を超えて予後情報を提供するかどうかを判断するため、リスクスコアとクリニック病理学的特性を組み合わせて、単変量および多変量Cox比例ハザード回帰分析を実施した。続いて、分子リスクスコアと、腫瘍のステージやグレードなどの臨床的に関連する変数を入力パラメータとして、予後ノモグラムを構築した。変数の選択は、単なる統計的有意性ではなく、臨床的な関連性と統合的な予後モデルを開発するという目的に基づいて行った。ノモグラムは「rms」パッケージ24（バージョン6.7.1）を用いて作成し、個々の変数から導出された合計スコアに基づいて、1年、3年、および5年の全生存確率を推定した。

免疫特性の評価

免疫細胞浸潤は、LM22シグネチャーマトリックスを用いたCIBERSORTアルゴリズムにより推定した。解析は1,000回のパーミュテーションで実施し、デコンボリューションのP値が< 0.05のサンプルを統計的に信頼できるものとした。卵巣がんにおける高頻度変異遺伝子の有病率を例示するため、maftools（バージョン2.16.0）を用いてウォーターフォールプロットを作成した。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、ClusterProfiler（バージョン4.8.3）を使用し、有意水準 p < 0.05で実施した。

ceRNAネットワークの構築

本研究では、予後遺伝子と転写因子の相互作用を解析するために NetworkAnalyst 3.0 (https://www.networkanalyst.ca/)25 を使用した。また、miRNA-TF 共調節ネットワークを NetworkAnalyst 3.0 を用いて構築した。

卵巣がん組織サンプル

選択的外科切除術を受けた患者から、卵巣癌組織および対応する隣接正常試料（N = 6）を収集した。本研究プロトコルは、産婦人科倫理委員会の承認を得た。 & 復旦大学附属婦産科病院 (2024-54-X1) の承認を得ており、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施された。

ウェスタンブロット分析

フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤を含むRIPA溶解バッファーを用いて、ヒト組織検体から全タンパク質を抽出した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイにより測定した。等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写した。転写後、TBS-Tで調製した5%脱脂粉乳を用いて、室温で90分間ブロッキングを行った。その後、膜をCytokeratin 81 (ウサギポリクローナル, 1:2,000) または GAPDH (マウスモノクローナル, 1:10,000) に対する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートした。洗浄後、適切な二次抗体を室温で90分間反応させた。タンパク質バンドは、強化化学発光 (ECL) 検出試薬を用いて可視化し、市販のイメージングシステムでキャプチャした。デンシトメトリー解析はImageJで行い、KRT81の発現量をGAPDHローディングコントロールで標準化した。ペアサンプル間のタンパク質発現の差はペアt検定を用いて評価し、P < 0.05を統計的に有意と見なした。

汎がん解析

本研究では、TCGAplot26（バージョン5.0.0）を用いてKRT81の発現レベル間の関係を特定した。統計的な相関を算出するために、ピアソン相関分析を利用した。また、cBioPortalプラットフォーム（http://www.cbioportal.org/）（バージョン7.0.6）を用いて、さまざまな癌におけるKRT81の変異プロファイルを検討した。

統計解析

すべてのデータ解析はRソフトウェア（version 4.3.1）を用いて行いました。2群間の比較にはウィルコクソン順位和検定を用い、3群以上の差の評価にはクラスカル・ウォリス検定を用いました。全生存期間はカプラン・マイヤー法を用いて解析し、生存曲線間の統計的有意性はログランク検定により判定しました。特に断りのない限り、両側 P 値 < 0.05 を統計的に有意とみなしました。有意水準は以下のように表記しています：P < 0.05 *、P < 0.01 **, P < 0.001 ***、および P < 0.0001 ****。

結果

空間的および単一細胞トランスクリプトーム解析における周術期麻酔関連薬剤標的遺伝子の免疫学的特性

シーケンシング深度の補正と実装手順にはSCTransformを使用し、最終的に11種類の異なる細胞型を特定した。各細胞サブポピュレーションにおける周術期麻酔関連薬標的遺伝子（PARDTGs）の重要性を評価するため、AUCell Rパッケージを用いて、各細胞サブポピュレーションにおけるPARDTG関連活性を決定した（Figure 1A,B）。続いて、スピアマンの順位相関を用いて、全遺伝子座における細胞存在量とPARDTG関連活性との相関を算出した。特筆すべきことに、PARDTG関連活性は腫瘍細胞と負の相関を示した（Figure 1C）。5名のOV患者から、計41,367個の細胞を含むシングルセルRNAシーケンシングデータを取得した。マーカー遺伝子の発現に基づき、細胞を11の主要なクラスターに分類した（Figure 1D）。細胞型の相互作用ネットワークおよびその強度はFigure 1Eに示されている。SeuratのssGSEAを用いて120個のPARDTGの発現をスコア化することで、すべてのシングルセルにおけるPARDTG活性を評価した（Figure 1F）。驚くべきことに、腫瘍細胞は他のすべての細胞型よりも著しく低い活性を示した（Figure 1G）。

卵巣癌における周術期麻酔関連薬の標的遺伝子の同定および分子生物学的解析

TCGAデータベースから、68個の変動発現PARDTGを同定し、これをFigure 2Aに示した（Supplementary Table S3も参照）。Figure 2Bは、TCGA-OVコホートにおけるこれら68個の周術期麻酔関連DEGの発現について記述している。続いて、DEGに関連するタンパク質間の複雑な関係を明らかにするために、PPIネットワークを構築した。その結果、卵巣癌の病態生理において重要な影響を及ぼす可能性のある5つの潜在的なハブ遺伝子（SLC6A4, CHRNA4, DRD2, SLC6A3, および GRIN2A）を同定した（Figure 2C）。さらに、卵巣癌における120個のPARDTGの分子変異プロファイルを調査したところ、ナンセンス変異が最も一般的な変異型であった（Figure 2D）。最も頻繁に変異していた遺伝子は、SCN10A, DNMT1, GRIN2A, LTF, および SCN11Aであった。コピー数多型（CNV）変異の頻度を検討した結果、変異を有する上位20個のPARDTGにおいて有意なCNV変化が認められた（Figure 2E）。GOおよびKEGGエンリッチメント解析の結果、PARDTGは神経活性リガンドシグナリング、カルシウムシグナリング経路、ホルモンシグナリング、アンフェタミン依存症、コカイン依存症、および神経活性リガンド受容体相互作用に関連していることが示された（Figure 2F,G）。

周術期麻酔関連薬剤標的遺伝子に基づく予後予測モデルの構築と検証

モデルの複雑さを最小限に抑えるため、StepAICを用いて遺伝子セットを削減し、最終的に17個のPARDTGを保持して予後モデルを構築した（Supplementary Table S4）。グローバルSchoenfeld残差検定では、比例ハザード仮定からの有意な逸脱は認められず（p = 0.265）、17遺伝子予後モデルの信頼性が裏付けられた。リスクスコアは以下の式を用いて算出した：risk score = ADRA1D*(0.4452) + ADRB1*(-0.5347) + CHRNA4*(0.3495) + DBH*(-0.5765) + EPHA4*(0.2827) + EPHA7*(-0.5707) + EPHA8*(0.8765) + GABRB2*(0.5979) + GRIN2A*(-0.1750) + GRIN2D*(0.2746) + KCNA1*(2.2753) + KRT81*(0.1101) + OPRD1*(-3.2372) + SLC6A2*(1.4901) + SLC18A1*(4.2170) + SLC18A2*(-1.4600) + CHRNA1*(-0.1723)。その後、患者をリスクスコアに基づいて低リスク群と高リスク群に分けたところ、TCGA-OV（Figure 3A, p < 0.0001）、GSE26193コホート（Figure 3B, p = 0.00021）、GSE30161コホート（Figure 3C, p = 0.0017）、およびGSE63885コホート（Figure 3D, p = 0.0041）において、低リスク群は高リスク群と比較してOSが有意に改善していた。さらに、Figure 3E–H は、TCGA-OV、GSE26193、GSE30161、およびGSE63885コホートにおける生存ステータスとリスクスコアの分布を示しており、OVにおける予後モデルの安定性と予測信頼性の独立した根拠となっている。

ノモグラムに基づく生存モデルの構築と評価

単変量および多変量のCox回帰分析の結果、リスクスコアは卵巣癌患者における予後の独立した予測因子であることが示されました（Figure 4A,B）。TCGA-OVコホートにおけるモデル遺伝子の発現分布、対応するリスクスコア、および臨床病理学的特性をFigure 4Cに示します。臨床的な適用性を向上させるため、リスクスコアに加えて年齢、腫瘍ステージ、およびグレードを組み込んだ予後ノモグラムを構築し、全生存期間（OS）を推定しました（Figure 4D）。遺伝子シグネチャー単独と比較して、統合ノモグラムはより優れた予測性能を達成しました。生存分析では、低リスク群のOSが高リスク群よりも有意に長いことがさらに示されました（Figure 4E; P < 0.0001）。統合モデルによるOS予測の時間依存性AUC値は、0.769、0.690、および0.728でした（Figure 4F）。決定曲線分析では、広範な閾値確率においてより大きなネットベネフィットが示され、ノモグラムの潜在的な臨床的有用性が裏付けられました（Figure 4G）。さらに、キャリブレーションプロットにより、予測生存確率と観察生存確率が高い一致を示し、モデルのキャリブレーションが良好であることが示唆されました（Figure 4H）。総じて、これらの結果は、提案したノモグラムが卵巣癌（OV）患者の予後評価において強力な予測能力を有していることを示しています。

PARDTGベースの予後モデルと免疫浸潤および腫瘍免疫微小環境との関連性

免疫浸潤を特性付けるため、サンプル全体で免疫細胞の量を定量化した。腫瘍浸潤免疫細胞と有意に関連している17個の遺伝子が同定され、そのうちADRA1D、KCNA1、およびSLC18A2はM2マクロファージと正の相関を示した（Figure 5A）。次に、これらの遺伝子の細胞内局在パターンを調査した。ドットプロット解析により、KRT81は主にCD8TexおよびTprolif細胞で発現している一方、EPHA4の発現は主に内皮細胞および線維芽細胞に集積していることが明らかになり、腫瘍微小環境内の異なる細胞コンパートメントへの関与が示唆された（Figure 5B）。さらに、患者のTIDEスコアを評価したところ、高リスクサブクラスターでTIDEスコアが高く、正の相関があることが観察された（Figure 5C）。加えて、ステムネス濃縮スコアは、低リスク群よりも高リスク群で有意に高かった（Figure 5D）。体細胞変異解析の結果、両リスク群において全体的な変異頻度が高いことが明らかになった（Figure 5E,F）。その中でも、CSMD3およびMUC16の変異頻度は高リスクサンプルでより高かった。

GSEAの結果、抗原処理・提示や同種移植拒絶反応を含む免疫関連経路は低リスク群で有意に濃縮されていた一方で、アクチン細胞骨格の調節、がんにおけるプロテオグリカン、モータータンパク質などの腫瘍浸潤および運動能に関連する経路は、主に高リスク群で濃縮されていることが明らかになった（Figure 5G,H）。これらの知見は、高リスク群の患者では免疫療法に対する反応性が限定的である可能性を示唆している。

卵巣がんにおける予後関連PARDTGの同定およびネットワーク解析

そのメカニズムを解明するため、490種類のmiRNAと17個のバイオマーカーの潜在的な調節ネットワークを特定しました（図6A）。そのうち、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-106b-5p、およびhsa-miR-20b-5pが、ほとんどの遺伝子を調節する可能性を有していました。最終的に、本研究の結果により、候補診断遺伝子を調節する37個の転写因子が特定されました（図6B）。さらに、FOXC1も複数の調節機能を持つことが判明しました。

KRT81発現のパンキャンサー解析

KRT81の発現を評価するため、TCGAからRNA-seqデータを取得した。その結果、ほとんどのがんで高発現していたが、GBM、LGG、SKCM、TGCT、およびTHCAでは低レベルで発現していることが示唆された（図7A）。バイオインフォマティクス解析によって判定された、卵巣がんにおいてKRT81が高発現しているという結果を検証するため、ウェスタンブロット実験を行った。その結果、KRT81の発現は正常組織と比較して腫瘍組織で有意に上昇しており、TCGAのトランスクリプトームデータとおおむね一致していた（図7B、付録 図S1、および付録表S5）。KRT81とがんとの関係を明らかにするため、遺伝子発現と免疫細胞浸潤を調べた（図7C）。解析の結果、ほとんどのがんでKRT81の発現がT細胞、Tregs、およびM2マクロファージの浸潤と正の相関があることが明らかになった。加えて、ほとんどのがんでKRT81の発現がストローマスコアおよび免疫スコアと正の関連があった（図7D）。さらに、KRT81発現と異数性スコア（Aneuploidy Score）との相関を解析したところ、レーダーチャートにより、UCEC、SARC、LUAD、LIHC、およびKIRPにおいてKRT81が異数性スコアと相関していることが示された（図7E）。次に、KRT81と腫瘍倍数性（Tumor Ploidy）との相関を解析したところ、レーダーチャートにより、THCA、TGCT、SARC、MESO、LIHC、およびCESCにおいてKRT81が腫瘍倍数性と相関していることが示された（図7F）。その後、レーダーチャートにより、UCEC、THYM、LUAD、LIHC、GBM、およびBRCAにおいてKRT81がSNVネオアンチゲンと相関していることが示された（図7G）。さらに、cBioPortalのオンライン解析により、KRT81遺伝子変異の頻度が最も高いのはUCECであり、その大部分が「変異（mutation）」および「増幅（Amplification）」であることが明らかになった（図7H,I）。単変量Cox比例ハザード回帰解析により、KIRC、LUAD、およびSTADにおいてKRT81がOSの予測因子であることが特定された（図7J）。

データの可用性：

本研究で解析した公開データセットは、TCGA、UCSC Xena、およびGEOから入手可能です。本研究で生成されたオリジナルのウェスタンブロット画像および対応する定量データは、補足資料（Supplementary Figure S1 および Supplementary Table S5）に提供されています。

空間トランスクリプトーム解析：遺伝子発現ヒートマップ、相関プロット、細胞相互作用ネットワーク。
図1空間的および単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）におけるPARDTG関連の特徴。 (A, B) PARDTG発現強度の空間マッピング（C)、PARDTG関連活性のスピアマン相関。 (D) 細胞型の解析 (E) 細胞型間の相互作用数および強度の解析 (F) 細胞におけるPARDTG濃縮値。 (G) PARDTGの分布。略語：PARDTG = 周術期麻酔関連薬標的遺伝子、scRNA-seq = シングルセルRNAシーケンシング。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子発現解析のボルケーノプロット、ヒートマップ、ネットワーク図；変異、CNV、パスウェイデータ。
図 2. OV患者におけるPARDTGsの遺伝子改変ランドスケープ。(A) OVにおけるDEGのボルケーノプロット（青：発現低下したDEG、赤：発現上昇したDEG、灰色：安定した遺伝子）、FDR< 0.05 かつ |log2FC| > 1。(B) OV群と正常群の間で差分発現した特徴を示すヒートマップ。青は正常群、赤はOV群であり、青い正方形は低発現、黄色い正方形は高発現を表す。(C) Stringウェブサイトから得られた、周術期麻酔関連DEGのPPIネットワーク。(D) TCGAコホートにおける上位20個のPARDTGs。(E) 上位20個のPARDTGsにおけるCNV gain、loss、およびnon-CNVの頻度。(F) 濃縮されたGO用語のGOドットプロット。(G) 濃縮されたKEGGパスウェイの棒グラフ。OV = 卵巣癌; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PPI = タンパク質相互作用。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

患者のリスク層別化のためのイベント発生までの時間を比較したカプランマイヤー生存解析チャート。
図 3. 卵巣癌におけるPARDTGに基づく予後シグネチャーの構築と検証。(A-D) (A>) TCGA-OV、(B>) GSE26193、(C>) GSE30161、(D>) GSE63885における低リスク群および高リスク群のOS。(E-H) 生存状態と生存期間を用いたPARDTG関連リスクスコアの分布：(E>) TCGA-OV、(F>) GSE26193、(G>) GSE30161、(H>) GSE63885。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ノモグラムを用いたがん予後解析；ハザード比、ヒートマップ、生存曲線、ROC曲線、キャリブレーション
図4PARDTG由来のリスクシグネチャーに基づく予後ノモグラムの構築および検証。 (A, B) TCGA-OVコホートにおける臨床病理学的特徴およびリスクスコア。 (Cリスクスコア別の臨床的特徴の分布およびモデル遺伝子の発現。D) 卵巣がん患者の予後を予測するためのノモグラム。 (E) 2つのOV群に対するカプラン・マイヤー解析（FTCGA-OVにおけるROC曲線解析。GDCAは、ノモグラムおよびその他の臨床的特徴の正味の利益（ネットベネフィット）を示している。Hキャリブレーションプロットは、TCGA-OVにおける全生存期間（OS）を示している。略語：ROC = 受信者動作特性曲線、DCA = 決定曲線分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒートマップ、ドットプロット、およびバイオリン図による遺伝子発現相関、ならびにリスク解析と変異頻度の提示。
図5低リスクおよび高リスク患者における腫瘍微小環境解析。 (A) PA関連予後モデルにおける腫瘍浸潤免疫細胞と遺伝子の相関。(B) 異なる細胞サブタイプにおける予後バイオマーカーの平均発現量および割合を示すバブルプロット。 (C) TIDEスコアのバイオリンプロット（D腫瘍幹細胞性の濃縮スコアのバイオリンプロット。E, F( における体細胞変異の特徴を示すウォーターフォールプロットE）低リスクおよび（F高リスクスコアカテゴリーG, H( ) におけるKEGGパスウェイのGSEA解析結果G）低リスクサブグループおよび（H) 高リスクサブグループ。略語：TIDE = 腫瘍免疫機能不全および排除、GSEA = 遺伝子セット濃縮解析。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

複雑な遺伝子間関係と結合性を示す遺伝子相互作用ネットワーク図。
図6予後マーカーの相互作用ネットワーク解析。 (A) miRNA予後マーカー共調節ネットワーク (B転写因子-予後マーカー共調節ネットワーク この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

がんバイオマーカー研究、グラフおよびヒートマップ、腫瘍マーカー、遺伝子発現、統計解析
図7の発現レベル、免疫学的特性、および遺伝学的変異 KRT81 ヒト腫瘍における。 (A) KRT81 TCGA腫瘍および隣接組織における発現。B) ～のウェスタンブロット解析 KRT81 卵巣がん患者6名（n = 6）から得られた、対となる隣接正常組織および腫瘍組織におけるタンパク質発現。相対的なバンド強度はGAPDHで標準化し、対応のあるt検定を用いてデータを解析した。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。   (C）〜の相関 KRT81 そして、免疫細胞比率をヒートマップで表示します。D）〜との相関 KRT81 および免疫スコア、ストローマスコア、ESTIMATEスコアをヒートマップで表示した。E-G) ～の発現との相関 KRT81 および（E) 異倍数性スコア (F腫瘍倍数性、G) TCGAデータベースにおけるSNVネオアンチゲン。 (H) KRT81 cBioPortalデータベースから得られた、異なるがん種における変異。I）～の分布 KRT81 がん種横断的な変異部位。J）～に関するパンキャンサーCox回帰分析 KRT81 TCGAの各種がんにおいて。*p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. 略語：SNV = 一塩基バリアント、N = 正常組織、T = 腫瘍組織。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表 S1：周術期麻酔関連の薬剤標的遺伝子こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表S2：サンプルフローの説明。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表 S3：周術期の麻酔関連薬剤標的遺伝子における差分的発現遺伝子。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表 S4：予後に関する周術期麻酔関連薬剤標的遺伝子。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表S5：ウェスタンブロットのソースデータ。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図 S1：ウェスタンブロッティングのオリジナルデータ。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

がん治療ワークフローにおいて不可欠な要素である周術期麻酔は、その潜在的な免疫調節作用、微小環境の再構築能、および腫瘍播種の促進の可能性から、ますます注目を集めています。がんは、厳密に遺伝子駆動型の局所病変ではなく、全身的かつ生態学的な疾患であるという認識が高まっており27、周術期の生理学的調節不全、炎症反応、および代謝ストレスが微小環境のニッチを再形成し、腫瘍の進化経路に影響を及ぼす可能性があります。本研究では、多層的なトランスクリプトーム統合を通じて、OVにおけるPARDTGsの発現パターン、生物学的関連性、および予後価値を体系的に記述し、周術期の精密麻酔に向けた潜在的な手がかりを提供しました。

空間的および単一細胞トランスクリプトームプロファイリングにより、PARDTG活性に顕著な空間的変動があることが明らかになり、腫瘍上皮細胞では活性が低下し、免疫細胞、内皮細胞、および線維芽細胞では活性が上昇していることが示されました。この「非腫瘍細胞濃縮」パターンは、麻酔薬の標的ネットワークが、腫瘍細胞固有の直接的なメカニズムを通じてではなく、主にストローマ細胞や免疫細胞の状態を調節することで効果を発揮している可能性を示唆しています。この観察結果は、腫瘍の進行が腫瘍細胞とその宿主微小環境によって共同的に形成されるという概念と一致しています28。特に、手術によって誘発される急性炎症、一過性の免疫抑制、および組織リモデリングは、腫瘍が転移や再発のリスクを高めるために利用しうる、短期間の創傷治癒微小環境を形成する可能性があります29。

TCGAコホートのさらなる解析により、神経活性リガンド-受容体相互作用、カルシウムシグナリング、および依存症関連パスウェイに有意に濃縮された68個の発現変動PARDTGが同定された。構築したPPIネットワークでは、DRD2、SLC6A3、SLC6A4などの神経伝達物質トランスポーターおよび受容体に関連するいくつかのハブ遺伝子が強調されており30、OVの進行において周術期の神経伝達物質シグナリングによる追加的な調節入力があることが示唆された。近年の研究では、DRD2アンタゴニストであるONC206がOV細胞およびトランスジェニックマウスモデルにおいて増殖と浸潤を抑制し、細胞周期停止とアポトーシスを誘導することが示されており、この軸の治療的可能性が浮き彫りとなった。CHRNA4およびGRIN2Aは、それぞれコリン作動性受容体およびNMDA受容体関連タンパク質をコードしており、これらの受容体の活性化は細胞内Ca2⁺流入を促進し31,32、一方でカルシウムの摂動は細胞骨格を再構成し、腫瘍促進的な転写プログラムを活性化させ得る33。加えて、依存症関連受容体（例：μ-オピオイド受容体）はmTORC1の活性化および免疫回避に関連していることが示されている34。総合すると、これらの知見は、麻酔標的パスウェイと周術期ストレス-神経-免疫ネットワークとの間に潜在的なクロストークが存在し、それによって短い周術期ウィンドウ内での腫瘍の可塑性と再発リスクに影響を及ぼしていることを示唆している。

17遺伝子リスクモデルは、複数の独立したコホートにおいて安定した予後予測能を示した。高リスク群の患者では、「アクチン細胞骨格の調節」や「がんにおけるプロテオグリカン」などのパスウェイが濃縮されており、細胞骨格のリモデリングの亢進と転移能の高さが示唆された。免疫プロファイリングの結果、高リスク群ではM2マクロファージの割合が高く、免疫チェックポイント関連遺伝子の発現が上昇しており、TIDEスコアも高値であった。M2マクロファージは免疫回避を促進し、術後の炎症活性化が骨髄由来抑制細胞（MDSCs）の動員を誘導する可能性がある35。特筆すべき点として、EPHA4は主に内皮細胞および線維芽細胞サブセットで発現しており、血管調節、ストロマのリモデリング、および腫瘍微小環境における相互作用に関与している可能性が示唆された。EPHA4はEph受容体チロシンキナーゼファミリーの一員であり、Eph/ephrinシグナル伝達を介した細胞間コミュニケーションの重要な媒介因子として機能する。EPHA4の活性化は、細胞骨格の再編成、細胞接着、遊走、および細胞外マトリックス組織化に関与する下流パスウェイを調節し得る36。腫瘍微小環境において、EPHA4シグナルの調節不全は、腫瘍細胞の浸潤、血管新生反応、ストロマの活性化、および悪性細胞と周囲のストロマ成分との相互作用を促進することが報告されている37。これらの知見は、EPHA4が血管・ストロマ間のコミュニケーションおよび腫瘍生態学的リモデリングを調節することで、高リスク患者における攻撃的な生物学的特性に寄与している可能性を示唆している。同時に、高リスク患者では、ストロマ相互作用や免疫回避に関与するMUC16やCSMD3などの遺伝子において、より高い変異頻度が認められた38,39。総合すると、高リスク患者は、細胞骨格ダイナミクスの調節不全、免疫抑制的な微小環境、およびマトリックスリモデリングを特徴とする悪性な生態学的特徴を示すと考えられ、PARDTGsが腫瘍生態系の変化および疾患の進行に関連している可能性が示唆された。

麻酔薬はまた、非コードRNAネットワークの調節を介して多遺伝子発現をリプログラミングし、腫瘍細胞の接着、遊走、アポトーシス耐性、および幹細胞性の維持に影響を及ぼすことで、術後の再発リスクを変化させる可能性がある40,41。我々のmiRNA–転写因子コア調節ネットワークにおいて、miR-27a-3p、miR-34a-5p、およびmiR-106b-5pが潜在的な調節ハブとして同定され、OVの進行および麻酔に関連する薬理学的反応への関与を支持する広範な証拠が得られている42,43,44。コア転写因子であるFOXC1は、OVにおける遊走、浸潤、およびEMT表現型の促進に重要な役割を果たしており、複数の非コードRNAによって上流で調節されている45。

パンがん解析は、卵巣がんの予後モデルを検証するためではなく、異なる悪性腫瘍におけるKRT81の生物学的特性をさらに探索するために実施されました。我々の解析において、KRT81はほとんどのがん種で有意に上昇しており、異数性、免疫浸潤、およびストローマスコアと相関していました。これは、生態学的ニッチの再構築や免疫回避への関与を示唆しています。タイプIIケラチンファミリーの一員として、KRT81は上皮細胞の細胞骨格の完全性、細胞の機械的安定性、およびストレス適応の維持に関与しています。KRT81の発現調節不全は、細胞骨格の構成、上皮分化、および腫瘍細胞と周囲の微小環境との相互作用に影響を与えることで、腫瘍細胞の可塑性に影響を及ぼす可能性があります。さらに、異常なケラチンの再構築は、細胞増殖、遊走、浸潤、および免疫-ストローマ間のコミュニケーションの調節を通じて、がんの進行に関与していることが示唆されています。先行研究では、KRT81がOVにおける免疫サブタイピングおよび予後層別化のバイオマーカーとして機能し46、トリプルネガティブ乳がんにおける免疫抑制的な微小環境の形成および免疫療法反応の予測に寄与することが報告されています47。したがって、KRT81は、メカニズム的およびトランスレーショナルな関連性を持つ、術期の腫瘍可塑性ネットワークにおける重要なノードである可能性があります。

総合的に見て、本研究はOVにおけるPARDTG発現エコロジーの空間的および単一細胞レベルでの初の特性解析を提供し、それらと免疫微小環境、幹細胞性、およびゲノム不安定性との関連を明らかにしました。これは、周術期麻酔関連薬標的遺伝子が腫瘍の進化軌道に関連している可能性を示唆しています。とはいえ、いくつかの限界を認める必要があります。第一に、本研究は主に公開されているトランスクリプトームデータセットに基づいており、サンプルソース、シーケンシングプラットフォーム、およびコホート特性の違いが、潜在的なバッチ効果を導入し、知見の堅牢性に影響を与えた可能性があります。第二に、検証には外部コホートが使用されましたが、予後モデルは回顧的データセットから開発されており、特徴量選択アプローチによる潜在的な過学習を完全に排除することはできません。第三に、単一細胞および空間トランスクリプトーム解析によってPARDTGsの生物学的役割に関する洞察が得られましたが、これらの知見は主に計算論的な推論に基づいており、さらなる実験的検証が必要です。加えて、パンキャンサー解析や免疫相関解析を含むいくつかの探索的解析では多重比較が行われており、潜在的な偽陽性の関連性については慎重に解釈されるべきです。最後に、空間トランスクリプトーム解像度の限界と、予測された調節ネットワークの機能的検証が不足していることがさらなる限界となります。特定されたメカニズムをさらに検証するために、実験モデルや臨床サンプルを組み込んだ今後の研究が求められます。

本研究により、PARDTGがOVにおいて重要な転写生態学的機能を果たしており、術後の微小環境による浸潤および免疫回避に関与している可能性が明らかになりました。これは、周術期の精密麻酔、リスク層別化、および再発防止のための新たな分子根拠を提供するものです。

開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します

謝辞

TCGA-OV、GSE26193、GSE30161、GSE63885、GSE154600、およびGSE211956を含む、TCGAおよびGEOデータベースにて貴重なデータセットを共有してくださった研究者の皆様に心より感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗Cytokeratin 81抗体 (rabbit polyclonal)Proteintech, USA11342-1-AP
抗GAPDH抗体 (mouse monoclonal)Proteintech, USA60004-1-Ig
BCAタンパク質定量キットThermo Fisher, USA23225
CIBERSORTStanford Universityhttps://cibersort.stanford.edu免疫浸潤 | LM22シグネチャーマトリックス | 免疫細胞浸潤解析
OV患者の臨床的特徴UCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/臨床データ | 341名の患者 | 臨床相関解析
clusterProfilerパッケージBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler機能濃縮解析 | Version 4.8.3 | GO、KEGGおよびGSEA解析
ggplot2パッケージCRANhttps://cran.r-project.org/package=ggplot2データ可視化 | Version 4.0.2 | データ可視化
GSE26193GEOデータベースhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE26193検証データセット | 107サンプル | 外部検証
GSE30161GEOデータベースhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30161検証データセット | 58サンプル | 外部検証
GSE63885GEOデータベースhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63885検証データセット | 70サンプル | 外部検証
GSVAパッケージBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA遺伝子セット濃縮解析 | Version 2.4.9 | ssGSEA解析
limmaパッケージBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/limma/差異発現解析 | Version 3.56.2 | DEG解析
OV患者の全生存期間情報UCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/生存データ | 353名の患者 | 予後予測モデル構築
PVDFメンブレンMillipore, USAIPVH00010
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/バイオインフォマティクスソフトウェア | Version 4.3.1 | 統計解析
RIPAバッファーBeyotime, ChinaP0013B
SeuratパッケージCRANhttps://satijalab.org/seurat/シングルセル解析 | Version 5.4.0 | シングルセルRNA-seq解析
STRINGデータベースSTRING Consortiumhttps://string-db.orgタンパク質相互作用データベース | Version 12.0 | PPIネットワーク構築
survivalパッケージCRANhttps://cran.r-project.org/package=survival生存解析 | Version 3.5.5 | 生存解析
TCGA TARGET GTEx (Toil) 卵巣遺伝子発現データUCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/トレーニングデータセット | 420のTCGA腫瘍サンプル | トレーニングコホート
TCGA TARGET GTEx (Toil) 卵巣正常組織データUCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/参照正常データセット | 88のGTEx正常サンプル | 差異発現解析

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