本プロトコルでは、ラットにおける皮膚瘻（cutaneous vesicostomy）の作成および術後の創傷管理に関する標準的な手法を提供し、前臨床的な脊髄損傷研究において持続的な低圧尿路ドレナージを可能にします。
方法論記事
神経因性膀胱研究における低圧尿路排尿のためのラットモデルでの膀胱口形成術
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ラットは、脊髄損傷（SCI）に起因する神経原性下部尿路機能不全（nLUTD）に関する前臨床研究の主要な動物モデルです。ラットは解剖学的および機能的にヒトと類似しているため、SCIに伴う主要な病理学的結果を忠実に再現します。しかし、重要なトランスレーショナルギャップが依然として存在します。ヒトにおける標準的な膀胱管理は通常、持続的または間欠的なカテーテル留置に依存していますが、齧歯類で同様のアプローチを行うことは困難です。一般的な手動による膀胱圧搾は、極めて高い膀胱内圧を発生させ、それがSCI後の病理的な膀胱リモデリングを独立して促進することで、手法上のバイアスを導入する可能性があります。本プロトコルでは、前臨床SCI研究において持続的な低圧尿路ドレナージを確立するための、ラットにおける皮膚膀胱瘻造設術および術後の創傷管理について記述します。皮膚膀胱瘻造設術とは、膀胱頂部と下腹壁の間にストーマを外科的に作成することであり、これにより持続的な尿ドレナージが可能となり、低抵抗の排尿経路を維持して尿道をバイパスできます。これにより、過度な尿貯留と高膀胱内圧を回避することができ、正常な貯尿および保持機能は消失することを認めつつも、受傷後早期に恥骨上または経尿道的な尿路転換を用いて臨床的に行われる持続的低圧減圧の概念に近づけることができます。その結果、反復的な過充満や高圧の手動膀胱圧搾によって遮られていた可能性のある治療効果を、より容易に検出できる可能性があります。さらに、膀胱瘻造設術は、前臨床SCI研究における性別に関連した制約を緩和するための概念的な戦略を提供します。オスの齧歯類は尿道長がかなり長く、流出抵抗が高いため、手動による膀胱圧搾が実質的に困難であり、臨床的なSCI症例では男性患者が大多数であるにもかかわらず、ほとんどの前臨床研究がメスに限定されてきました。代替的なドレナージ戦略として、膀胱瘻造設術は実験的な膀胱管理パラダイムを広げ、将来の研究のトランスレーショナルな関連性を高める可能性を秘めています。なお、オスラットにおける実現可能性と結果については、今後の専用の追跡研究で確立する必要があります。
概要
健康な膀胱機能は、膀胱筋と尿道括約筋の協調的な機能に基づいています。これは、脳、中枢神経系（CNS）、および末梢神経系（PNS）を含む複雑な神経ネットワークを通じて達成され、これにより下部尿路（LUT）の意識的な制御が可能になります1,2。これらのメカニズムの複雑さと、そのスイッチのような回路構成3により、膀胱機能は広範な損傷や疾患の影響を受けやすくなっています。したがって、脊髄損傷（SCI）後、ほぼすべての患者において膀胱の感覚および制御機能の障害が生じます4,5。神経因性膀胱という用語は、損傷の特性に応じて、尿の貯留および／または排出に影響を及ぼす幅広い機能障害を包含しています。特に、仙骨上部での損傷は、括約筋の過活動を伴う排尿筋の過活動を引き起こし、多くの場合、両者の協調性の喪失（排尿筋-括約筋不協調、DSDと呼ばれる）を伴い、その結果、過剰な尿貯留と高い膀胱内圧を招きます6,7。これはLUTに深刻な損傷を与え、上部尿路（UUT）の完全性を脅かし、未治療のまま放置されると生命を脅かす合併症を引き起こす可能性があります8。カテーテルによる間欠的または持続的な尿路ドレナージは、SCI後の人間における現在の膀胱管理の標準であり、安全で圧力をかけない処置を通じて膀胱の過充満を防止します9,10,11,12。
脊髄損傷（SCI）に対する有効な治療法が現在存在せず、それに伴う神経性下部尿路機能不全（nLUTD）の管理が主に対症療法に留まっているため、新たな治療戦略の開発は主要な研究優先事項となっています。動物モデルを用いることで、標準化された実験条件下で優れた群内均質性を確保しつつ、ヒトに匹敵する複雑さで疾患メカニズムを調査することが可能です13。これらのモデルの中でラットは主要な前臨床モデルであり、SCI研究の大部分はこの種を用いて行われています14,15。この傾向は、ラットがヒトと解剖学的および機能的に類似していること、病理学的反応が再現可能であること、そして広く利用可能であることに起因しています。それにもかかわらず、げっ歯類モデルから得られた膀胱関連の知見の解釈や臨床的妥当性を制限し得る、重要なトランスレーショナルギャップが依然として存在しています。
ラットは脊髄損傷（SCI）後にヒトで見られる主要な特徴に類似した神経因性下部尿路機能不全（nLUTD）を発症しますが、膀胱管理の方法は種間で大きく異なります。ラットでは間欠的カテーテル留置やその他の永久的な尿路排出法が一般的に困難であるため、尿の排出は通常、手動による膀胱圧迫によって行われます16。この手法は、臨床現場では一般的に推奨されていない クレデ法（Credé maneuver）17に類似しており、膀胱内圧を著しく上昇させます。その結果、SCI後の病的な膀胱リモデリングを独立して促進することで、手法上のバイアスが生じ、実験結果のトランスレーショナルな妥当性が低下したり、真の治療効果が不鮮明になったりする可能性があります。さらに、性別による解剖学的相違という制限もあります。雄のげっ歯類は尿道がかなり長いため流出抵抗が高くなり、手動での膀胱圧迫が実質的に困難となるため、ほとんどの前臨床SCI研究は実質的に雌の動物に限定されています14。臨床的なSCI症例の大部分が男性であること18,19を考慮すると、この乖離は、ラットを用いた前臨床SCIモデルにおける代替的な膀胱管理戦略の必要性をさらに強調しています。
皮膚瘻孔造設術（cutaneous vesicostomy）とは、膀胱頂部を皮膚まで引き出し、縫合して固定することで、膀胱と下腹壁の間にストーマを外科的に作成する術式です。これにより、尿道をバイパスし、低圧の排尿経路を維持しながら連続的な尿ドレナージが可能になります。主に複雑な疾患を持つ小児や、従来のドレナージ法が不適切な場合に用いられ、メンテナンスの手間が少なく合併症率も低いため、信頼性の高い尿路転換術を提供します20,21,22。臨床応用以外に、齧歯類モデルにおいても膀胱瘻造設術が成功していますが23,24,25,26、脊髄損傷（SCI）の文脈では行われていません。
最近の研究16において、我々は前臨床SCIモデルにおける手動膀胱排出に伴うトランスレーショナルな限界に取り組み、ラットにおける膀胱造設術と、長期的なフォローアップを可能にする術後の創傷管理レジメンを導入しました。これら2つの膀胱管理アプローチを直接比較したところ、手動膀胱排出後にはより顕著な膀胱の構造的変化が認められた一方で、膀胱造設術を施した個体では、いくつかのパラメータにおいて健康な対照群に近い値を示しました。特に、膀胱壁の厚さは、健康なラットの平均 768.26 µm (SD 28.05) から、手動膀胱排出を伴うSCIの2ヶ月後には 1181.94 µm (SD 289.56) に増加し、個体によっては最大 1485 µm に達しました。対照的に、膀胱造設術で管理されたラットの平均膀胱壁厚は 963.08 µm (SD 68.82) であり、1000 µm を超えた個体はわずか1匹のみでした。
本研究では、前臨床のSCI研究において再現性のある持続的な低圧尿路ドレナージを可能にするため、周術期ケアおよび術後の創傷管理を含む、ラットにおける膀胱造設術の標準化プロトコルを提供します。本プロトコルは、手動による高圧の膀胱圧迫が手法的なバイアスをもたらす可能性のある研究や、雄動物の導入が望ましい研究において、本手法の再現を容易にし、その適合性を判断する研究者を支援することを目的としています。本プロジェクトの目的は、SCIラットに対する標準化された膀胱造設プロトコルを確立し、2ヶ月間のフォローアップ期間を通じてその実現可能性と安全性を評価することでした。さらに、皮膚関連の合併症を最小限に抑え、定期的なキャリブレーションによってストーマの開通性を維持するために、標準化された術後創傷管理レジメンを適用しました。
プロトコル
本研究では、生後3ヶ月の雌のLewisラットを使用した。本プロトコルは、主にSCI後の手動による膀胱排尿を避けるために開発されたものであるが、挫傷SCIの手順の詳細についてはここでは省略し、既報の通りとする。すべての処置は、オーストリア政府の動物研究法的事務所（BMWFW-2022-0.062.928およびBMWFW-2023-0.848.340）の承認を得ており、動物使用に関する地域のガイドラインおよびARRIVEガイドラインに従って実施された。全体として、膀胱ろう造設の手順には約15分を要する。
1. 術前準備
- 顕微鏡または拡大鏡（2.5–3.5倍）、必要な外科器具、およびヒートパッドを含む、滅菌された作業領域を準備する。
- ヒートパッドを30°C–35°C（手で触れて暖かい程度）に予熱し、手術の間はこの温度を維持する。長時間の外科処置中にヒートパッドの温度が30°C以下に低下した場合は、新しいものと交換する。
2. 動物の準備
- 麻酔
- 外科的手技に適した全身麻酔法を用いてください。
- 提供された計算表に従い、デクスメデトミジン（0.15 mg/kg）、ミダゾラム（2 mg/kg）、およびフェンタニル（0.005 mg/kg）を含む新鮮な麻酔混合液を調製します（表 1動物の正確な体重に最も近い体重に基づき、麻酔薬の投与量とそれに対応する最終注入量を選択し、27G針を装着した1 mLシリンジを用いて混合液を筋肉内投与する。
- 手術準備
- ラットを麻酔後、下腹部から腟領域にかけて除毛する。
- 手術部位を温かい石鹸水で2回洗浄してください。
- 温かい清浄水で手術野を2回洗浄する。
- 7.5%ポビドンヨードと70%アルコールの混合液を用いて、腟領域を含む手術部位を2回消毒する。
- あらかじめ加温した0.9%塩化ナトリウム（NaCl）0.2 mLに溶解したエンロフロキサシン1.5 mgおよび長時間作用型メロキシカム0.2 mgを、皮下投与する。
- 水分喪失を補うため、あらかじめ加温した0.9% NaClを3 mL皮下投与する。
- 角膜の乾燥を防ぐため、両眼に2%デクスパンテノール点眼軟膏を塗布する。
- 動物をあらかじめ温めておいたヒーティングパッドの上に仰臥位で固定し、顕微鏡または拡大鏡を調整してください。
- 手術を開始する前に、両後肢に侵害受容反射試験を行い、十分な外科的麻酔平面にあることを確認してください。
- 逃避反射が依然として認められる場合は、2分間待機してから侵害受容性逃避テストを繰り返します。反射が消失するまで、この手順を2分間隔で継続してください。
| 体重 (g) | メデトミジン (1 mg/mL), mL | ミダゾラム (5 mg/mL), mL | フェンタニル (0.05 mg/mL), mL | 総量 (mL) |
| 100 | 0.015 | 0.04 | 0.010 | 0.065 |
| 125 | 0.019 | 0.05 | 0.013 | 0.082 |
| 150 | 0.023 | 0.06 | 0.015 | 0.098 |
| 175 | 0.026 | 0.07 | 0.018 | 0.114 |
| 200 | 0.030 | 0.08 | 0.020 | 0.130 |
| 225 | 0.034 | 0.09 | 0.023 | 0.147 |
| 250 | 0.037 | 0.10 | 0.025 | 0.163 |
| 275 | 0.041 | 0.11 | 0.028 | 0.179 |
| 300 | 0.045 | 0.12 | 0.030 | 0.195 |
| 325 | 0.049 | 0.13 | 0.033 | 0.212 |
| 350 | 0.052 | 0.14 | 0.035 | 0.227 |
| 375 | 0.056 | 0.15 | 0.038 | 0.244 |
| 400 | 0.060 | 0.16 | 0.040 | 0.260 |
| 425 | 0.063 | 0.17 | 0.043 | 0.276 |
| 450 | 0.067 | 0.18 | 0.045 | 0.292 |
| 475 | 0.071 | 0.19 | 0.048 | 0.309 |
| 500 | 0.074 | 0.20 | 0.051 | 0.325 |
| 525 | 0.078 | 0.21 | 0.053 | 0.341 |
| 550 | 0.082 | 0.22 | 0.055 | 0.357 |
| 575 | 0.086 | 0.23 | 0.058 | 0.374 |
| 600 | 0.089 | 0.24 | 0.060 | 0.389 |
表1：ラットの筋肉内麻酔投与量。体重100–600 gのラット用筋肉内麻酔混合液の調製に必要なmedetomidine (1 mg/mL)、midazolam (5 mg/mL)、およびfentanyl (0.05 mg/mL)の量。総注入量は、各薬剤量の合計を示す。
3. 膀胱の調製
- 緊張のない膀胱瘻を造設するため、第2乳頭対と第3乳頭対の間（尾側から頭側に向かって数える）の約3分の2の距離において、鈎付き（アドソン）ピンセットで皮膚を固定しながら、11番メスを用いて3 mmの正中縦切開を加える。この切開部位は膀胱頂部の高さに相当する。
- 皮下腹筋と白線を特定する。メスで外膜を切開し、マイクロ鋏を用いて腹筋層を鈍的に剥離した後、鈎付きマイクロピンセットを用いて腹膜を慎重に切開し、腹腔を開く。
- 腹腔内で膀胱を特定するため、切開部の腹筋層を両側から緩やかに挙上して視認性を高め、脂肪組織の下にある膀胱を特定する。膀胱が特定できない場合は、経尿道カテーテル挿入を行い、再度位置を確認する。
4. 経尿道カテーテルの留置
- 尿道カテーテルを用いて膀胱を満たし、膀胱の同定を容易にする。
- 24G末梢静脈カテーテル（スタイレットなし）および尿道口に潤滑ジェルを塗布する。小鋸歯付きピンセットで尿道周囲の皮膚を持ち上げ、非外傷的な挿入を容易にするため、約110°の角度でカテーテルを挿入する。
- 尿道を通り、恥骨の高さまで非外傷的にカテーテルを進める。カテーテルを動物の体に平行になるまで下げ、慎重に膀胱内へ進める。尿道に挿入して約1 cmのところで抵抗がある場合は、カテーテルを完全に引き抜き、挿入をやり直す。カテーテルが少なくとも2 cmスムーズに進む場合は、膀胱への充填に進む。
- 塩化ナトリウムを膀胱内にゆっくりと注入し、抵抗なく注入できることでカテーテルの配置が成功したことを確認する。カテーテルの配置に失敗した場合、シリンジが詰まり、カテーテルをわずかに引き抜くと尿道から塩化ナトリウムが漏れ出す。
5. 膀胱の配置
- あらかじめ加温した0.9% NaClを最大400 µLまで膀胱に充填する。注入圧が上昇することなく、スムーズに充填されることを確認する。膀胱への充填状況を目視でモニターし、膀胱が腹腔内の中央に位置していることを確認する。なお、生理的な膀胱容量は動物の週齢、体重、系統によって異なり、変動し得ることに留意すること。体重200–230 gの12週齢Lewisラット（LEW/Crl）の場合、最大生理的膀胱容量は約500 µLである。経尿道カテーテルは留置したままにし、必要に応じて膀胱を再充填する。
- 膀胱を観察し、膀胱壁腹側の膀胱頂部下方にある、予定の膀胱造口術部位を特定する。
- 予定切開部位の両側（3時と9時の方向）に、6-0コーティング済みVicrylを用いて2本の表在性牽引縫合を行う。膀胱の位置を維持するため、縫合糸の端をクランプで固定する。
6. 膀胱腟造設術
- フック付きマイクロ鉗子で膀胱頂部を慎重に把持し、11番メスを用いて3 mmの縦切開を加える。尿がすぐに排出されるよう、切開が膀胱壁の全層に及んでいることを確認する。
- 切開部位を確認し、必要に応じてマイクロ剪刀で約3 mmまで拡大する。
- 固定縫合糸を用いて、縫合しやすいように膀胱の位置を調整する。経尿道カテーテルを抜去する。
- 6-0 コーティング済みVicrylを用い、12時方向から縫合を開始する。縫合糸を膀胱壁の内腔側から皮膚へと通し、その際、筋層は含めないようにする。続いて6時、8時、10時、2時、4時の方向に縫合を行い、膀胱の開口部が皮膚に完全に密着するまで進める。膀胱が確実に固定されたら、固定縫合糸を抜去する。
- 膀胱粘膜が隙間なく腹壁の皮膚に完全に接合し、3–5 mmの膀胱瘻開口部にキャリブレーションスティックを容易に挿入できれば、膀胱瘻造設完了とする。
- 動物が手術部位を舐めたり噛んだりすることを防ぐため、ストマ縁から約4–5 mm離れた位置にステンレス鋼ワイヤーで4箇所縫合する。20G針を用いて各ワイヤーを皮膚に通し、シンプルなオーバーハンドノットを2回結んで固定し、ワイヤーの端を約2 mmの長さに切り揃える。
7. キャリブレーションと創傷被覆
- 周囲の皮膚をきれいな水で洗浄した後、0.2% 次亜塩素酸ナトリウム溶液などの粘膜適合性のある消毒薬で10分間浸漬させる。
- 滅菌済みの約 6–11 Charrière（1 Charrière = 直径約 0.33 mm）のキャリブレーションスティックを膀胱瘻に挿入し、ストマの径を評価する。
- 創縁の内反を起こさずにストマ腔を充填し、スムーズに通過するキャリブレーションスティックを使用する。
- 剃毛した腹壁の皮膚、膀胱瘻周囲の組織、およびストマ開口部に、皮膚用組織接着剤を十分に塗布する。
- 膀胱瘻の閉塞を防ぐため、接着剤が乾燥するまで（約 10 s）、キャリブレーションスティックを膀胱瘻内で絶えず回転させる。この操作は、できれば補助者の協力を得て行う。術直後および治癒後の膀胱瘻の代表的な画像を図 1に示す。
図1. 手術直後および治癒後の膀胱口造設術の代表的な外観。手術直後の膀胱口造設部位および創傷被覆材（DPI 0：左）と、56日間（2か月）の追跡期間終了直前の治癒後（DPI 53：右）の代表的な画像。挿入図は、手術直後の膀胱口造設部位の高倍率像である。スケールバー = 1 cm（全景画像）および 2 mm（挿入図）。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
8. アンタゴニズム
- 表 2に従い、27G針を装着した1 mLシリンジを用いて、アチパメゾール (0.76 mg/kg) とフルマゼニル (0.2 mg/kg) の混合液を皮下投与し、全身麻酔を拮抗させる（麻酔剤投与から1時間以上経過した後に実施すること）。
- ストレスのない回復を促すため、拮抗薬混合液を投与する前に動物をホームケージに入れる。完全に意識が回復するまで、動物を継続的に観察する。ホームケージを別の回復室の保温ランプ下に3時間置いておく。
| 体重 (g) | Atipamezole (5 mg/mL), mL | Flumazenil (0.1 mg/mL), mL | 合計量 (mL) |
| 100 | 0.015 | 0.20 | 0.215 |
| 125 | 0.019 | 0.25 | 0.269 |
| 150 | 0.023 | 0.30 | 0.323 |
| 175 | 0.026 | 0.35 | 0.376 |
| 200 | 0.030 | 0.40 | 0.430 |
| 225 | 0.034 | 0.45 | 0.484 |
| 250 | 0.037 | 0.50 | 0.537 |
| 275 | 0.041 | 0.55 | 0.591 |
| 300 | 0.045 | 0.60 | 0.645 |
| 325 | 0.049 | 0.65 | 0.699 |
| 350 | 0.052 | 0.70 | 0.752 |
| 375 | 0.056 | 0.75 | 0.806 |
| 400 | 0.060 | 0.80 | 0.860 |
| 425 | 0.063 | 0.85 | 0.913 |
| 450 | 0.067 | 0.90 | 0.967 |
| 475 | 0.071 | 0.95 | 1.021 |
| 500 | 0.074 | 1.00 | 1.074 |
| 525 | 0.078 | 1.05 | 1.128 |
| 550 | 0.082 | 1.10 | 1.182 |
| 575 | 0.086 | 1.15 | 1.236 |
| 600 | 0.089 | 1.20 | 1.289 |
表2：ラットにおける皮下麻酔拮抗剤の投与量体重100–600 gのラット用皮下麻酔拮抗剤混合液を調製するために必要なatipamezole (5 mg/mL)およびflumazenil (0.1 mg/mL)の量。総注入量は、各薬剤量の合計を示します。
9. 廃棄物処理
- 鋭利物（シリンジ針やステンレス鋼線の残骸など）は、承認済みの鋭利物廃棄容器に廃棄してください。すべての生物学的廃棄物および手術廃棄物は、施設のバイオセーフティ規定に従って廃棄してください。
10. 術後管理
- 術後ケア
- 術後5日間は、エンロフロキサシン（1.5 mg、1日1回、皮下投与）および長時間作用型メロキシカム（0.2 mg、1日2回、皮下投与）を投与する。体液喪失を補うため、必要に応じて加温した0.9% NaClを皮下投与する。
- フォローアップ期間中、低用量のエンロフロキサシン（0.5 mg、1日1回、皮下投与）を継続的に投与する。
- 日々の検診で痛みや感染の兆候が観察された場合は、抗菌薬および/または鎮痛薬による治療を再開または強化する。その際は、術後最初の5日間に使用した抗菌薬および鎮痛薬と同じ用量を投与する。
- 尿の特性に変化が見られた場合（例：血尿または尿混濁が3日間持続）および/または膀胱瘻周囲の皮膚の状態が変化した場合（例：皮膚の赤みが改善せず2日間持続）、標準用量の抗菌薬を5日間投与する。血尿の期間中および/または皮膚プラークの形成が始まった際は鎮痛薬による治療を再開し、症状が消失するまで治療を継続する。
- 毎日、膀胱瘻の拡張（キャリブレーション）を行う。前回記録されたストマ径よりも少なくとも1サイズ小さい拡張スティックから開始し、挿入前に潤滑ジェルを塗布する。拡張スティックがスムーズに通過した場合は、次の大きいサイズで手順を繰り返し、スムーズに通過した最大サイズを記録する。
- 術後3週間以降であり、かつ拡張サイズが少なくとも3日間連続して安定している場合に限り、拡張の頻度を2日に1回に減らす。
- 皮膚接着剤が剥がれ始めたら（通常は術後3〜5日）、0.04% 次亜塩素酸ナトリウム溶液などの粘膜適合性のある消毒剤で周囲の皮膚を毎日洗浄し、続いて油性保湿保護フィルムを塗布する。創傷スコアリングシステムおよびFigure 2A,Bに示す代表的な創傷外観に基づいて、創傷治癒状態を評価する。
- 術後7日目にステンレス鋼ワイヤーを除去する。
- 術後モニタリング
- 術後期間を通じて、すべての動物を綿密にモニタリングする。
- Rat Grimace Scale27に基づいた痛みや不快感の兆候、異常な腫れ、出血、手術部位におけるその他の変化、および過剰なポルフィリン排出について、各動物を1日少なくとも2回検査する。Figure 2A,Bに示す創傷スコアリングシステムを用いて膀胱瘻を評価し、Figure 2Cに示す通りに拡張サイズを記録する。
- 各動物の詳細な記録を維持し、以下のパラメータを定期的に記録する：
- 体重（術前値との相対値）
- 全身状態（被毛、眼、ひげ、耳、および呼吸）
- 歩行動作（例：硬い歩き方や不安定な歩行）
- 尿の特性（例：変色や強い臭気）
- 膀胱瘻の拡張サイズ
- 膀胱瘻周囲の皮膚の状態
図 2. フォローアップ期間中の術後創傷治癒および膀胱造設術キャリブレーション。(A) 7週間のフォローアップ期間中における膀胱造設部位の創傷スコア。(B) 創傷スコア1～4の代表的な画像。正常な創傷外観から潰瘍形成への進行を示している。あらかじめ定義された研究基準に従い、皮膚に開放性病変がある動物は除外した。スケールバー = 5 mm。(C) フォローアップ期間中にCharrièreで測定した膀胱造設術のキャリブレーションサイズ。パネルAおよびCのデータは平均値 ± 標準偏差 (SD) として提示している。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
結果
計18匹のラットに膀胱尿路造設術を施行した。本手法を確立するため、まずSCIを伴わない6匹の動物に処置を行い、基本的な安全性と実現可能性を検証し、健康な動物における術後管理を評価した。続いて、12匹の動物に対し、T8/T9椎体レベルでの胸部挫傷SCIと併せて膀胱尿路造設術を施行した。このうち6匹を、SCI動物のための術後創傷管理プロトコルのさらなる改良に使用した。得られたレジメンを、概念実証として第2コホートの6匹の動物に適用した。全身状態を、胸部挫傷SCIのみを受けた動物と比較した（表3）。
| 群 | 個体数 (n) | 膀胱造設術 | SCI | 損傷の種類 | 損傷部位 | 最大BBBスコア、平均値（標準偏差） | 追跡期間 |
| 膀胱口形成術 | 6 | はい | いいえ | — | — | 21.0 (0.0) | 1～2ヶ月 |
| 脊髄損傷 | 8 | いいえ | はい | 250 kDyn 挫傷 | T8/T9 | 8.19 (2.84) | 2か月 |
| 膀胱口形成術 ＋ 脊髄損傷（創傷管理の改善） | 6 | はい | はい | 250 kDyn 挫傷 | T8/T9 | 10.33 (3.05) | 1～2か月 |
| 膀胱瘻造設術 ＋ 脊髄損傷 | 6 | はい | はい | 250 kDyn 挫傷 | T8/T9 | 10.67 (0.75) | 2ヶ月 |
表3：実験群。動物数、膀胱尿路分路（vesicostomy）の有無、脊髄損傷（SCI）、損傷特性、最大Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) 運動機能スコア、および追跡期間を含む、本研究に含まれる実験群の概要。BBBスコアは平均値（標準偏差, SD）で表記している。
膀胱瘻造設術は技術的に簡便であり、術中の合併症、出血、または周囲臓器への損傷は認められませんでした（図1）。最初の一連の実験において、脊髄損傷（SCI）後の可動域制限と持続的な尿への曝露が組み合わさったことで皮膚刺激が生じたため、創傷ケア専門医との協議に基づき、術後の創傷管理プロトコルを修正する必要がありました。上述の修正後の術後創傷管理プロトコルを導入した後、より重度の皮膚悪化は見られませんでした。膀胱瘻の開通性を維持するための定期的なキャリブレーションを行い、概念実証コホートの全6頭の動物が2か月のフォローアップ期間を完了し、処置の成功率は100%となりました。緩やかな腹部圧迫後に膀胱瘻から尿が流出することによって示される膀胱の貯留機能は、研究期間中の評価の91.84%で観察されました。
術後の創傷治癒を評価するために、4段階の創傷スコアリングシステムを用いて膀胱口造設術部位を定期的に評価した(図 2A)。スコア1は正常皮膚、スコア2は皮膚の赤み、スコア3は炎症の徴候、スコア4は潰瘍形成を示した(図 2B)。皮膚に開放性病変が認められた動物は、研究から除外することとしていた。術後最初の2週間は、平均創傷スコアが1.88 (SD 0.32) と創傷状態の初期悪化が見られたが、その後は安定し、2ヶ月の追跡期間を通じて平均スコアは2.00から2.33の範囲であった(図 2A)。除外が必要となった動物はいなかった。創傷スコアの悪化、体重減少、または急性尿路感染症を示す可能性のある尿臭の顕著な変化が認められた計10例において、低用量のエンロフロキサシン投与量を0.5 mgから1 mg (1日1回、皮下投与) へ2〜5日間一時的に増量した。いずれの動物においても、エンロフロキサシンを別の抗菌薬に代替する必要はなかった。
手術当日の平均膀胱瘻径10.33 Charrière (SD 0.94) から始まり、拡張管のサイズは最初の3週間で急速に減少し、平均6.70 Charrière (SD 1.09) となりました。その後、減少速度は緩やかになり、2か月のフォローアップ期間終了時の平均拡張サイズは5.33 Charrière (SD 0.94) でした (Figure 2C)。また、自然に瘻孔が狭窄する傾向が認められました。7例において、一時的に閉鎖した膀胱瘻を、直近に記録された径よりも少なくとも2サイズ小さい拡張棒から始めて徐々にサイズを上げることで、慎重に再開通させました。これらの事例のうち5例は、術後7日以内に発生しました。
初期治癒段階の後、痛みや不快感の兆候は見られませんでした。動物には、膀胱尿路造設術に起因する行動制限はほとんど認められませんでした。体重を含む全身状態は、膀胱尿路造設術を施行した動物とSCIのみを受けた動物の間で同等でした（図3）。
図3. 脊髄損傷後の体重変化。 手動での膀胱圧迫による管理（SCI）または膀胱造口術（Vesicostomy + SCI）を施行した脊髄損傷（SCI）ラットにおける、7週間の追跡期間中の術前値に対する体重の変化率。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で示されている。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
ディスカッション
本プロトコルでは、脊髄損傷（SCI）後の持続的な低圧尿路ドレナージの手法として、げっ歯類における膀胱ろう術の詳細な記述を初めて提供します。手術手技の解説に加え、長期にわたる成功的なフォローアップを実現するために極めて重要であることが証明された、包括的な術後の創傷管理プロトコルを提供します。ラットは小型動物モデルであり、また、混乱要因を制限し創傷治癒を促進するために膀胱の開口部を最小限に抑えることが目的であるため、拡大鏡（2.5–3.5× （倍率）または手術用顕微鏡の使用が非常に有用であった。膀胱造設孔のサイズを直接比較（3 mm 対 5 mm）したところ、我々の手技においては切開口が小さい方が優れていることが裏付けられた。この低侵襲的なアプローチが技術的に困難な場合は、腹壁切開のサイズを大きくすることでアクセスが容易になる可能性がある。ただし、膀胱を縫合する前に、最適な膀胱造設孔の寸法にするため、腹壁切開を再び3 mmまで縮小させる必要がある。さらに、本アプローチは膀胱造設孔を高位に作成するように設計されており、これにより部分的な膀胱リザーバー機能（追跡期間を通じて91.84%の症例で観察）と、尿管が関与した状態での制御可能な程度の膀胱拡張が可能となった。手術手技自体は技術的に簡便であり、術中合併症のリスクは低いが、その後の集中的な創傷ケア、特に術後初期段階におけるケアが、本手法の主な欠点となる可能性がある。持続的な尿排泄を維持するためには、膀胱造設孔の自然閉鎖を防ぐことが不可欠であり、定期的なカリブレーションが必要である。この処置を安全かつ再現性高く行うには2人の術者を必要とするため、特に術後最初の3週間は少なくとも毎日、その後は1日おきにカリブレーションを行う必要があり、人員への負担が大きくなる。
同様に重要なのが、厳格な創傷管理および皮膚保護レジメンです。膀胱腟造設術は本質的に病原体の侵入経路となり得ると同時に、周囲の皮膚が常に尿にさらされるため、当該部位は浸軟や感染を起こしやすくなります。創傷ケアの専門家と連携し、ここに記載する術前および術後の創傷管理プロトコルを体系的に開発し、改良しました。重要な要素としては、広範囲の除毛による清潔な術野の確保、初期治癒段階における新鮮な創縁を密閉するための皮膚用接着剤の塗布、およびその後の希釈した低刺激性石鹸溶液と粘膜適合性消毒剤による定期的な洗浄が挙げられます。皮膚の保湿は、皮膚の再生と被毛の再成長を促進し、創傷回復の特に重要な決定要因となることが明らかになりました。油性保湿保護フィルムを毎日たっぷりと塗布することが、皮膚の保湿を維持し、尿の直接接触に対するバリアを形成する上で非常に有効であることが証明されました。被毛の再成長が確認された後は、一般的に皮膚の完全性が回復し、創傷ケア措置の強度を軽減することができました。
脊髄損傷（SCI）後の患者における標準的な膀胱管理戦略はカテーテル留置であるが9,10,11,12、主にラットを用いて行われる前臨床動物研究14,15において、この点に関する手法は大幅に制限されている。一般的に行われている手動による膀胱圧出は、非生理的な膀胱内圧と過度な組織負荷を発生させるため、下部尿路（LUT）を調査する研究に方法論的なバイアスをもたらす。加えて、この手法が主に雌の動物に限定されるという実用上の制約は、ラットを用いた前臨床SCI研究において重要な制限となる。経尿道カテーテル留置は雌のラットでは可能だが、通常は鎮静（例：イソフルラン）が必要であり、これが大きな制約となっている。さらに、ラットは約8～10分ごとに排尿するため27、膀胱の過伸展を防ぐには1日に何度もカテーテル留置を行う必要があり、日常的な排尿戦略としての実用性はさらに低下する。膀胱造設術は、SCI後の覚醒ラットにおいて、持続的かつ低圧の尿排泄を可能にする実現可能なアプローチであり16、繰り返しの手動膀胱圧出に伴う混絡効果を軽減できる可能性がある。しかし、その臨床への翻訳的妥当性については、慎重な検討が必要である。間欠的カテーテル留置、留置カテーテル、または反射性排尿などの臨床的な膀胱管理戦略とは異なり、膀胱造設術は生理的な充満および排尿サイクルを伴わない持続的な尿路転流状態を形成する。そのため、一般的な臨床条件を直接再現するものではなく、むしろ持続的に減圧された膀胱の状態をモデル化するものである。
本研究では、膀胱頂部に高位ストーマとして意図的に膀胱口形成術を施行し、部分的な貯留機能、制御された程度の膀胱伸展、および尿管の関与を可能にした。この構成により、完全な膀胱虚脱を避けつつ低い流出路抵抗を維持し、これにより、流出路閉塞または神経因性膀胱を持つ小児において上部尿路を保護するために臨床的に用いられる、持続的な低圧ドレナージの概念に限りなく近づけている28。通常の貯留および禁制メカニズムは消失したままであるが、高位膀胱口形成術の構成は、単純な恥骨上腹腔内への排尿や繰り返しの手動膀胱圧出よりも、極端な膀胱壁ストレスを軽減し、より生理的に分布した膀胱への充満および尿管流入を促進する可能性がある。皮膚膀胱口形成術のマウスモデルを用いた最近の研究では、一時的な尿路転換条件下で通常の貯留・排尿サイクルが乱されると、固有層の厚さの著しい増加、排尿筋平滑筋比率の低下、収縮反応の減退、Mrgprb2の上方制御、およびSubstance Pに対する感受性の増強を含む、顕著な膀胱リモデリングが誘導されることが示された。これらの知見は、持続的な低圧ドレナージ自体が、標準的な臨床的膀胱管理の単純な近似ではなく、独立した病態生理学的状態を表しているという概念を支持している26。これらの知見に基づき、脊髄損傷（SCI）後のラットにおける膀胱口形成術は、間欠的カテーテル留置や反射性排尿の直接的な代用ではなく、主に持続的な膀胱減圧および膀胱サイクルの断絶のモデルとして見なされるべきである。
この特徴は、流出路抵抗を最小限に抑えた条件下で、除神経に対する膀胱固有の反応を研究する際に有用であると考えられます。同時に、尿道を完全にバイパスすることで、尿道抵抗、外尿道括約筋の活動、およびDSD（排尿筋-外尿道括約筋協調不全）を含む、下部尿路機能不全の臨床的に重要な要素が排除されます。その結果、本モデルは流出路閉塞や膀胱-括約筋相互作用に焦点を当てた調査にはあまり適していません。
さらに、持続的な尿路ドレナージは、正常な蓄尿および保持メカニズムを効果的に消失させますが、これは膀胱の生理機能、コンプライアンス、および組織リモデリングに独立して影響を及ぼす可能性があります。マウス膀胱孔造設モデル26の知見では、正常な蓄尿・排尿サイクルの破壊により、ムスカリン受容体の発現量は不変であるにもかかわらずコリン作動性感受性が低下することが示唆されており、これは下流のシグナル伝達経路に変化があることを示しています。このモデルで得られた知見のトランスレーショナルな適用可能性を解釈する際には、これらの要因を考慮する必要があります。また、膀胱孔造設は、同一動物内で脊髄損傷（SCI）後の膀胱管理の異なる段階をモデル化できるという概念的な可能性を提供します。受傷後の急性期において、高位膀胱孔造設による持続的な低圧ドレナージは、高い膀胱内圧と尿停滞を回避して膀胱および上部尿路（UUT）を保護することを目的とした、留置尿道カテーテルや恥骨上カテーテル、その他の尿路転流術などの臨床戦略を模倣できる可能性があります。その後の慢性期において、膀胱孔を外科的に閉鎖することで、高圧蓄尿および排尿状態への移行が可能となり、膀胱への充満、不完全な排尿、および蓄尿圧の上昇が長期的なリモデリングと機能不全に寄与する、クリーン間欠的カテーテル法で管理されている患者の状態をより密接に再現できると考えられます。
このような段階的なアプローチは、同一のSCIモデルにおいて、持続的な減圧下と貯尿機能回復後の条件下での膀胱の構造的、機能的、および分子的な適応を比較する縦断的研究を促進する可能性があります。これにより、nLUTDにおける損傷に関連する要素と排尿に関連する要素を切り分け、前臨床の実験的パラダイムと臨床現場における膀胱管理の時間的経過との間の乖離を埋めるのに役立つと考えられます。現時点では、この概念は仮説にとどまっており、膀胱孔閉鎖後の実現可能性、安全性、再現性、および結果として得られる尿路動態プロファイルを確立するために、今後の専用の研究が必要です。最後に、膀胱孔形成術は、尿道カテーテル挿入に伴う困難を回避できるため、理論的には雌雄両方の膀胱管理を容易にする可能性がありますが、本研究は雌のラットのみを用いて実施されました。上述のマウス研究を含む既存のげっ歯類における膀胱孔形成モデルも、同様に主に雌の動物で確立されており、性別に関わらず適用可能であることを支持する十分な根拠は依然として限られていることが強調されます。したがって、現在のデータは雌のラットにおける実現可能性のみを示すものであり、雄においても同様の結果が得られるか、また潜在的な性差があるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。
SCI（脊髄損傷）モデルラットにおける膀胱ろう造設術は、持続的な低圧尿路ドレナージを行うための簡便で再現性の高い手法であり、特に部分的な貯留機能を維持できる高位膀胱ろうとして実施した場合に有効です。このモデルは、間欠的カテーテル留置を再現せず、尿道抵抗や括約筋のダイナミクスをバイパスしますが、流出路抵抗を最小限に抑えた条件下で、除神経および貯留・排尿サイクルの破綻に対する膀胱固有の反応を調査するための制御された環境を提供します。したがって、そのトランスレーショナルな応用は、主に膀胱のリモデリング、減圧、および全般的な膀胱維持の研究に限定されており、現在のデータは雌の動物に限定されています。今後の研究では、このモデルを雄に拡張し、高圧貯留条件を再確立するために膀胱ろうの段階的閉鎖を評価することで、慢性的臨床膀胱管理をより適切に反映させるべきです。
開示事項
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、創傷管理プロトコルの最適化に不可欠な貢献をいただいた創傷ケア専門家のGerlinde Wiesinger氏に感謝いたします。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9% 塩化ナトリウム溶液 | Fresenius Kabi、オーストリア、グラーツ | — | 滅菌生理食塩水 |
| 20G皮下注射針 | Servoprax, ウェーゼル, ドイツ | 参照 L1 0201 | ステンレス鋼線の留置に使用 |
| 24G末梢静脈カテーテル | B. Braun、ゼンパッハ、スイス | 参照番号 4254074B | 経尿道カテーテル（スタイレットなし）として使用 |
| 27G皮下注射針 | B. Braun, メルズンゲン, ドイツ | 参照 4657705 | 注入に使用 |
| 6-0 コーティング済み Vicryl 縫合糸 | Ethicon、プエルトリコ、米国 | 参照 V134H | 膀胱の固定に使用 |
| Actimaris Wound Irrigation Solution forte 創傷洗浄液 | ActiMaris、アッペンツェル、スイス | 参照 30350 | 0.2%次亜塩素酸ナトリウム溶液 |
| Actimaris Wound Irrigation Solution sensitive（低刺激性創傷洗浄液） | ActiMaris, アッペンツェル, スイス | 参照 30300 | 0.04%次亜塩素酸ナトリウム溶液 |
| アチパメゾール (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Pharma、フィンランド、エスポー | カタログ番号なし | 麻酔薬拮抗薬 |
| 膀胱キャリブレーションスティック (6–11 チャリè再) | 製造元情報なし | カタログ番号は利用不可 | 膀胱口形成術のキャリブレーションに使用 |
| 炭素鋼メス刃 11番 | Aesculap, ドイツ連邦共和国トゥットリンゲン | 参照 BB511 | メス刃 |
| デクスパンテノール眼軟膏 (2%) | Fresenius Kabi、オーストリア、グラーツ | 参照 RA4302436 | 眼軟膏 |
| エンロフロキサシン（Baytril 25 mg/mL） | Elanco、ドイツ、モンハイム | カタログ番号なし | 抗生物質 |
| 雌のLewisラット（12週齢） | Charles River Laboratories、ドイツ、ズルツフェルト | — | 実験動物 |
| フェンタニル（50 µg/mL) | hameln pharma, ドイツ、ハーメルン | カタログ番号はありません | 麻酔薬 |
| フルマゼニル (0.1 mg/mL) | Fresenius Kabi、グラーツ、オーストリア | カタログ番号なし | 麻酔薬拮抗薬 |
| 加熱パッド | Lenric、リトルハンプトン、英国 | カタログ番号はありません | 体温を維持するために使用される |
| 有鉤（アドソン）鉗子 | Fine Science Tools, ドイツ、ハイデルベルク | 11019-12 | 組織の取り扱い |
| 曲針マイクロ鉗子 | Medicon, ドイツ、トゥットリンゲン | 13.71.62 | 顕微鏡下手術用鉗子 |
| 持続性メロキシカム（Metacam 5 mg/mL） | Boehringer Ingelheim、ドイツ、インゲルハイム・アム・ライン | カタログ番号はありません | 鎮痛剤 |
| 潤滑剤ゲル（Cathejell C） | Montavit, Absam, オーストリア | カタログ番号なし | 経尿道カテーテル挿入および膀胱瘻の拡張に使用 |
| メデトミジン (Sedator 1 mg/mL) | Dechra、ドイツ、アウレンドルフ | カタログ番号はありません | 麻酔薬 |
| 顕微鏡または手術用拡大鏡（2.5–3.5×) | Evident Europe GmbH、オーストリア、ウィーン | Olympus SZ61 | 顕微鏡下手術で使用される |
| マイクロ鋏（ボン鋏） | Fine Science Tools、ドイツ、ハイデルベルク | 14084-08 | マイクロサージャリー用鋏 |
| 蚊の止血メカニズム | Fine Science Tools, ドイツ、ハイデルベルク | 13009-12 | ステイスチャーの固定に使用される |
| 油性保湿保護膜 | パニン、ロヴィーゴ、イタリア | カタログ番号なし | 術後の皮膚保護 |
| ポビドンヨード溶液 (7.5%) | B. Braun、ドイツ、メルスングン | カタログ番号なし | 皮膚消毒剤 |
| 3番メスハンドル | Fine Science Tools, ドイツ、ハイデルベルク | 10003-12 | 11番メス刃に対応 |
| 小型鋸歯付きピンセット | Fine Science Tools, ドイツ、ハイデルベルク | 11050-10 | 尿道周囲皮膚の操作に使用 |
| ステンレス鋼線 | Vömel, ドイツ、クロンベルク | カタログ番号なし | 保護用ワイヤー縫合に使用 |
| シリンジ、1 mL | Becton Dickinson、オーストリア、ウィーン | 参照 303172 | 麻酔薬および拮抗薬の投与に使用 |
| 局所皮膚用接着剤 | Ethicon, プエルトリコ, 米国 | 参照 AHVM12 | 皮膚用接着剤 |
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