本プロトコルでは、N-lactoyl-phenylalanineが糖尿病性心筋症、心臓の脂質代謝、およびコレステロール合成に及ぼす影響を、adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase経路に焦点を当てて調査するための、in vivoおよびin vitroのアプローチについて説明します。
この記事について
サマリー
要約
糖尿病性心筋症（DCM）は、糖尿病における最も深刻な合併症の一つです。内因性代謝物であるN-ラクトイル-フェニルアラニン（Lac-Phe）は、体重減少を促進し、グルコース恒常性を改善することができます。本研究では、DCMに対するLac-Pheの治療効果を調査し、さらにその潜在的なメカニズムを探索することを目的としました。DCMを伴う2型糖尿病マウスにLac-Pheを投与したところ、Lac-Pheは心収縮機能を亢進させ、病理学的リマデリングを改善し、心臓における脂質蓄積を減少させました。in vitroでは、高グルコースおよびパルミチン酸で刺激したH9c2細胞を用いてLac-Pheの効果を検討しました。Lac-Pheは、H9c2細胞におけるコレステロール合成を減少させることで、脂質蓄積を抑制しました。メカニズムとしては、Lac-Pheはアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼα1（AMPKα1）のリン酸化および活性化を促進しました。続いて、活性化されたAMPKα1がその下流ターゲットである3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA還元酵素（HMGCR）をリン酸化して抑制し、その結果、コレステロール合成が減少し、最終的にH9c2細胞における脂質代謝不均衡が改善されました。これらの知見は、Lac-PheがAMPKα1/HMGCR経路を介してDCMにおけるH9c2細胞の脂質代謝を改善し、それによって心収縮機能を亢進させ、病理学的リマデリングを改善することを示しています。Lac-Pheは、糖尿病性心筋症に対する潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。
概要
糖尿病は、持続的な高血糖を特徴とする代謝性疾患である1。過去20年間で、糖尿病は世界における死因の上位10位の一つとなっており、毎年600万人以上の人々が糖尿病およびその合併症により亡くなっている2。糖尿病に伴う心臓の病理的状態である糖尿病性心筋症（DCM）は、糖尿病に関連する最も深刻な合併症の一つである3,4。DCMは心不全の独立したリスク因子として機能し、心線維化や心筋細胞肥大などの心筋の構造的および機能的変化を特徴としており5,6、最終的に拡張不全と収縮不全の両方を引き起こす。β遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬、アンジオテンシンII型1受容体拮抗薬などのいくつかの従来の心血管治療法が現在DCMの管理に用いられているが7,8、臨床現場におけるその有効性は依然として不十分である。DCMの根底にあるメカニズムが十分に研究されていないため9、現時点ではこの疾患を標的とした明確な治療戦略は存在しない10,11。DCMの臨床症状は、初期段階の無症候性拡張不全から、後期段階の収縮不全および臨床的心不全、さらには死に至るまで進行する12,13。したがって、本疾患に対する効果的な治療オプションを探索し、開発することが急務となっている。
脂質代謝の不均衡は、DCMの主要な特徴である14。DCMでは、血中の遊離脂肪酸（FFA）レベルの上昇が、心筋細胞による脂肪酸の過剰な取り込みを招く可能性がある15,16。心筋細胞における脂肪酸代謝は、主に脂肪酸酸化に依存している。時間の経過とともに、心筋細胞における脂肪酸酸化では取り込まれたすべての脂肪酸を完全に代謝させることが不十分となり、過剰な脂肪酸およびその中間代謝物が心筋細胞内に蓄積する17。この過剰な脂質負荷はリポ毒性を誘発し、心筋のエネルギー供給を乱し、心臓の酸化ストレスおよび炎症反応を促進し、最終的に心筋細胞に深刻な損傷を与える18,19。したがって、心臓の脂質代謝を能動的に調節することは、DCMの潜在的な治療標的となる可能性がある20。
N-ラクトイルフェニルアラニン（Lac-Phe）は、運動後に濃度が急速に上昇する内因性代謝物である21。メカニズムとしては、Lac-Pheは細胞質酵素であるカルノシンジペプチダーゼ2（CNDP2）によって、乳酸とフェニルアラニンの縮合を通じて合成される。この生合成経路は、マクロファージ、上皮細胞、間葉系幹細胞を含む多様な細胞型に広く分布しており、これらの細胞は身体活動に続いてLac-Pheを血中に分泌する22。Lac-Pheの慢性的な投与は、食事摂取量の効果的な抑制、肥満および体重の減少、そしてグルコース恒常性の改善をもたらすことが示されている21。最近の研究では、Lac-Pheが脊髄損傷後のミクログリア/マクロファージの脂質代謝能を改善できることが示された23。興味深いことに、2型糖尿病の第一選択薬であるメトホルミンの急性および慢性投与の両方がLac-Pheレベルを上昇させ、Lac-Pheがメトホルミンの抗肥満効果を媒介することが研究で示唆されている22。さらに、Shaらは最近、Lac-Pheがミトコンドリア機能不全を軽減することで心筋細胞死を改善し、それによって横行大動脈狭窄（TAC）誘発性心不全を改善することを実証した24。長期にわたる高血糖と肥満は、拡張型心筋症（DCM）における脂質代謝調節不全に寄与する重要な要因である25。以上の証拠を総合すると、Lac-PheはDCMに対して潜在的な治療効果を持つ可能性が示唆される。しかし、現在まで、DCMにおけるLac-Pheの具体的な役割については調査されていない。
本研究において、糖尿病性心筋症（DCM）罹患マウスへのLac-Pheの外因性投与が、心収縮機能を効果的に改善し、心臓の病理学的リモデリングを軽減することを見出しました。また、Lac-Pheが脂質代謝不全の調節を通じて、DCMマウスの心機能を改善することを明らかにしました。Lac-Pheは、DCMマウスの心筋細胞における脂質滴（LD）の蓄積を抑制し、心臓内のコレステロール含量を減少させました。メカニズムとしては、Lac-Pheがアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼα1（AMPKα1）のリン酸化および活性化を促進し、それによって3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA還元酵素（HMGCR）のリン酸化を促進することが分かりました。HMGCRのリン酸化はその活性を低下させ、結果としてコレステロール産生を減少させ、心筋細胞における脂質代謝不全を改善します。これらの結果は、Lac-Pheを用いたDCMの潜在的な治療法に対する理論的根拠を提供するものです。
プロトコル
動物実験プロトコルは、南京鼓楼医院の施設倫理委員会の承認を得て（承認番号：2025AE1065、2025年9月26日）、以下のガイドラインに従って実施された。 実験動物の飼養および使用に関する指針 （第8版）、米国国立衛生研究所発行。
動物
本研究では、5週齢の雄性C57BL/6Jマウス30匹を使用した。1週間の順化飼育後、すべてのマウスを温度22°C ± 2°C、湿度40%–60%の条件下で、12時間の明暗サイクルにて、食物と水に自由にアクセスできる状態で飼育した。DCMマウスモデルの作製には、HFDと低用量STZを組み合わせて使用した（図 1A）。高脂肪食（HFD; 脂肪 60%、タンパク質 20%、炭水化物 20%）の給餌開始から4週間後、マウスを一晩絶食させ、その後、ストレプトゾトシン（STZ; クエン酸緩衝液 pH 4.5に溶解し 8 mg/mLとしたもの）を 35 mg/kg/day の用量で3日間連続して腹腔内投与した。対照群のマウスには対照食（脂肪 10%、タンパク質 20%、炭水化物 70%）を給餌し、同量のクエン酸緩衝液を投与した。さらに15週間の高脂肪食維持後、ランダム血糖値 ≥13.3 mmol/L および左室駆出率（LVEF） <55% の両方の基準を満たしたマウスを、DCMモデルの作製に成功したと定義した。これらの検証済みDCMマウスに番号を振り、乱数表を用いてDCM群とDCM + Lac-Phe群にランダムに割り当てた。約半数のマウスでモデルの作製に失敗し、これらの動物は動物倫理規定に従って安楽死させた。簡潔に述べると、マウスをControl群、DCM群、DCM + Lac-Phe群の3群に分けた（各群 n = 10）。各群の10匹すべてのマウスに対して、心エコー検査、体重測定、およびOGTTを行った。28日間の治療期間後、後続の解析のために心臓を採取した。各群に10匹のマウスがいた。このうち、各群3匹をトランスクリプトームシーケンシングに、3匹を透過電子顕微鏡観察および組織学的染色に、3匹をタンパク質発現解析に使用した。各群の残りの1匹はバックアップとして確保した。DCMモデルの作製成功後、Lac-Pheを生理食塩水に溶解し、最終濃度を 10 mg/mL とした。DCM + Lac-Phe群のマウスには、Lac-Pheを 50 mg/kg/day、投与量 5 mL/kg で、1日1回、28日間連続して腹腔内投与した。Control群およびDCM群のマウスには、溶媒対照として同量の生理食塩水を投与した。
図1Lac-Pheは、糖尿病性心筋症モデルマウスにおいて心機能および病理学的リモデリングを改善する。 (A) HFD/STZ誘発DCMマウスモデルおよびLac-Phe投与プロトコルの概略図。(B) 4週間の投与期間中における対照群、DCM群、およびDCM + Lac-Phe群のマウス体重；各群 n = 10。(C) 指示された各群における経口糖負荷試験（OGTT）；各群 n = 10。(D) 投与0、2、および4週目における代表的な心エコー画像。(E,F) 左室駆出率（LVEF）(E) および短縮率（FS）(F) の定量化；各群 n = 10。(G) 代表的なヘマトキシリン・エオシン（H&(E)心臓切片の染色像。スケールバー = 1 mm。(H, I)心臓切片の代表的なマッソン・トリクローム染色像 (H) および線維化領域の定量結果 (I)；n = 各群 3。スケールバー = 50 μm(J, K) 心臓切片の代表的な小麦胚芽凝集素（WGA）染色像（J）および心筋細胞相対面積の定量結果（K）。n = 各群3。スケールバー = 20 μmデータは平均値として提示する。 ± 標準偏差 P < 0.05, **P < 0.001. この図を拡大して表示するには、ここをクリックしてください。
心機能
イソフルラン吸入による麻酔後、マウスを温度制御プラットフォーム（37°C）上の仰臥位に固定した。40 MHzトランスデューサを搭載した超音波診断装置を用いて、左心室の寸法および拡張期と収縮期の僧帽弁血流速度を測定し、そこからLVEFおよび短縮率（FS）を算出した。各マウスから3回連続の心周期を収集した。
細胞処理
H9c2細胞を、10%胎児牛血清および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDulbecco's modified Eagle's mediumを用い、5% CO₂を含む37°Cの加湿雰囲気下で培養した。細胞のコンフルエンスが70%～80%に達した時点で、2～3日ごとに継代した。実験では、細胞を10 cmディッシュに播種し、コントロール群、高グルコース/パルミチン酸（HG/PA）群、およびHG/PA + Lac-Phe群の3群に分けた。HG/PA群およびHG/PA + Lac-Phe群の細胞を、まず0.25 mMパルミチン酸および50 mMグルコースに24時間的に暴露した。その後、HG/PA + Lac-Phe群の細胞には、HG/PAへの暴露を維持したまま10 μg/mL Lac-Pheをさらに24時間処理し、HG/PA群には同一のHG/PA条件下で等量のPBSを投与した。p-AMPK阻害実験では、10 μM AMPK-IN-3（DMSOに溶解）をLac-Pheと同時に24時間添加し、対応するコントロール群には等量のDMSOを投与した。アトルバスタチンを用いた実験では、HG/PA条件下にあるH9c2細胞に対し、10 μMアトルバスタチンを単独で、または10 μg/mL Lac-Pheと併用して24時間処理した。
組織学的染色
Lac-Pheの投与から28日後、マウスの心臓を採取し、4%パラホルムアルデヒド（pH 7.4）に24時間浸漬固定した。固定した心臓組織をパラフィン包埋し、厚さ6-μmの切片を作成した。組織切片をヘマトキシリン・エオジン、小麦胚芽凝集素、およびマッソン・トリクロームで染色した。すべての染色手順は、製造元のプロトコルに厳密に従って実施した。デジタルカメラシステムを備えた高解像度明視野顕微鏡を用い、20×倍率でホールスライドイメージングを行った。
ウェスタンブロット解析
タンパク質濃度はBradford法を用いて決定した。組織溶解物を10% (w/v) アクリルアミドゲルでSDS-PAGEにより分離し、ポリフッ化ビニリデン共重合体膜に電気泳動転写した。非特異的結合部位を5% 牛血清アルブミンで室温にて2時間ブロッキングした。次に、一次抗体（1:1,000に希釈）を用いて4°Cで一晩インキュベートし、その後シェーカー上でTBSTを用いて6回洗浄（各5分間）した。続いて、膜を西洋 horseradish peroxidase 標識二次抗体（1:5,000に希釈）で室温にて2時間インキュベートし、再びTBSTで6回洗浄（各5分間）した。タンパク質のバンドは、強化化学発光試薬キットを用いて可視化した。ウェスタンブロット結果の定量は、ImageJソフトウェアを用いた密度分析により行った。本研究で使用したすべての抗体は、材料表に記載されている。
トランスクリプトーム解析
TRIzol ReagentおよびRNeasy miniキットを用いて、C57BL/6Jマウスの心臓組織から全RNAを単離した。2100バイオアナライザーを用いてRNA品質を評価し、高いRNA純度と完全性が確認された。RNA-seqライブラリはVAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kitに従って調製し、Illumina NovaSeq 6000 System（シングルリード、150 bp）を用いてシーケンスを行った。DESeq2を用いて変動遺伝子を同定し、補正P値 < 0.05および絶対log₂ fold change > 1を統計的に有意と見なした。変動遺伝子に対して遺伝子オントロジー（GO）濃縮解析を行い、GO用語における変動遺伝子の濃縮の有意性を超幾何分布アルゴリズムを用いて算出した。
Oil Red O染色およびLD540脂質染色
心臓組織をOCTコンパウンドに埋め込み、厚さ10-μmの切片を作成した。凍結切片を室温で30分間静置して平衡化し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。PBSで洗浄後、切片を60%イソプロピルアルコールに15秒間浸し、Oil Red O作業溶液を加えて30分間反応させた。その後、切片を60%イソプロピルアルコールで15秒間処理し、PBSで3回洗浄した。LD540による脂質染色のために、H9c2細胞をPBSで洗浄し、室温で4%パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定した。次に、細胞を10 μM LD540と共に室温で30分間インキュベートした。
透過電子顕微鏡法 (TEM)
新鮮なマウス心臓組織を1–2 mm3の大きさに切断し、電子顕微鏡用固定液を用いて4°Cで4時間固定した後、二回蒸留水で洗浄し、段階的に濃度を上げたエタノール溶液に浸漬させた。その後、試料を包埋・薄切し、透過型電子顕微鏡下で観察した。
総コレステロール (TC) 量
血清およびH9c2細胞サンプルの総コレステロール（TC）値を、Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kitを用い、製造元のプロトコルに従って測定しました。
経口糖負荷試験 (OGTT)
マウスを14時間（19:00から9:00まで）絶食させた後、グルコース（20%ストック溶液、2 g/kg）を経口投与した。経口投与後 0、15、30、60、および120分に尾静脈から採血し、血糖値を測定した。
Cell counting kit-8 (CCK-8) 測定
細胞生存率の測定にはCCK-8を使用した。H9c2細胞を、初期密度 3 × 104 cells/wellで96ウェルプレートに播種した。HG/PA条件下で異なる濃度のLac-Pheを用いて24時間処理した後、1ウェルあたり100 μLの培地に10 μLのキット試薬を添加し、37°Cで4時間インキュベートした。マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて450 nmでの吸光度を測定し、光学密度（OD）値を算出した。
分子ドッキング
Lac-PheおよびAMPKα1の結晶構造をPubChem26からダウンロードした。分子ドッキングプロセスはCB-DOCK227を用いて実施した。
統計解析
すべての超音波心エコー測定、組織学的染色、および画像定量化は、群分けを知らされていない研究者によって行われた。すべてのデータ解析にはPrismおよびSPSS 20.0を使用した。各実験は少なくとも3回繰り返し、データは平均値 ± 標準偏差として的に示した。分散の均一性はLevene検定を用いて評価した。正規性は残差のグラフ視覚的確認により確認した。多群間の比較には一元配置分散分析を用い、次いでペア比較のためにTukeyのポストホック検定を行った。OGTTデータについては、群を被験者間因子、時間を被験者内因子とする二元配置反復測定分散分析を用い、次いでBonferroniのポストホック検定を行った。P < 0.05を統計学的に有意と見なした。
結果
Lac-Phe improves cardiac function in diabetic cardiomyopathy mice
We induced DCM in C57BL/6J mice using an HFD combined with STZ injections (Figure 1A) and randomly assigned the successfully established DCM mice to an untreated group (DCM group) and a Lac-Phe treatment group, with control C57BL/6J mice serving as the negative control. According to the study by Li et al.21, we selected 50 mg/kg as the therapeutic dose of Lac-Phe. After successful model establishment, the Lac-Phe treatment group received four weeks of exogenous Lac-Phe injections, while the untreated group received injections of an equivalent volume of saline. Compared with the DCM group, mice with diabetic cardiomyopathy treated with Lac-Phe exhibited a significant reduction in body weight after four weeks (Figure 1B). OGTT revealed that, compared with the negative control group, mice in the DCM group had significantly elevated blood glucose levels at all measured time points, indicating impaired glucose tolerance. In contrast, DCM mice treated with Lac-Phe showed improved glucose tolerance (Figure 1C). Echocardiographic analysis revealed that, compared with negative control mice, mice with DCM exhibited significantly reduced LVEF and FS (Figure 1D–F). Treatment with Lac-Phe increased LVEF and FS in DCM mice. Histopathological analysis using H&E staining showed pathological hypertrophy in the cardiac tissue of DCM mice compared with control mice (Figure 1G). Lac-Phe treatment markedly alleviated myocardial hypertrophy. Masson’s trichrome staining further demonstrated that Lac-Phe significantly alleviated myocardial fibrosis in DCM hearts (Figure 1H,I). WGA staining indicated that Lac-Phe significantly reduced the cross-sectional area of cardiomyocytes in DCM hearts (Figure 1J,K). These experiments demonstrate that exogenous administration of Lac-Phe effectively improves cardiac function and ameliorates pathological remodeling in mice with DCM.
Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in DCM
To further elucidate the mechanism of Lac-Phe in DCM, we performed transcriptomic analysis of mouse cardiac tissues. Following data acquisition, GO and KEGG pathway analyses were conducted. GSEA of the fatty acid metabolic process and KEGG pathway enrichment analysis indicated alterations in pathways related to lipid metabolism (Figure 2A,B). To further investigate how Lac-Phe functions in the hearts of DCM mice, we conducted TEM analysis (Figure 2C,D) to examine whether Lac-Phe treatment altered the ultrastructural morphology of the hearts of DCM mice. TEM imaging revealed a significant increase in LD density within the hearts of DCM mice compared with control mice, whereas Lac-Phe administration effectively reduced this LD density. Given the established significance of lipid metabolism dysregulation in DCM, we further assessed cardiac lipid accumulation using Oil Red O staining (Figure 2E,F). Histological analysis demonstrated markedly increased lipid accumulation in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment reduced this lipid accumulation. Lac-Phe treatment also reduced the TC level in the serum of DCM mice (Figure 2G). To select an appropriate dose of Lac-Phe for the in vitro experiments, we employed the CCK-8 assay to measure the viability of H9c2 cells treated with various concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions (Figure 2H). H9c2 cells treated with Lac-Phe at a concentration of 10 μg/mL under HG/PA conditions exhibited the highest survival rate among the tested concentrations. Thus, we selected 10 μg/mL Lac-Phe for the subsequent experiments. H9c2 cells exposed to HG/PA showed significant lipid accumulation, as demonstrated by LD540 staining and fluorescence quantification (Figure 2I,J), and TC content was also increased (Figure 2K). Lac-Phe treatment reversed these changes, significantly reducing both lipid accumulation and TC levels in H9c2 cells. Collectively, these experimental findings demonstrate that Lac-Phe effectively attenuates cardiac lipid accumulation and ameliorates lipid metabolism dysregulation in DCM mice and reduces lipid accumulation and TC levels in HG/PA-treated H9c2 cells.
Figure 2. Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy. (A) Gene set enrichment analysis (GSEA) of the fatty acid metabolic process in the Control and DCM groups. (B) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis comparing the DCM and DCM + Lac-Phe groups. (C) Representative transmission electron microscopy (TEM) images of cardiac tissues, with red arrows indicating lipid droplets (LDs). Scale bar = 2 μm. (D) Quantification of the mean number of LDs per 100 μm2; n = 3 per group. (E,F) Representative Oil Red O staining of cardiac tissues (E) and quantification of the relative Oil Red O-positive area (F); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. (G) Relative total cholesterol (TC) levels in serum from the indicated groups; n = 3 per group. (H) Cell viability measured by the CCK-8 assay in H9c2 cells treated with 0, 1, 5, 10, or 20 μg/mL Lac-Phe under HG/PA conditions. (I,J) Representative LD540 staining of H9c2 cells (I) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (J); n = 3 per group. Scale bars = 200 μm. (K) TC levels in H9c2 cells from the indicated groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.
Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and H9c2 cells
To identify potential targets through which Lac-Phe improves lipid metabolism, we screened DCM-associated proteins using GeneCards28 and predicted proteins potentially interacting with Lac-Phe using SwissTargetPrediction29 (Figure 3A). By comparing the results, we identified six potential target genes (Figure 3B). Analysis of these six genes revealed that HMGCR is a core regulator of cholesterol metabolism and also plays a central role in DCM (Figure 3C)30. To determine whether Lac-Phe regulates lipid metabolism via HMGCR, we first examined the p-HMGCR/HMGCR ratio in mouse hearts. Western blot analysis revealed that the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3D,E). These findings are consistent with increased HMGCR phosphorylation and reduced HMGCR activity following Lac-Phe treatment. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3F,G). These results demonstrate that Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and in HG/PA-treated H9c2 cells, supporting the involvement of HMGCR in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism.
Figure 3. Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between DCM-associated proteins and predicted Lac-Phe-associated proteins. (B) Six overlapping proteins associated with DCM and Lac-Phe. (C) Protein-protein interaction network showing HMGCR within the network of DCM-associated proteins. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (G); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.
Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells
To further evaluate the effect of Lac-Phe on lipid metabolism via HMGCR, we used atorvastatin as a control. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin produced a greater reduction in lipid accumulation than atorvastatin treatment alone. LD540 staining and fluorescence quantification demonstrated that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin reduced LD accumulation in H9c2 cells (Figure 4A,B). TC content measurement showed a similar effect (Figure 4C). Western blot analysis showed that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin significantly increased the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 4D,E). These results indicate that combined Lac-Phe and atorvastatin treatment is associated with reduced lipid accumulation and TC levels and increased HMGCR phosphorylation in H9c2 cells.
Figure 4. Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells. (A,B) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (A) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (B); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (C) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.
Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation
To further explore the molecular mechanism by which Lac-Phe regulates HMGCR, we reanalyzed the mouse cardiac transcriptome data. Through KEGG analysis of the transcriptomic data, we identified 160 differentially enriched pathways between the DCM and Control groups and 89 differentially enriched pathways between the DCM and DCM + Lac-Phe groups (Figure 5A). Sixty pathways overlapped between these two comparisons. From these 60 overlapping pathways, we selected the AMPK pathway. AMPK plays a critical role in regulating lipid metabolism in DCM31. Furthermore, AMPK is upstream of HMGCR (Figure 5B). We hypothesized that Lac-Phe might regulate HMGCR by modulating AMPK, ultimately improving lipid metabolism. To test this hypothesis, we first performed molecular docking of AMPKα1 and Lac-Phe using CB-DOCK2. The molecular docking results showed that the best-ranked predicted binding conformation between Lac-Phe and AMPKα1 had an affinity of −7.6 kcal/mol (Figure 5C). These results suggest a potential interaction between Lac-Phe and AMPKα1 but do not establish direct intracellular binding. To determine whether Lac-Phe affects the AMPK pathway in DCM, we examined AMPKα1 phosphorylation in the hearts of DCM mice. Western blot analysis revealed that the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5D,E). In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5F,G). These findings indicate that Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in DCM mouse hearts and HG/PA-treated H9c2 cells.
Figure 5. Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between pathway enrichment results for the DCM/Control and DCM + Lac-Phe/DCM comparisons. (B) Schematic illustrating AMPK and HMGCR phosphorylation and the associated inhibition of cholesterol synthesis. (C) Predicted three-dimensional molecular docking interaction between Lac-Phe and AMPKα1; binding affinity = −7.6 kcal/mol. (D,E) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (G); n = 3 per group. GAPDH was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01. Please click here to view a larger version of this figure.
AMPK inhibition attenuates Lac-Phe-mediated HMGCR phosphorylation and improvement of lipid metabolism in H9c2 cells
We then added a p-AMPK inhibitor to H9c2 cells receiving Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor decreased the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (Figure 6A,B) and reduced the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 6C,D). These findings indicate that inhibition of AMPK phosphorylation is accompanied by reduced HMGCR phosphorylation during Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor also diminished the effect of Lac-Phe on lipid metabolism. LD540 staining and fluorescence quantification showed increased lipid accumulation in H9c2 cells treated with the p-AMPK inhibitor compared with cells receiving Lac-Phe without AMPK inhibition (Figure 6E,F). TC levels in H9c2 cells also increased following AMPK inhibition (Figure 6G). These results collectively support the involvement of AMPKα1/HMGCR signaling in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism. Lac-Phe increased AMPKα1 phosphorylation, which was associated with increased HMGCR phosphorylation and reduced lipid accumulation and TC levels. Inhibition of AMPK attenuated these effects in H9c2 cells, supporting the hypothesis that Lac-Phe improves lipid metabolism through regulation of the AMPKα1/HMGCR pathway.
Figure 6. AMPK inhibition attenuates the effects of Lac-Phe on HMGCR phosphorylation and lipid accumulation in H9c2 cells. (A,B) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells treated with HG/PA, Lac-Phe, and/or AMPK-IN-3 as indicated (A) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (B); n = 3 per group. (C,D) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (C) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (D); n = 3 per group. GAPDH and β-tubulin were used as loading controls in (A) and (C), respectively. (E,F) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (E) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (F); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (G) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.
Collectively, the findings from the in vivo and in vitro experiments support a proposed mechanism whereby Lac-Phe increases AMPKα1 and HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced cholesterol levels and lipid accumulation and improved cardiac function and pathological remodeling in DCM. The proposed AMPKα1/HMGCR pathway underlying the effects of Lac-Phe is summarized schematically in Figure 7.
Figure 7. Proposed mechanism by which Lac-Phe improves lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy through the AMPK/HMGCR pathway. Schematic illustrating the proposed mechanism whereby Lac-Phe promotes AMPKα1 phosphorylation, followed by HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced lipid droplet accumulation and lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy. AMPK, AMP-activated protein kinase; HMGCR, HMG-CoA reductase; LD, lipid droplet. Please click here to view a larger version of this figure.
Data Availability:
The raw data supporting the findings of this study have been deposited in Zenodo and are publicly available at https://zenodo.org/records/21991371
ディスカッション
本研究において、我々はLac-PheがDCMに対して治療効果を持つことを支持する根拠を提示します。Lac-Pheは、心筋細胞におけるコレステロール産生を抑制し、脂質代謝不全を改善させることで、DCMにおける心室リモデリングおよび心機能不全を改善しました。メカニズムとしては、Lac-PheがAMPKα1のリン酸化を促進していました。続いて、AMPKα1のリン酸化亢進は、その下流ターゲットであるHMGCRのリン酸化亢進および抑制と関連しており、これがコレステロール合成の減少を導き、最終的に心筋細胞における脂質代謝不全を改善しました。要約すると、本研究はLac-PheがAMPK/HMGCRシグナリング経路を介してDCMにおける心脂質代謝を改善することを示しています。主要な知見と提案されたメカニズムの概略図を図7に示します。
脂質代謝の不均衡は、拡張性心筋症（DCM）における心筋障害に寄与する重要な因子の1つです15。心筋細胞への過剰な脂質蓄積はリポトキシンを引き起こし、その結果、心筋細胞の機能不全と病理学的な心リモデリングを招きます16。長期的な高血糖と肥満は、脂質代謝異常を導く重要な要因となります25。Lac-Pheは、食物摂取量を効果的に減少させ、肥満および体重を軽減し、グルコース恒常性を改善できる内因性物質であることが示されています21。また、近年の報告では、Lac-Pheが脊髄損傷時のミクログリアおよびマクロファージにおける脂質代謝を調節できることが示されており23、別の疾患モデルにおいてもLac-Pheが脂質代謝を調節できることが証明されています。内因性代謝産物として、代謝性疾患におけるLac-Pheの役割は大きな関心を集めています。しかしながら、DCMにおけるLac-Pheの役割については、まだ十分に解明されていません。本研究では、DCMにおける心筋細胞の脂質代謝におけるLac-Pheの役割を明らかにしました。トランスクリプトーム解析を通じて、Lac-Phe治療がDCMマウスの心臓における脂質代謝関連経路の変化に関連していることを見出しました。オイルレッドO染色および透過電子顕微鏡（TEM）観察により、Lac-Phe投与を受けたDCMマウスの心臓において脂質蓄積が減少していることが確認されました。これらの知見は、Lac-Pheが心臓の脂質蓄積を減少させ、病理学的リモデリングを改善することで、DCMに対して心保護作用を及ぼすことを示唆しています。また、in vitro実験においても、HG/PA条件下に置かれたH9c2細胞において、Lac-Phe投与が脂質蓄積を軽減することが実証されました。
HMGCRは、メバロン酸経路におけるNADPH依存的な律速酵素である30。HMGCRは、コレステロール生合成における重要なステップであるHMG-CoAからメバロン酸への変換を触媒する30,31,32。HMGCRは、心血管疾患およびDCMに関連する治療標的となる33。臨床的に、HMGCRの阻害は心血管リスクを低減させるための確立されたアプローチである34。我々の実験データは、Lac-Pheが2型糖尿病マウスの心臓におけるHMGCRのリン酸化を増加させることを示しており、これはHMGCR活性の抑制およびコレステロール合成の減少と一致している。in vitro研究ではさらに、HG/PA条件下に置かれたH9c2細胞において、Lac-Pheの投与がHMGCRのリン酸化を増加させ、それに伴いコレステロールレベルが低下することが示された。検討した実験条件下では、Lac-Pheとコレステロール低下薬であるatorvastatinを併用することで、atorvastatin単独よりも大きな効果が得られた。atorvastatinで処理したH9c2細胞にLac-Pheを加えると、HMGCRのリン酸化が増加し、脂質の蓄積が減少した。これらの知見は、Lac-Pheを通じてHMGCRのリン酸化を標的にすることで、コレステロール産生を抑制し、DCMにおける脂質代謝バランスを回復させることが可能であることを支持している。しかし、Lac-PheがDCM患者に対して安全で効果的な治療戦略となり得るかについては、さらなる検討が必要である。
ミトコンドリアのエネルギー代謝における重要な酵素であるAMPKは、糖尿病などの代謝性疾患の研究において中心的な役割を担っています35,36。AMPKは、リン酸化と脱リン酸化の調節を通じて、心臓の脂質代謝に極めて重要な役割を果たします。リン酸化されたAMPKは、その活性型を表しています37。p-AMPKは、CPT-1を調節することで、脂肪酸酸化（FAO）のためのミトコンドリアへの脂肪酸流入を促進します38。先行研究39と一致して、我々の結果では、AMPKのリン酸化の増加がHMGCRのリン酸化の増加およびコレステロール合成の減少に関連していることが示されました。STZおよびHFDによって誘発されたDCM（拡張性心筋症）モデルマウスでは、持続的な高血糖が心臓のp-AMPKレベルの変化を招く可能性があります40。糖尿病の初期段階で心機能に変化がない場合、心臓のp-AMPKレベルは影響を受けない可能性があります10,37,41。8週間以上の持続的な高血糖を伴う進行した糖尿病では、病理的な心リモデリングが始まり、p-AMPKレベルが低下することがあります10。AMPKの活性を維持することは、DCMを予防するための効果的な戦略として提案されています10,42。2型糖尿病の治療に広く用いられている薬剤であるメトホルミンは、AMPK経路を活性化することが示されていますが、心臓に対しては中立的な影響を及ぼすことが報告されています43,44。興味深いことに、メトホルミンの急性および慢性の投与はいずれもLac-Pheレベルを上昇させ得ます22。これらの観察結果は、Lac-PheがAMPK活性化に関連する代謝シグナル伝達に寄与している可能性を示唆していますが、本研究において、外因性Lac-Pheがメトホルミンよりも特異的または安全な効果を生むことは立証されていません。
本研究において、図5DおよびEに示されるように、DCMモデルの後期ではAMPKα1のリン酸化が著しく減少しており、この結果は先行研究42と一致している。トランスクリプトーム解析により、Lac-Phe投与を受けた2型糖尿病マウスの心臓においてAMPK経路に関与する変化が明らかになり、ウェスタンブロット解析ではLac-Phe投与後にAMPKα1のリン酸化が増加することが示された。分子ドッキングシミュレーションは、Lac-PheとAMPKα1との間に相互作用がある可能性を示唆しており、これは最近の研究23と一致する。重要な点として、分子ドッキングのみではLac-PheとAMPKα1の間の直接的な細胞内結合を証明することはできない。in vitro実験では、AMPK阻害剤による処理がAMPKα1のリン酸化を抑制し、それに伴いHMGCRのリン酸化が減少することが示された。AMPK阻害剤の添加後、Lac-Pheの効果は減弱し、それに伴いH9c2細胞における脂質蓄積の増加とコレステロール含有量の増加が認められた。総合的に、これらの結果は、Lac-Pheが脂質代謝に及ぼす影響にAMPKα1/HMGCRシグナル伝達が関与していることを支持している。Lac-PheはAMPKα1のリン酸化を増加させ、それがHMGCRのリン酸化増加、コレステロールレベルの低下、および脂質蓄積の減少に関連していたが、AMPKを阻害するとこれらの効果は減弱した。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、すべての動物実験は雄マウスを用いて行われた。雄のC57BL/6JマウスにおいてLac-PheがDCMに対して治療効果を持つことを実証したが、性は心血管疾患に影響を及ぼす重要な因子である45。したがって、Lac-Pheが雌マウスにおいても同様の効果を持つかは不明である。第二に、トランスクリプトーム解析は心臓全体のサンプルを用いて行われたため、Lac-Phe投与後の心臓における細胞型特異的な変化が見逃された可能性がある。シングルセル解析を行えば、観察された効果の背景にある細胞および分子の不均一性についてより深い洞察が得られる可能性があり46,47、この仮説をさらに検証するための代替アプローチとなる。最後に、本研究で使用した超音波診断装置の限界により、マウスの心拡張機能を評価することができなかった。したがって、Lac-PheのDCMに対する治療効果を明確にし、潜在的な性別依存的な効果を評価し、細胞型特異的な反応を調査し、拡張機能を評価し、さらに観察された効果の根底にあるメカニズムを解明するために、さらなる研究が必要である。要約すると、本研究はDCM治療において注目すべき潜在的な内因性代謝物としてLac-Pheを支持する根拠を提供するものである。さらに、我々の知見は、Lac-PheがAMPKα1/HMGCR経路を介してDCMにおける心筋細胞の脂質蓄積を減少させるという提案されたメカニズムを支持している。具体的には、Lac-PheはAMPKα1のリン酸化を増加させ、それがHMGCRのリン酸化増加、コレステロール合成および脂質蓄積の減少、そして病的なリモデリングの改善に関連していた。Lac-PheとAMPKα1の分子的な相互作用を確立し、これらの知見の潜在的な臨床応用の可能性を決定するためには、さらなる調査が必要である。
開示事項
利益相反：
著者に開示すべき事項はありません。
謝辞
技術的なサポートを提供してくださった南京鼓楼医院臨床医学院および南京大学医学院附属病院の研究者およびスタッフの皆様に心より感謝申し上げます。本研究は、中国国家自然科学基金（助成金番号 81870291 および 82300384）、中国博士後科学基金（助成金番号 2023M731625）、および江蘇省自然科学基金（助成金番号 BK20220175）からの助成金によって支援を受けました。また、南京工業大学高度合成研究所によるリソースの提供および共同研究への支援に感謝いたします。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AMPK-IN-3（p-AMPK阻害剤） | MedChemExpress (MCE) | HY-132921 | 使用時点 10 μM Lac-Phe処理細胞におけるAMPKシグナリングを抑制するための、AMPK阻害実験において。 |
| Amplex Red コレステロールおよびコレステリルエステル測定キット | Beyotime | S0211S | 血清およびH9c2細胞サンプル中の総コレステロール値を測定するために使用します。 |
| 抗AMPK抗体α1 | Cell Signaling Technology | 2532; RRID: AB_330331 | AMPKのウェスタンブロット解析に使用した一次抗体α1. |
| 抗GAPDH抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 5174; RRID: AB_10622025 | GAPDHのウェスタンブロット解析に使用した一次抗体。 |
| 抗HMGCR抗体 | Abcam | ab174830; RRID: AB_2749818 | HMGCRのウェスタンブロット分析に使用した一次抗体。 |
| 抗p-AMPK抗体α1 (Thr172) | 細胞シグナル伝達技術 | 2535; RRID: AB_331250 | リン酸化AMPKのウェスタンブロット解析に使用した一次抗体α1. |
| 抗p-HMGCR (Ser872) | Abcam | ab124350 | リン酸化HMGCRのウェスタンブロット解析に使用した一次抗体。 |
| 抗ウサギIgG抗体（HRP標識） | Cell Signaling Technology | 7074; RRID: AB_2099233 | ウェスタンブロット検出に1:5,000の希釈倍率で使用。 |
| 抗-β$\alpha$-チューブリン | 細胞シグナリング技術 | 2128; RRID: AB_823664 | 〜のウェスタンブロット解析に使用した一次抗体 β$\alpha$-チューブリン |
| アトルバスタチン | MedChemExpress (MCE) | HY-17379 | 単独で、またはLac-Pheと組み合わせて使用し、HG/PA処理したH9c2細胞における脂質蓄積、総コレステロール値、およびHMGCRリン酸化への影響を評価する。 |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A7906 | ウェスタンブロット解析における非特異的結合をブロックするため、5%の濃度で使用します。 |
| ブラドフォード法アッセイ試薬/キット | Thermo Fisher Scientific | 23200 | ウェスタンブロット解析前のタンパク質濃度定量に使用されます。 |
| C57BL/6Jマウス（5週齢、雄） | 南京大学モデル動物研究センター | 提供されたソーステキストがありません。翻訳対象となるテキストを入力してください。 | HFD/STZ誘発糖尿病性心筋症マウスモデルの作製に使用される。 |
| セルカウンティングキット-8 (CCK-8) | Sharebio | SB-CCK8S | 処理後のH9c2細胞の生存率を測定するために使用した。 |
| クエン酸緩衝液 | 院内で調製 | 翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳する原文をご提示ください。 | pH 4.5で調製し、STZの溶解に、および対応する溶媒対照として使用した。 |
| 対照食（脂肪10%、タンパク質20%、炭水化物70%） | Research Diets, Inc. | D12450J | 対照群のマウスの飼料として使用した。 |
| D-(+)-グルコース | Sigma-Aldrich | 翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。 | HG/PA細胞処理および経口ブドウ糖負荷試験に使用される。 |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | AMPK-IN-3の溶媒として、および対応するビークルコントロールとして使用した。 |
| ダルベッコ’修飾Eagle’培地 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965092 | H9c2細胞の基礎培地として使用する。 |
| 40 MHzトランスデューサ搭載超音波心エコー装置 | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 3100 LT; 40 MHz トランスデューサー | 左室寸法および僧帽弁血流速度の測定、ならびに左室駆出率（LVEF）および短縮率（FS）の算出に使用されます。 |
| 電子顕微鏡用固定液 | ServiceBio | G1102 | 透過電子顕微鏡観察用に、新鮮なマウス心臓組織を固定するために使用します。 |
| エタノール | Sigma-Aldrich | E7023 | 透過電子顕微鏡試料作製における脱水過程で、濃度を段階的に上げて使用する。 |
| ウシ胎児血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10099141 | H9c2細胞培養培地の補完として10%の濃度で使用する。 |
| H9c2細胞株 | サンセル | RRID: CVCL_0286 | HG/PAおよびLac-Phe処置実験のin vitro心細胞モデルとして使用した。 |
| ヘマトキシリン・エオシン染色 | ServiceBio | G1005-1/2 | 心臓組織の組織学的評価に使用される。 |
| 高脂肪食（脂肪分 60 kcal%） | Research Diets, Inc. | D12492 | 低用量のSTZと併用し、糖尿病性心筋症マウスモデルを構築する。 |
| 高解像度明視野顕微鏡 | Leica | DM2500 | 染色済み心臓組織の20倍全スライドイメージングに使用。× 倍率 |
| ImageJ | アメリカ国立衛生研究所 | 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳するソーステキストを入力してください。 | ウェスタンブロット結果のデンシトメトリーによる定量に使用されます。 |
| イソフルラン | Sigma-Aldrich | 792632 | マウス心エコー検査中の麻酔に使用します。 |
| イソプロピルアルコール | Sigma-Aldrich | I9516 | 凍結心臓切片のオイルレッドO染色において、60%の濃度で使用した。 |
| LD540脂質染色 | Beyotime | C2050S-1 | 使用場所： 10 μM 細胞内脂質を染色するため。 |
| マッソン’三色染色（トリクローム染色） | ServiceBio | G1006 | 心臓組織の組織学的染色に使用される。 |
| N-ラクトイル-フェニルアラニン (Lac-Phe) | MedChemExpress (MCE) | HY-146098 | DCMマウスに投与し、HG/PAに曝露させたH9c2細胞の治療に使用した。 |
| オイルレッドO作業溶液 | ServiceBio | G1015-100ML | 凍結心臓組織切片における脂質の染色に使用されます。 |
| Omni-ECL 高効率化学発光キット | EpiZyme | SQ203L | ウェスタンブロッティング後、タンパク質バンドを化学発光により可視化するために使用します。 |
| パルミチン酸 | Sigma-Aldrich | P0500 | 高グルコースとともに0.25 mMで使用し、HG/PA処理H9c2細胞モデルを構築する。 |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | 4%溶液として調製し、組織学的染色または脂質染色の前に心臓組織および細胞を固定するために使用する。 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | H9c2細胞培養液に1%の割合で使用する。 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 染色手順中の洗浄、および細胞処理実験における対応する溶媒として使用する。 |
| Prism | GraphPad ソフトウェア | バージョン 8.0 | 実験データの統計解析に使用されます。 |
| PVDF転写膜、 0.45 μm | Thermo Fisher Scientific | 88518 | ウェスタンブロット分析におけるタンパク質の電気泳動転写に使用される。 |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | マウス心臓組織からの全RNAの単離および精製に使用します。 |
| 塩化ナトリウム溶液 0.9%（生理食塩水） | Sigma-Aldrich | S8776 | Lac-Pheの溶解および、Control群およびDCM群のマウスに対するビヒクルコントロールとして使用した。 |
| SPSS | IBM | バージョン20.0 | 実験データの統計解析に使用されます。 |
| ストレプトゾトシン (STZ) | Sigma-Aldrich | S0130 | 糖尿病性心筋症マウスモデルを確立するため、高脂肪食（HFD）の投与とともに投与した。 |
| TBS Tween-20緩衝液 (20×) | Thermo Fisher Scientific | 28360 | ウェスタンブロット分析において、一次抗体および二次抗体によるインキュベーション後にメンブレンを洗浄するために使用します。 |
| Tissue-Tek O.C.T. コンパウンド | Sakura Finetek | 4583 | Oil Red O染色のための凍結切片作製前の心臓組織の包埋に使用します。 |
| 透過電子顕微鏡 | 日立 | HT7800 | マウス心臓組織における超微形態的変化の検討に使用された。 |
| TRIzol試薬 | Invitrogen | 15596026 | マウス心臓組織からの全RNA抽出に使用。 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq ライブラリ調製キット | Vazyme | NR616-01 | トランスクリプトーム解析のためのRNA-seqライブラリ調製に使用します。 |
| 小麦胚芽凝集素 (WGA) | ServiceBio | W7024 | 心臓組織の組織学的評価に使用されます。 |
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