方法論記事

Drosophila melanogasterにおけるDR-whiteアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復の測定

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DOI：

10.3791/72635

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2026年8月14日

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

この記事について

サマリー

DR-whiteアッセイは、多細胞生物であるDrosophila melanogasterにおけるDNA二本鎖切断修復の結果を検出するための汎用性の高い遺伝子レポーターアッセイです。

要約

DNA二本鎖切断（DSB）修復に関する従来の研究は、生化学的な調査や単細胞系（細胞や酵母など）に限定されることが多い。多細胞生物におけるDSB修復の研究を促進するため、我々はDrosophila melanogasterにおいてDR-whiteアッセイを用いる。DR-whiteアッセイは、単一のI-SceI認識配列を保持するシンプルかつ汎用性の高いDSB修復リポーターアッセイであり、I-SceIメガヌクレアーゼの発現によって切断される。I-SceIの発現は、構成的、熱ショック経由、または他のプロモーター下で誘導でき、組織特異的あるいは発生段階特異的な修復の調査が可能である。本アッセイの主な利点は、相同組換え（HR）、非相同末端結合（NHEJ）、および単鎖アニーリング（SSA）に関与する修復結果を区別できる点にある。本記事では、確立されたDR-whiteアッセイの詳細なプロトコルを提供し、減数分裂前の生殖細胞系列においてDSBを誘導し、後代のスコアリングによって修復イベントを表現型的に解析するためのステップバイステップのワークフローを説明する。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、シーケンシング、およびTracking of Indels by DEcomposition（TIDE）Rスクリプトによる修復イベントの分子解析についても記述する。本プロトコルは、個体モデルにおけるDNA修復の遺伝学的および分子的なメカニズムを調査するための有用なツールとなる。

概要

ゲノムの完全性はしばしばDNA損傷によって脅かされますが、その中でも二本鎖切断（DSB）は特に毒性が高いものです。これらの切断が未修復のままであると、遺伝情報の喪失、染色体再編成、および細胞死につながる可能性があります1。そのため、細胞はDSBを修復するための複数の経路を進化させてきました。非相同末端結合（NHEJ）はDSBの両末端を直接結紮しますが、切断部位にインデル（挿入・欠失）が導入される可能性があります。単鎖 アニーリング（SSA）は、切断部位に隣接する相補的配列を利用して修復を行うため、切断部位に欠失が生じます。一方、相同組換え（HR）は相同配列を修復のテンプレートとして利用します2,3。

歴史的に、DSB修復の研究は、生化学的アッセイ4や、細菌5,6、酵母7,8、哺乳類細胞培養9,10などの単細胞系に限られてきました。これらのモデルは、主要な修復タンパク質とそのメカニズムを特定する上で極めて重要でしたが、多細胞生物が持つ生物学的な複雑さは欠けていました。Drosophila melanogasterは、DNA修復を研究するための多細胞モデルシステムとして普及しています。しかし、現在の多くのアッセイは、特定の修復経路に特化していたり11、Pエレメント除去のような大規模な染色体異常を利用していたり12、あるいは時間のかかる分子解析を必要としていたりします13。DR-whiteアッセイは、DrosophilaにおけるDNA修復の簡便な遺伝的レポーターを提供することで、これらの課題を解決します14。本研究では、確立されたDR-whiteアッセイを用いてDNA DSB修復を測定するための、遺伝学的および分子生物学的アッセイを行うための完全で実用的かつ詳細なステップバイステップのワークフローを提供します。

このアッセイでは、～の2つのダイレクトリピートを用います。 キイロショウジョウバエ 白 (w) 遺伝子は、野生型の赤色眼を規定する（図1）。どちらのコピーも機能していません。1つ目は、 Sce.white、野生型SacI部位にI-SceIメガヌクレアーゼ認識配列を持つ挿入断片を含み、未成熟終止コドンを導入しているもの。2つ目は、 iwhiteは、5'末端と3'末端の両方が切断されており、HR修復のテンプレートとして機能します。A ショウジョウバエ 黄色 導入遺伝子 (y+）、野生型の茶色の体色を付与するこれが2つの間に存在し 白 リピート。DR-白 カセットが～に組み込まれています。 y w 変異体背景、DR-白 ショウジョウバエは表現型として、体色が野生型の褐色で、眼が変異型の白色である。

DR-white系統のハエとI-SceIトランスジーンを保持するハエを掛け合わせることで、Sce.white部位にDSBを誘導できます。減数分裂前の生殖細胞におけるDSBの修復は、テスター交配の後代をスコアリングすることで測定可能です。NHEJによる修復は、親世代の褐色の体色と白色の眼という表現型をもたらし（Figure 1A）、HRによる修復は野生型のwhite配列を復元し、褐色の体色と赤色の眼を持つ後代をもたらします（Figure 1B）。DSBのSSA修復または有糸分裂交叉は、間に挟まれたyellowトランスジーンの消失を引き起こし、結果として黄色の体色と白色の眼を持つハエとなります（Figure 1C）。体細胞における修復結果を解析するため、我々はTracking Indels by DEcomposition (TIDE) アルゴリズムを適応させ、特にDR-whiteアッセイにおけるプロセシングを伴うNHEJおよびHR修復を検出できるようにしました15,16

DR-whiteアッセイは、Drosophilaにおいて以前に確立されたDNA修復アッセイよりもいくつかの利点があります。断裂が生殖細胞系で生成および修復されるため、修復結果を表現型解析によって容易に検出できます。同時に、このアッセイは非常に汎用性が高いのが特徴です。主にHR修復の測定を目的として設計されていますが、3つすべての修復経路を検出することが可能です。さらに、機能的な2種類の追加修復テンプレートも開発しました（図2）。iwhite.muテンプレートには28個のサイレント一塩基多型（SNP）が含まれており、赤色の目の子孫を産出させるため（図2A）、遺伝子変換領域（GCT）の長さや、分岐した配列間でのHR修復の研究を容易にします14。 iwhiteΔ9テンプレートは、野生型のSacI部位に9塩基対の欠失を持っており、オレンジ色の目の子孫を産出させます（図2B）。この特徴により、研究者は異なるテンプレートからのHR修復を追跡することができ、これはDR-whiteアッセイ独自の機能です15。

プロトコル

1. DR-whiteアッセイ

  1. 遺伝学的交配（図3A)
    注：標準的な ショウジョウバエ 培養および遺伝学プロトコルについては、〜を参照してください。 "フライプッシング：ショウジョウバエ遺伝学の理論と実践" Ralph J. Greenspan 著17系統の遺伝型情報は、以下に記載されています。 材料表.
    1. ショウジョウバエを25 °C、12時間明暗サイクルの標準飼料で維持する。 ショウジョウバエ 活性酵母を振りかけた食物。
    2. 8～10個のDR-を交配させ、5本のヒートショック用バイアルを準備します。白 処女雌を、～を保持する3～5匹の雄に I-SceI 導入遺伝子（交配1、 図3A）/バイアル
      注：異なる I-SceI アプリケーションに応じて、さまざまな導入遺伝子を利用することができます。本プロトコルでは、 hsp70-I-SceI 熱ショック誘導のために導入遺伝子が利用された。11漏れを防ぐため I-SceI 以前の世代における発現においては、DR-を確実にすることが重要である。白 および I-SceI トランスジェーンが同一の個体に導入されるのは、この世代のみである。
    3. 同日に、aの拡大培養ボトルを準備する y w ストック。これらがテスター個体となる。3本の拡張ボトルがあれば、およそ60～80回のテスター交配に十分である。
    4. ヒートショック用培養バイアルを準備し、 y w 25 °Cで3日間、拡張ボトル内で培養した。
    5. 3日目に、ヒートショックバイアルを反転させ、 y w バックアップセットとして使用するため、拡張ボトルを新鮮な培地に移します。
  2. ヒートショック／DSB誘導
    注：熱ショック誘導型を使用しない場合 I-SceI 導入遺伝子がある場合はステップ1.2.5にスキップしてください。通常、これはステップ1.1.5の3日後に行います。
    1. すべての後代が母性・接合子移行を完了していることを確認するため、ヒートショック後のバイアルを25 °Cで3時間静置する。
    2. 元のバイアルを38 °Cの恒温水槽で1時間ヒートショック処理する。幼虫が水面より上に這い上がらないよう、水位が少なくとも脱脂綿の下端と同じ高さにあることを確認すること。
    3. ウォーターバスの温度を15分ごとに監視し、38 ± 0.5 °Cの範囲内に維持してください。これは、誘導および修復の結果がヒートショックの時間と温度に依存するためです。
    4. バイアルを25 °Cに戻す。
    5. 翌日、過剰な水分を吸収させるため、折り畳んだラボワイプを1/3枚分、餌に加えます。餌が乾燥している場合は、ラボワイプに約100 µLの水を加えます。次に、脱脂綿を y w エキスパンションボトル
    6. ヒートショックを与えたバイアルを25 °Cでさらに6日間、またはハエが羽化し始めるまで培養する。
    7. 反転操作から3日後、バックアップ用バイアルおよび拡大培養用ボトルの洗浄を行う。バックアップ用バイアルに脱脂綿を追加する。 y w 透明化から約4日後に、増殖ボトルへ移す。
      注：必要に応じて、バックアップバイアルをステップ1.2.1から1.2.6と同様にヒートショック処理し、以下に記載する方法で処理することができます。
  3. テスター交配
    1. DR-を保持し、ヒートショックを与えたハエを回収する。白 および I-SceI 羽化開始後4～5日間の外来遺伝子導入個体を使用することで、発生段階によるバイアスを低減し始める。
      注：DR-を保持し、ヒートショック処理に成功したショウジョウバエ白 および I-SceI 胚および幼虫期における修復イベントを経て成体組織へと発達したため、モザイク眼に伴い導入遺伝子が存在している。モザイク現象の程度は、必ずしも生殖細胞系列の修復イベントと相関するわけではないため、テスター交配（ステップ1.3.3）に使用する実験用のハエを選別する際の決定要因とすべきではない。
    2. 回収 y w 処女雌を5日間維持する。予想サンプル数につき、処女雌を5匹ずつ回収する。バックアップの増殖ボトルから、羽化が始まった直後に回収すること。
    3. ヒートショックを与えた雄1匹を4〜5匹の（雌と）交配させ、テスターバイアルを準備する。 y w 未交配の雌（交配2； 図3A）。発生段階によるバイアスを軽減するため、ステップ1.3.1で集めたプールから雄をランダムに選択する。テスターとの交配個体は25 °Cで培養する。
      注：DR-のクロスオーバーを避けるため、白 および I-SceI一般的に雄の生殖系列が解析されますが、雌の子代を解析することも可能です。雌の子代を解析する場合、交配2のテスターバイアルを雌：雄＝2：5の比率で準備します。y w オス比率を調整し、生産性を確保するために5～6日間培養する（次のステップへ）。
    4. テスターバイアルのセットアップから4日後に生産性を確認し、いつクリアすべきかを評価する。
      注：少なくとも20匹のスコア可能な子孫を確保できる十分な数の卵が産み付けられていることを確認してください。ただし、培養密度が高くなりすぎないように注意してください。さもないでなければ、ショウジョウバエが餌に張り付く可能性があります。
    5. テスターバイアルの準備が整ったら（テスター交配の開始から最大4～5日後）、ハエを廃棄し、過剰な水分を吸収させるために、折り畳んだラボワイプを1/3枚分、餌に加える。
      注：さらなる解析（例：分子ジェノタイピング）が必要な場合は、この時点で雄を採取してもよい。
    6. テスターバイアルを25 °Cでさらに5〜6日間培養する。
  4. スコアリング
    注：各遺伝学的実験（例：ホモ接合型変異体およびヘテロ接合型コントロール）について、各条件につき約25本のテスターバイアルを準備する。各遺伝学的実験は2〜3回繰り返し、個々のバイアルのデータをプールする。
    1. 交配2の後代をスコアリングする（図3A最初のハエが羽化し始めてから約9日間。
    2. CO2を用いてハエを麻酔させる2 または、餌のない空のバイアルにハエを移し、-20 °Cで少なくとも30分間冷凍することによって行う。
      注：ショウジョウバエを冷凍保存した場合、数日後まで表現型解析（スコアリング）を行うことが可能です。
    3. ショウジョウバエをフライパッドに載せ、適切な表現型についてスコアリングを行う（図3A）。20匹以上のハエをスコアリングしたバイアルのみをデータセットに含めてください。
      1. スコア判定を行うには、まずDR-を保持するショウジョウバエを分取します。白 カセット（赤色蛍光タンパク質陽性［RFP+］蛍光をマーカーとして使用）を用い、次いで眼および体の色を判定する。
      2. The y+ DR-に連結された外来遺伝子白 カセットにより、完全な野生型ではない中間的な茶色の体色になります。DSBなし/NHEJ（茶色の体色； y+ w-) および SSA（黄色体； y- w-）、ショウジョウバエを～と比較する y w DR-を持たない子孫白色 染色体（RFP-）。SSAイベントが発生した個体は、これらのハエと同様に黄色になります。これらの個体よりも色が濃い（より茶色い）ハエは、DSB/NHEJなしとしてスコア判定してください。
        注：〜に記載されている表現型からの逸脱は 図3A 汚染の可能性が示唆されるため、そのバイアルはスコアリングすべきではありません。死んでいる個体であっても全体が揃っていればスコアリング可能ですが、表現型が判定できないほど損傷している個体は廃棄してください。

2. TIDE解析（図4）

  1. ゲノムDNA（gDNA）抽出18
    1. DR-の両方を保持し、ヒートショックを与えたショウジョウバエ（または幼虫）を回収する。白 および I-SceI 導入遺伝子（交雑1の後代における）図3A).
    2. 1.5 mLマイクロチューブにハエを1匹ずつ入れ、急冷する（例：ドライアイス・エタノールバスまたは液体窒素を使用）。
      注意：ドライアイス、液体窒素、エタノール、イソプロパノール、およびその他の化学薬品を取り扱う際は、適切な個人用保護具を着用し、施設の安全手順に従ってください。
      一時停止ポイント：  サンプルは-80 °Cで保存し、必要に応じて後で処理することが可能です。ショウジョウバエまたは幼虫を解析する場合は、1サンプルあたり1匹のハエまたは幼虫を使用してください。より小さな組織（脳や成虫盤など）を解析する場合は、DNA収量を増やすためにサンプルをプールしてください。
    3. 各サンプルを50 µLのバッファーA（100 mM Tris-Cl, pH 7.5; 100 mM エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]; 100 mM 塩化ナトリウム; 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム [SDS]）に加え、電動ホモジナイザーを用いてホモジナイズする。
    4. サンプルを65 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートする。
    5. 各サンプルにバッファーB（1.4 M 酢酸カリウム、4.3 M 塩化リチウム）を100 µL加え、チューブを転倒させて軽く混合する。
      注：個体（ハエ）全体を使用する場合、サンプルの完全なホモジナイズに、より多くの量が必要になることがあります。その場合は、バッファーAとバッファーBの体積比を1:2に維持してください。
    6. サンプルを氷上で少なくとも30分間インキュベートする。
    7. サンプルを約16,000 x gで遠心分離します。 g 4 °Cで15分間。
    8. 清澄な上清125 µLを、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。この際、沈殿物が混入しないように注意すること。
    9. 上清125 µLにつき、室温の100%イソプロパノール100 µLを加え、チューブを反転させて軽く混ぜ合わせる。
    10. サンプルを約16,000 x gで遠心分離します。 g 室温で10分間。
    11. DNAペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引してください。
      注：この段階ではDNAペレットが見えない場合があります。マイクロ遠心機にチューブをセットした際の向きを記録しておき、ペレットが存在すると予想される位置とは反対側から吸引してください。
    12. ペレットを氷冷した70%エタノール250 µLで洗浄し、チューブを静かに反転させて短時間混合する。
    13. サンプルを約16,000 x gで遠心分離します。 g 4 °Cで5分間。
    14. ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引して除去する。
      注：エタノール洗浄後、ペレットがより視認しやすくなる場合があります。視認できない場合は、以下を参照してください。 注記 ステップ 2.1.11 について。
    15. チューブのキャップを開けたまま室温に置き、残留エタノールを蒸発させます。ペレットを乾燥させすぎると、完全に再懸濁できなくなる可能性があるため注意してください。
    16. ヌクレアーゼフリー水を20 µL加え、4 °Cで一晩置いてペレットを再懸濁させる。
      保留点：DNAペレットが完全に溶解していない場合は、水を適量追加してください。
    17. 翌日、チューブを静かに転倒混和させ、DNA濃度を測定する。すぐに処理しない場合は、サンプルを-20 °Cで保存する。
      注：1匹のハエからの抽出では、通常、収量は約100 ng/µLとなります。高品質なサンプルを得ることが重要です。260/A280 吸光度は1.7から2.0の間である必要があります。この範囲外の値は、タンパク質などの不純物の混入を示唆しています。A260/A230 2.0から2.2の間である必要があります。この範囲外の値は、エタノールやバッファー塩などのコンタミネーションを示しています。収量が低く品質が劣るサンプルでは、PCR増幅効率が低下する可能性があります。
  2. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
    1. 増幅させる Sce.white 100 ngのgDNAおよびプライマーDR-を用いたPCRにより白_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) および DR-白メーカーの指示に従い、_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) を用いる。DR- を含める。白 コントロールショウジョウバエ検体（すなわち、DR-白 親株（なし） I-SceI （導入遺伝子が存在する場合）。以下のサイクル条件を用いる：94 °Cで3分；{94 °Cで30秒；66 °C（1サイクルあたり-0.5 °C）でタッチダウンPCRを30秒；72 °Cで30秒} x 16サイクル；{94 °Cで30秒；58 °Cで30秒；72 °Cで30秒} x 20サイクル；72 °Cで5分；12 °Cで保持。
      注：異なる試薬を使用する場合、サイクリング条件を調整する必要がある場合があります。
    2. 約2 µLのPCR産物を1%トリス-酢酸-EDTA（TAE）アガロース診断用ゲルで電気泳動し、Sceの増幅を確認する。白色期待されるアンプリコンサイズは約1.7 kbです。
    3. PCR精製 Sce.white アンプリコンを回収し、DNA濃度を測定する。
    4. プライマーDR-を用いて、精製済みPCR産物をシーケンシングする。白_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC)。
      注：通常、精製したPCR産物を40 ng使用してシーケンシングを行いますが、シーケンシングサービスの指示によって異なる場合があります。
  3. TIDE解析
    注意：TIDE Rスクリプトの使用によって生じるほとんどのエラーは、コードのフォーマット不備に起因します。
    1. Bioconductor.orgから必要なRパッケージ（sangerseqRおよびBiostrings）をダウンロードします。検索バーを使用して、各パッケージの最新バージョンを探してください。
    2. シーケンスクロマトグラムを解析し、品質が良好であることを確認してください。ブレイクサイト（切断部位）の前にバックグラウンドがほとんどない、または全くないクロマトグラムのみを解析してください。
    3. シーケンス波形ファイル（拡張子 .ab1）をダウンロードし、すべての波形ファイルをコンピュータ上の単一のフォルダに保存します。以降の手順におけるスクリプト編集を容易にするため、シーケンスファイル名は可能な限り簡潔にしてください（例：F1、Het2、Hom3）。
    4. TIDE Rスクリプトを開きます（補足ファイル 1)をRStudio統合開発環境（IDE。以下を参照）で 材料リスト）。ソースペインで、「Control」で始まる行を探します。 <- (補足ファイル 2A）と入力し、コントロールシーケンスのファイル名を、.ab1拡張子を含めて保存時と全く同じように、引用符で囲んで入力します。
      注：「コントロール配列」とは、親株のDR-由来のPCR配列のことである。白 ストックなし I-SceI 導入遺伝子または誘導。
    5. samplenameで始まる行を特定してください。 <- c( と入力し、括弧内に各サンプルのシーケンスファイル名を入力してください（補足ファイル 2A). .ab1拡張子を含め、各ファイル名を個別の引用符で囲み、ファイル名の間をカンマで区切ってください。
    6. 編集済みのTIDE Rスクリプトファイルを、解析対象の配列と同じフォルダに保存します。以降のステップでのエラーを避けるため、ファイル名は簡潔にしておいてください。
    7. IDEの出力ペインにある「Files」タブを使用して、TIDEフォルダに移動します（補足ファイル 2B).
    8. ～をクリックしてください さらに詳しく ドロップダウンから選択してください ここで新しいターミナルを開く (補足ファイル 2C）。コンソールペイン（左下）に新しいターミナルが開きます。
    9. 新しく開いたターミナルに、「R”を押します 入力 (補足ファイル 2D).
    10. ターミナルでRが起動したら、source( と入力してTIDE Rスクリプトを実行してください。"TIDE_analysis.R")を押し、 入力 (補完ファイル 2E）。ターミナルでスクリプトを実行すると、グラフィカルな表現が生成されます（補足ファイル2F)および、各サンプルの生データを含む.csvファイル（補足ファイル 2G および 補足ファイル 3). 出力ファイルは、Rスクリプトおよび配列ファイルと同じフォルダーに保存されます。
      注意：同じRスクリプトを再実行すると、新しく生成された.csvファイルが古いファイルを上書きします。同じファイルを用いて複数の解析を行う場合は、フォルダのコピーを作成してください。
    11. 各.csvファイルを開いてデータを解析してください。
      1. 生データを、サンプル配列におけるインデル（挿入・欠失）の割合として解釈します。I-SceI認識配列から野生型SacI配列への相同組換えによる遺伝子変換が起こると、標準的な23 bpの欠失が生じます。スクリプトは、このHR（相同組換え）値を出力結果の最下部に別行で報告します（補足ファイル 2G）。0-indel値は、DSBが発生しなかったか、またはインデルを伴わないNHEJが行われたことを表します。その他のすべてのインデル値を合計することで、プロセッシングを伴うNHEJの値を算出します。プロセッシングを伴うNHEJとHRの合計が、検出可能なDSB修復イベントの総数となります。
      2. 以下の式を用いて、検出可能なDSB修復イベントにおける修復経路の割合を算出してください。
        プロセシングを伴うNHEJの割合 = (プロセシングを伴うNHEJ) / (プロセシングを伴うNHEJ + HR)
        HR比率 = (HR) / (プロセシングを伴うNHEJ + HR)
        注：各遺伝学的実験（例：ホモ接合体変異体およびヘテロ接合体対照群）において、各条件につき約10～15個のサンプルを使用します。各遺伝学的実験は2～3回繰り返し、個々のデータをプールします。

結果

ショウジョウバエ 相同組換えによる修復におけるRad51の必要性

生殖細胞系列の実験が成功すると、図3Aに示す期待される表現型クラスが得られ、1バイアルあたり少なくとも20匹の評価可能な後代が得られます。予期しない表現型が現れたり、評価可能な後代が20匹未満であったりする場合は、コンタミネーションまたは生産性の不足を示しており、ステップ1.4.3の規定に従い除外する必要があります。TIDE解析においては、成功したサンプルでは約1.7 kbのアンプリコンが生成され、ブレイクサイトの前に背景ノイズがほとんどないクロマトグラムが得られます。収量の低いDNAやコンタミネーションのあるDNA、およびノイズの多いクロマトグラムは最適ではなく、解析に使用すべきではありません。

DR- を使用する場合、白 熱ショック誘導性I-SceI源を用いたアッセイにおいて、野生型ショウジョウバエにおける相同組換え（HR）修復の頻度は38.5 ± 1.2%（平均 ± 標準誤差）であるのに対し、単鎖アニーリング（SSA）は約3.2 ± 0.35%（図 3B および 補足ファイル 4). Rad51（ホモログによってコードされる spnA 内（に） ショウジョウバエ）は、相同組換えのストランド侵入ステップに必要である。14,19したがって、Rad51の喪失はHRの効率低下を招くはずである。実際に、ある DmRad51-/- 背景として、HR修復は1.3 ± 0.4%まで減少し、それに伴いSSA修復が増加する（34.5 ± 1.8%）。 図3B および 補足ファイル 4)14これは、相同組換えに割り当てられた修復イベントが、代わりに以下のシングルストランドアニーリングによって修復されたためである可能性が非常に高い。 白 反復配列

Drosophila CtIPによる体細胞組織における効率的なHR修復への寄与

TIDEアルゴリズムを用いることで、体細胞における修復経路の選択を測定することが可能です。非変異背景において、検出可能な修復イベントの59.0%でプロセシングを伴うNHEJが起こり、41.0%でHRが起こります（図4B および 補足ファイル 4)。CtIPは、DNA末端の切除を促進することで、HR修復の開始において重要な役割を果たします。20したがって、 DmCtIP-/- 背景として、体細胞における相同組換え（HR）経路の選択は著しく減少しており、ヘテロ接合体コントロールの41.0%からホモ接合体変異体の10.9%に低下している（図4B および 補足ファイル 4)16これは、～において...であることを示唆しています。 ショウジョウバエCtIPはHR修復に寄与するが、必須ではない。

DNA修復経路を示すDR-whiteアッセイの図。Sce.white遺伝子要素を用いたHR、NHEJ、SSA法。
図1DR-w白 DSBリポーターアッセイおよび修復結果。 のダイレクトリピート 白 アッセイには、〜の非機能的なコピーが2つ含まれている 白 遺伝子： Sce.white （I-SceI認識部位を含む23 bpの挿入があり、早期終止コドンが導入されている）および iwhite (5′および3′末端を欠損したドナー配列)。DR-を含むハエを交配させ、白 および一つの I-SceI 導入遺伝子が部位特異的な二本鎖切断（DSB）を誘導し、これを表現型または分子レベルで解析することが可能です。得られる表現型は以下の通りです（A）白眼の子代（y+ w−）、DSB、姉妹染色分体間HR、またはNHEJが生じていないことを示しています。（B) 赤色の目の子代 (y+ w+)、これは野生型を復元する染色体内相同組換え（HR）が起こったことを示している SacI ～からの配列 iwhite ドナー、および（C) 黄色体・白色目の子代 (y− w−）、これは単鎖アニーリング（SSA）または有糸分裂における乗り換え（CO）を示している。図はDoらより改変。14略語：CO = クロスオーバー；DR-白 = whiteの直接反復; DSB = 二本鎖切断; HR = 相同組換え; NHEJ = 非相同末端結合; SSA = 一本鎖アニーリング こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子編集ダイアグラム：相同組換え、I-SceI切断、DR-white.mu、DNA、iwihiteΔ9、SacI部位。
図2: DR-の誘導体白 アッセイ (A) DR-ホワイト・ムウ アッセイには28個のサイレントSNPが含まれています。 iwhite.mu ドナー配列により、ダイレクトリピート間に1.4%の配列相違が生じる。個々の多型における遺伝子変換はHRイベントごとに異なり、シーケンシングによって決定できる。B) DR-白 ～を用いて iwhiteΔ9ドナーにより、姉妹染色分体間組換えと染色体内組換えを区別する。染色体内からの相同組換え（HR） iwhite ドナーが野生型を回復させる SacI 配列であり、赤目の子孫を産生する。相同染色体間の相同組換え（HR） iwhiteΔ9ドナーは、9 bpの欠失によって減少するため、橙色目の子孫を産生する 白 発現。図はDoらによるものを改変。14 およびFernandezら。15略語：DSB = 二本鎖切断、HR = 相同組換え、SNP = 一塩基多型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ショウジョウバエの遺伝子修復経路、遺伝的交配図、後代分布棒グラフ解析。
図3: 減数分裂前生殖系列におけるDSB修復結果を検出するための実験ワークフロー。 (A) 交配1は、DR-を組み合わせたものである。白 レポーター（またはその誘導体）と I-SceI 導入遺伝子（この例では第2染色体上）。DR- をともに保持する後代白 アッセイおよび I-SceI トランスジェーンは、生殖細胞系および体細胞組織において維持・修復イベントを保持します。前減数分裂期の生殖細胞における個々の修復イベントを解析するため、両方のトランスジェーンを保持する子世代を、以下と交配させます。 y w テスターフライ（交配2）を用い、得られた後代を以下の通りスコア判定する。 図1. (B) 野生型ショウジョウバエにおける個々の生殖細胞系DSB修復イベント (n = 106の生殖系列)および DmRad51 ホモ接合型変異体（n = 46 生殖細胞系列)。**P < 0.01; ****P < 二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびそれに続くSidakの多重比較検定により、p < 0.01であった。棒グラフは平均値を、エラーバーは標準誤差（SEM）を示す。データはDoらによる研究から再解析したものである。14略語：ANOVA = 分散分析、CO = クロスオーバー、DSB = DNA二本鎖切断、HR = 相同組み換え、NHEJ = 非相同末端結合、SEM = 平均標準誤差、SSA = 一本鎖アニーリング この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

TIDE解析を用いたサンガーシーケンシングによる遺伝子編集プロセスの確認；修復方法の比較チャートを含む。
図4: DEcomposition法（Tracking of Indels by DEcomposition）を用いて二本鎖切断（DSB）修復結果を検出するための実験ワークフロー。 (A) DR-を保持するショウジョウバエ白 および誘導された I-SceI トランスジーンの解析は、gDNA抽出、DSB部位をまたぐPCR増幅、サンガーシーケンシング、およびRスクリプトを用いたTIDE解析によって行われます。B) からの代表的なデータ DmCtIP-/- 変異体（n = 23) および DmCtIP+/- ヘテロ接合体対照（n = 31）。検出可能な修復イベントは、DSBなし/インデルを伴わないNHEJを除いた、HRとプロセシングを伴うNHEJの合計として算出する。P < 2元配置分散分析（two-way ANOVA）後、Sidakの多重比較検定を行い、p < 0.001であった。棒グラフは平均値を、エラーバーは標準誤差（SEM）を示す。データはThomasらの論文から再解析したものである。16略語：ANOVA = 分散分析、DSB = 二本鎖切断、gDNA = ゲノムDNA、HR = 相同組換え、NHEJ = 非相同末端結合、PCR = ポリメラーゼ連鎖反応、SEM = 平均標準誤差、TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition（分解によるインデル追跡法） こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1： no-DSBコントロールに対する配列クロマトグラム中の挿入および欠失を同定するためのTIDE Rスクリプト。ユーザーが編集可能なコントロールファイル名、サンプルファイル名、およびI-SceI標的配列は、スクリプトの終盤に記載されています。必要な入力データ、出力ファイル、および結果の解釈については、セクション2.3に記載されています。sangerseqRおよびBiostringsパッケージが必要です。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 2：TIDE R スクリプトワークフローのステップバイステップ・スクリーンショットガイド。これらのパネルは、セクション 2.3 で説明されているソフトウェア操作を示しています。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 3： TIDE出力の例と修復イベントの計算。 0-indelの値は、DSBが発生しなかったか、あるいはindelを伴わないNHEJであることを表します。独立したHRの行は、標準的な23-bp欠損産物を表し、それ以外のすべてのindelパーセンテージは、プロセッシングを伴うNHEJとして合算されます。検出可能な総修復量は、HRとプロセッシングを伴うNHEJの合計として算出されます。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 4： 図 3B および図 4B の根拠となる生データ。個別の編集可能なワークシートに整理されています。これらのデータは、対応する図の説明文で引用されている既報の研究から再解析されたものです。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

DR-whiteシステムの汎用性は、DNA修復分野における過去および将来の影響に寄与する重要な要因である。第一に、DR-whiteレポーター構築物内のattB統合配列により、研究者はDrosophilaゲノム内の多数の部位にレポーターを標的化することができ21、すでにいくつかの標的化系統が利用可能である22。第二に、hsp70プロモーターによる熱ショック発現（本研究）、ubiquitinプロモーターによる構成的発現23、およびBamプロモーターによる減数分裂前生殖細胞系発現24など、異なるI-SceIトランスジェンの利用可能性により、DSB修復を探索するための多くの発生段階および組織特異的なコンテキストが提供される。使用する I-SceIトランスジェンに関わらず、適切なDSB誘導を確実にするため、I-SceIトランスジェンが最終交配でのみ導入されるよう、遺伝的交配を慎重に計画しなければならない。修復頻度は、DR-whiteのゲノム上の位置および/または使用したI-SceI トランスジェンによって大きく異なる可能性があることに注意することが重要である。今後の実験では、ゲノム上の位置とI-SceIトランスジェンをさらに比較することで、ゲノムのコンテキストまたは組織特異性のどちらがDSB修復を駆動しているかを決定できる可能性がある。

DR-whiteアッセイおよびその派生系の特筆すべき利点は、相同組換え、プロセシングを伴うNHEJ、そして多くの場合においてSSAによるDSBの修復を同定できることです。本システムは表現型的に生殖細胞系列の修復イベントを検出するように設計されていますが、TIDEアルゴリズム解析を用いることで体細胞組織の解析も可能です。これらの利点がある一方で、本アッセイには考慮すべきいくつかの制限事項があります。特に、DR-whiteアッセイはHRの頻度を過小評価する可能性があります。ヌクレアーゼ誘発DSBを利用する他の遺伝的リポーターアッセイと同様に、姉妹染色分体からのHRによる修復（姉妹間HR）は、DSBが発生しなかったイベントやプロセシングのないNHEJと区別がつきません。したがって、「No DSB/NHEJ」クラスの一部には、少なくともいくつかのHRイベントが含まれている可能性があります。この制限を考慮すると、遺伝的要因（変異株など）を比較した結果の解釈には注意が必要です。本アッセイのその他の制限としては、生存可能な子孫を残さなかった減数分裂前のイベントをスコア付けできないことが挙げられます。例えば、修復されずに細胞死に至ったDSBイベントは、子孫においてスコア付けされません。全体的な受精能が生殖細胞死の定性的指標となり得ますが、細胞ベースのアッセイ（TUNELなど）が必要になる場合があります。さらに、TIDE Rスクリプト解析では、細胞集団における検出可能なイベントの割合しか提供されません。具体的なindel配列の結果を決定するには、マルチプレックスDNAシーケンシングを用いた個々の修復イベントのシーケンシングが必要です。

DR-whiteアッセイは、DSB修復の研究においてすでに多大な影響を与えています。この手法の適用により、年齢25、性別26、DSBの位置22,26、ドナー配列の位置15、細胞周期、および組織型26を含む、多細胞生物におけるDSB修復に寄与する因子の特定が進んできました。さらに、本アッセイを用いて、Msh627、Blm28、Rif116、CtIP16,29など、Drosophilaにおける修復経路の選択や、分岐した配列の修復を促進するいくつかのタンパク質を同定しました。実際に、保存されたDNA修復タンパク質を持つ遺伝学的なモデル生物としてDrosophilaが確立されていることは、複雑な生物学的コンテキストにおけるDSB修復に寄与する遺伝的、細胞的、および個体レベルの因子を調査するための簡便な多細胞システムを提供しています。

開示事項

著者らに開示すべき金銭的または非金銭的な利益相反はありません。

謝辞

本手法は、J.R.L.がAmerican Federation for Aging Research（米国老化研究連盟）のAFAR研究助成金を受給していた間に開発されました。 また、本研究は米国国立総合医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）からJ.R.L.への助成（1R15GM110454および1R15GM129628）によって支援されました。図はBioRender（https://BioRender.com/b8sbcjp）2026の支援を受けて作成されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 mL RNase/DNaseフリーペッスルFisher Scientific12141363gDNA抽出のための試料の均質化に
脱脂綿Genesee Scientific51-101標準的なショウジョウバエ飼育用
ショウジョウバエ用ペルチェ式冷却インキュベーターシェル研究室SRI6PF標準的なショウジョウバエ飼育用
ショウジョウバエ系統：y[1] w[1]ブルーミントン・ショウジョウバエ  ストックセンターRRID:BDSC 1495
ショウジョウバエ系統：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque研究室該当なしBloomington Drosophila Stock Centerから入手したストックRRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2])を、LaRocque labが標準的な組換えによって作製。責任著者に請求することで入手可能。
ショウジョウバエ系統：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque研究室入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。ストックRRID:BDSC_24482（y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP）に組み込まれたDR-whiteアッセイ’}ZH-51C）；責任著者への請求により提供可能
ショウジョウバエ系統：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque研究室該当なしストックRRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP)に組み込まれたDR-white.muアッセイ’}ZH-51C）；責任著者に請求することで入手可能
ショウジョウバエ系統：y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque研究室該当なしiwhiteΔ9個のドナーをストックRRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP})に組み込んだ’}ZH-51C）；責任著者への請求により提供可能
ショウジョウバエ用FlugsボトルキャップGenesee Scientific49-100標準的なショウジョウバエの飼育用
蛍光実体顕微鏡 (RFP)TriTech ResearchSMT1-FL標準的なショウジョウバエ（Drosophila）用 "フライプッシング" および蛍光に基づく分取
FlyStuff ショウジョウバエ用フライパッドGenesee Scientific59-172標準的なショウジョウバエ用 "フライプッシング"
キムワイプスKimberly-Clarke06-666A
MyBath 4L ウォーターバスMidwest ScientificMB-2000-4〜のために  ヒートショック
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYDNA定量用
Nutri-fly Bloomington処方培地Genesee Scientific66-121標準的なショウジョウバエ飼育用
ペレットペッスル式コードレスモーターホモジナイザーDWK Life SciencesK749540-0000gDNA抽出のための試料ホモジナイズに使用
ポリプロピレンボトルGenesee Scientific32-130標準的なショウジョウバエ培養用
ポリスチレン製バイアルGenesee Scientific32-116ヒートショックを含む標準的なショウジョウバエの飼育法
プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_8f該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分である。該当なし5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_8a該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分である。該当なし5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
プライマー/オリゴヌクレオチド DR-white_9f該当なし。任意のオリゴヌクレオチド合成サービスで十分です。提供されたソーステキストがございません。翻訳対象のテキストをご提示ください。5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R Studio仮説を立てるバージョン 2023.06.1+524無料でダウンロード可能なバージョン。R Studioはどのバージョンでも使用可能であるが、提示されたデータは以下のバージョンを用いて解析された。  バージョン 2023.06.1+524
R Studioパッケージ：BiostringsBioconductor.org (バージョン 3.24)バージョン 2.76.0Rスクリプトが、このパッケージをインストールするようユーザーに促します。
R Studioパッケージ：sangerseqRBioconductor.org (バージョン 3.24)バージョン 1.44.0Rスクリプトにより、ユーザーにこのパッケージのインストールを促します。
SapphireAMP 高速 PCRTakaraRR350B
実体顕微鏡LeicaM60標準的なショウジョウバエ（Drosophila）用 "フライプッシング"
Wizard SV GelおよびPCRクリーンアップ PromegaA9281

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