閉塞性睡眠時無呼吸症候群を合併した急性脳梗塞患者においてmiR-486-3pは発現低下しており、疾患の重症度および炎症マーカーと負の相関を示し、1年後の不良な予後を予測することから、診断および予後予測バイオマーカーとしての有用性が示唆された。
この記事について
サマリー
要約
閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSAS）を合併した急性脳梗塞（ACI）は、脳卒中の再発および死亡の高いリスクを伴いますが、この合併症に対する有効なバイオマーカーは依然として限られています。本レトロスペクティブ・コホート研究では、2020年11月から2023年12月の間にACIを発症した患者270名を登録し、ACI群（n = 100、無呼吸低呼吸指数［AHI］< 5）とOSAS合併ACI群（n = 170, AHI ≥ 5）に分類しました。後者はさらに、軽症（5 ≤ AHI < 15, n = 60）、中等症（15 ≤ AHI < 30, n = 75）、重症（AHI ≥ 30, n = 35）のサブグループに層別化しました。血清miR-486-3pの発現量をRT-qPCRで測定し、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、C反応性蛋白（CRP）、低酸素誘導因子-1α（HIF-1α）を含む炎症マーカーをELISAで定量しました。miR-486-3pの診断価値を受信者動作特性（ROC）曲線分析を用いて評価し、その予後的意義をカプラン＝マイヤー生存分析およびCox回帰モデルを通じて評価しました。その結果、合併群ではmiR-486-3pが著しく低下しており、高い診断能（AUC = 0.927）を示しました。特に、OSASの重症度サブグループ間で明確な用量依存的な傾向が観察され、OSASが軽症から重症になるにつれて、miR-486-3pは段階的に減少し、TNF-αおよびCRPは段階的に増加しました。Spearman相関分析により、miR-486-3pはAHI、NIHSSスコア、TNF-α、およびCRPと負の相関があることが明らかになりました。1年後のフォローアップにおいて、miR-486-3p低発現の患者は、高発現の患者と比較して機能的アウトカムが有意に不良でした。多変量Cox回帰分析により、miR-486-3pが1年予後の独立した保護因子であることが確認されました。これらの知見は、miR-486-3pが全身性炎症における調節的役割を通じて、OSASを合併したACI患者の新規な診断および予後バイオマーカーとなり得ることを示唆しており、より大規模な前向きコホートによるさらなる検証が期待されます。
概要
閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSAS）は、睡眠中の繰り返される呼吸停止を特徴とする一般的な疾患である1。OSASは、代謝、心血管、腎臓、肺、および神経精神疾患などの併存疾患を伴うことが多い2。心血管疾患や代謝性疾患との一般的な関連に加え、OSASは急性虚血性脳卒中において特有かつ深刻な脅威となり、症例の最大70%に合併し、神経学的悪化、死亡、および脳卒中再発のリスクを増加させる3,4,5。急性脳梗塞（ACI）は、脳卒中のなかで最も頻度の高い形態である。近年、ACIの治療において大きな進展が見られたものの、依然として多くの患者が深刻な障害や死に至っている6。ACIにOSASが併発することによる相乗的な相互作用は、虚血性損傷と全身性炎症を悪化させ、脳卒中の再発、障害、および死亡のリスクを大幅に上昇させる。したがって、この高リスクな併存状態を早期に診断し管理するための信頼性の高いバイオマーカーを特定することが極めて重要である。
マイクロRNA（miRNA）は、近年バイオマーカーとして大きな期待を集めています。その中でも、miR-486-3pは神経血管疾患において非常に重要な役割を担っています。先行研究では、閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSA）においてmiR-486-3pの発現が抑制されることが示されています7。さらに、狂犬病ウイルス糖タンパク質-miR-486-3p-エクソソーム治療により、神経行動障害、脳浮腫、血液脳関門の損傷、および神経変性を軽減できることが示されており8、miR-486-3pが脳損傷に関与していることが示唆されています。ACI後、損傷した脳組織内のミクログリアが活性化し、炎症性サイトカインの分泌が促進されます5。OSASは間欠的低酸素症状を引き起こし、交感神経系の活性化と酸化ストレスを誘発し、それによって全身性の炎症カスケード反応をトリガーします9。miR-486-3pは炎症と密接に関連しています10。これらの証拠は、miR-486-3pがOSAS関連の低酸素症、全身性炎症、および脳卒中後の回復を繋ぐ分子的なリンクとして機能している可能性を示唆しています。
しかしながら、OSASを合併したACI患者におけるその発現プロファイル、診断精度、および予後的重要性は系統的に調査されておらず、OSASの重症度や炎症性メディエーターと用量依存的に相関するかどうかは不明なままでした。これらの知見の不足を解消するため、本研究ではACI患者におけるOSASに対するmiR-486-3pの診断的価値を評価し、OSASの重症度および炎症マーカー（TNF-α、CRP、HIF-1α）との用量依存的な関係を検討し、さらに1年後の機能的転帰に対する予後予測能を評価しました。我々の知る限り、本研究はmiR-486-3pが、おそらく全身性炎症の調節を通じて、ACI-OSAS合併症の新しい診断および予後バイオマーカーとして機能し得ることを示した初めての包括的な研究です。
プロトコル
本研究は、徐州医科大学附属病院の倫理委員会の承認を得て実施されました。 （承認番号：XYFY2024-KL238-01）であり、患者から追加のインフォームドコンセントを得る必要性は免除された。使用した試薬および機器は、以下の通りである。 材料表.
患者および検体
本研究はレトロスペクティブ・コホート研究である。2020年11月から2023年12月まで、徐州医科大学附属病院でACI治療を受けた計270名の患者を連続的にリクルートした。患者の選定プロセスは付録図1にまとめられている。適格患者は、脳卒中ユニットへの全新規入院患者の日次スクリーニングを通じて特定された。入院前72時間以内の症状発現は、救急診療記録の確認により検証され、認定神経内科医が患者の既往歴および家族へのインタビューを通じて確認した。サンプルサイズは、群間におけるmiR-486-3pレベルの有意差を検出できる能力に基づいて算出した。効果量を0.5、両側αを0.05、検出力(1-β)を0.80と想定し、1群あたり最低64名の患者が必要であった。最終的な群のサイズは、実際のリクルート数および脳卒中患者におけるOSASの高い有病率を反映したものであり、あらかじめ決定された割り付けによるものではない。ACIにOSASを併発した患者の予後を1年間追跡調査した。
組み入れ基準は以下の通りであった：(1) 入院前72時間以内に症状が出現し、磁気共鳴画像法（MRI）で確認された急性虚血性脳卒中。(2) 研究用の質問票および神経学的評価を理解し、完了できる能力を有すること。(3) 入院時の急性脳梗塞（ACI）の重症度は、米国国立衛生研究所脳卒中スケール（NIHSS）を用いて評価した。NIHSSスコアが <5未満の場合は軽症ACIに分類され、NIHSSスコアが5から20の間である場合は中等症ACIとみなされます。主な除外基準には、悪性腫瘍の既往歴、既存の重篤な身体障害または精神疾患、重度の心不全、肺不全、または腎不全、過去3か月以内の主要な手術または外傷、活動性の感染症または自己免疫疾患、6か月以内の脳卒中の既往、免疫抑制療法、およびOSASの診断または治療歴（持続陽圧呼吸療法を含む）が含まれます。
MRIによる確認のため、すべての患者に対して3.0-Tシステムを用いて標準的な脳MRI検査を行い、以下のシーケンスを撮影した：T1強調像、T2強調像、流体減衰反転回復（FLAIR）像、拡散強調画像（DWI）、および見かけの拡散係数（ADC）マップ。急性梗塞は、DWIで高信号を示し、かつ対応するADCで低信号を示すことと定義した。すべてのMRIスキャンは、臨床データを伏せられた2名の経験豊富な神経放射線科医によって読影され、意見の相違は合議によって解決した。NIHSSスコアリングは、血栓溶解療法または血管内治療を行う前に、認定神経内科医によって入院時に実施された。
脳卒中発症から24時間から48時間後に、少なくとも8時間のオーバーナイト絶食後、空腹時の静脈血を採取した。概日変動を最小限に抑えるため、採血は午前6時から午前8時の間に行った。末梢静脈血を合計5 mL、EDTAコート真空採血管に採取した。採取後2時間以内に、冷却遠心機を用いて4 °Cで1,500 × g、15分間遠心分離した。血清上清を1.5 mLのRNaseフリーマイクロ遠心チューブに注意深く分注し、RNA抽出まで直ちに−80 °Cで保存した。凍結融解サイクルの繰り返しは厳格に避け、すべての分注試料について、分析前に行う凍結融解サイクルは最大1回とした。
患者のグループ分け
参加者は、ポリソムノグラフィーによるAHIスコアに基づいてグループ分けされた。すべての記録は、午後10時から午前6時まで、最低7時間の期間、病院の睡眠検査室で実施された。モニタリングした生理学的チャネルは以下の通りである：脳波（EEG；6チャネル）、眼電図（EOG；2チャネル）、筋電図（EMG；顎および両側前脛骨筋）、心電図（ECG；単一誘導）、鼻腔気流（サーミスタおよび圧力変換器）、胸腹部呼吸努力（呼吸インダクタンス・プレチスモグラフィ）、およびパルスオキシメトリ（SpO2）。睡眠検査技師がAHIを算出した。睡眠段階および呼吸イベントのスコアリングは、Somnolyzer 24×7ソフトウェアを用い、米国睡眠医学会（AASM）2012年スコアリングマニュアルに従って、認定睡眠技師によって手動で実施された。広く認められている米国睡眠医学会の診断基準によれば、1時間あたり5回以上のイベントがあるAHIがOSA診断の標準的な閾値である。したがって、AHI < 5の参加者をACI群（n = 100）に、AHI ≥ 5の参加者をACI合併OSAS群（n = 170）に分類した。AHI ≥ 5の患者（ACI合併OSAS群、n = 170）については、確立された基準に基づき、さらに3つの重症度サブグループに層別化した：軽症OSAS（5 ≤ AHI < 15, n = 60）、中等症OSAS（15 ≤ AHI < 30, n = 75）、および重症OSAS（AHI ≥ 30, n = 35）。この層別化により、低酸素負荷、miR‑486‑3p発現、および炎症マーカーの間の用量依存的な関係の評価が可能となった。ベースラインのAHI測定における混同を避けるため、過去にOSAS治療（例：CPAP）を受けた患者は本研究に含まれなかった。
予後評価
1年というタイムポイントを設けることで、急性期の影響が消失し、閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSAS）による累積的な低酸素負荷が顕在化するため、その予後的影響を評価するための強固な期間を確保できる。OSASを合併した急性脳虚血（ACI）患者の臨床予後は、発症後のmodified Rankin Scale（mRS）によって評価した。すべてのmRS評価は、本研究に先立って標準化トレーニングを受けた認定神経内科医が、構造化mRSインタビューフォームを用いて実施した。評価者間信頼性はカッパ係数を用いて評価した。 >0.85. フォローアップ評価は、予定されていた外来クリニックへの受診を通じて行われた。対面での受診が困難な患者に対しては、トレーニングを受けた研究看護師が標準化されたスクリプトを用いて構造化電話インタビューを実施した。すべての評価者は、患者のmiR-486-3pレベルおよびOSASの状態について盲検化されていた。外来評価と電話評価の整合性を維持するため、どちらの形式においても同一の構造化質問票を使用し、すべての評価者は研究開始前にキャリブレーション演習を完了した。スコアが0〜2点の患者は予後良好群に、3〜6点の患者は予後不良群に分類された。フォローアップ脱落者はなかった。SAQLI、ESS、TNF-α、およびHIF-1α これらは予後群を定義するために用いられるのではなく、予後変数として評価された。NIHSS、SAQLI、およびESSは、訓練を受けた研究スタッフによって実施された。SAQLIおよびESSは、静かな部屋で面接者による質問票形式で実施された。
スコアリング指数
NIHSSは、脳卒中に対する定量的な評価尺度です。11、スコアが高いほどACIの重症度が高いことを示す。SAQLIはOSAに関する1〜7段階の生活の質（QOL）に関する質問票であり、スコアが高いほどQOLの低下を示し、日常生活、社会的相互作用、感情状態、症状、および治療に関連する症状を網羅している。12ESSは患者が自己報告する日中の眠気を評価するために用いられ、スコア範囲は0から24であり、スコアが > 10は日中の眠気を示します。13.
RNA抽出および逆転写
TRIzol試薬を用いて、200 µLの血清から全RNAを抽出した。簡潔に述べると、血清サンプルを800 µLのTRIzolと混合し、室温で5分間インキュベートした後、4 °Cで12,000 × gにて15分間遠心分離した。クロロホルム（200 µL）を添加し、混合物を15秒間激しく振盪し、3分間インキュベートした後、4 °Cで12,000 × gにて15分間遠心分離した。水相を新しいチューブに移し、500 µLのイソプロパノールでRNAを沈殿させ、−20 °Cで1時間インキュベートした後、4 °Cで12,000 × gにて10分間遠心分離した。RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、風乾させた後、20 µLのRNaseフリー水に溶解した。RNA濃度と純度はマイクロボリューム分光光度計を用いて評価し、A260/A280比が1.8から2.0の間にあるものを後続の解析に使用した。RNAの完全性はアガロースゲル電気泳動により確認した。
製造元のプロトコルに従い、ランダムヘキサマープライマーを用いて、Reverse Transcription Kitにより、総RNA 500 ngを全反応容量 20 µL で逆転写した。逆転写反応は、25 °Cで10分、42 °Cで60分、そして70 °Cで5分間行った。得られたcDNAは、使用時まで−20 °Cで保存した。
逆転写定量PCR（RT-qPCR）
miR-486-3pの発現は、リアルタイム定量PCR（qPCR）システムを用い、マイクロRNA定量用のSYBR GreenベースのリアルタイムPCRキットを使用して検出した。反応混合液には以下が含まれていた。 10 µL 2件中× SYBR Green Master Mix, 2 µL cDNAテンプレート（1:5希釈）の 1 µL 各プライマーの（10 µM）、およびヌクレアーゼフリー水を加え、最終容量を 20 µLプライマー配列は以下の通りである（5'→3'）：miR-486-3p-フォワード：TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU、リバース：CTCAACTGGTGTCGTGGA、およびU6-フォワード：CTCGCTTCGGCAGCACA、リバース：AACGCTTCACGAATTTGCGT。qPCRのサイクル条件は以下の通りであった： 95 °C 2分間、その後40サイクルの 95 °C 30秒間、 60 °C 30秒間、そして 72 °C 60秒間。各サンプルは3連で実行し、各ランにテンプレートなし対照（no-template control）を含めた。増幅の特異性は、以下の融解曲線分析によって確認した。 60 °C ～へ 95 °Cサイクルしきい値（Ct）は、デフォルトのしきい値設定を用いてQuantStudio 6 Proソフトウェア（v1.5）により自動的に決定した。miR-486-3pレベルは、$2^{-\Delta\Delta\text{Ct}}$法を用いて算出した。-ΔΔCT（コンピュータ断層撮影） 法を用い、U6で正規化した。群間での一貫性を確保するため、NormFinderアルゴリズムを用いて、我々の血清サンプルにおいてU6が安定したリファレンス遺伝子であることを検証した。アッセイ間およびアッセイ内の変動係数は <5%.
ELISA
C-reactive protein (CRP)、TNF-α、およびHIF-1αの血清濃度をELISAキットを用いて測定した。実験手順は製造元の指示に従って実施した。簡潔に述べると、血清サンプルを氷上で解凍し、付属の希釈バッファーで1:2に希釈した。サンプルおよび標準品をプレコート済み96ウェルプレートに添加し（100 µL/well）、37°Cで2時間インキュベートした。300 µLの洗浄バッファーで4回洗浄した後、ビオチン標識検出抗体を100 µL添加し、37°Cで1時間インキュベートした。再度洗浄ステップを行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを100 µL添加し、37°Cの暗所で30分間インキュベートした。発色基質（テトラメチルベンジジン、100 µL）を添加し、遮光下、37°Cで15分間インキュベートした。ストップソリューションを50 µL添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmで吸光度を測定した。濃度は、既知濃度のリコンビナントタンパク質を用いて作成した標準曲線から算出した。各サンプルは2連（duplicate）で測定し、その平均値を解析に使用した。製造元から提供された品質管理（QC）サンプルを各プレートに含め、QC値が製造元の指定範囲内にある場合のみ結果を採用した。
品質管理および再現性
すべてのラボアッセイは、RT-qPCRに関するMIQE（Quantitative Real-Time PCR実験の出版のための最小情報）ガイドラインおよびELISAの適切な報告基準に従って実施された。主要な機器は、製造元のスケジュールに従って校正された。プレート間の変動を監視するため、RT-qPCRおよびELISAの各ランのバッチに陰性および陽性コントロールサンプルを含めた。すべてのデータはMicrosoft Excelを用いて記録および管理されており、合理的な要求があれば、責任著者が詳細な実験プロトコルおよび生データを提供する。
統計解析
データはSPSS 23.0および統計・グラフ作成ソフトウェアを用いて解析した。正規性はShapiro–Wilk検定により評価した。連続変数は平均値 ± SDまたは中央値 (IQR) で示し、適宜t検定またはMann–Whitney U検定により比較した。カテゴリー変数はχ2検定により比較した。相関性はデータの分布に基づき、PearsonまたはSpearman解析を用いて検討した。予測能はROC曲線を用いて決定し、5分割交差検証により検証した。miR-486-3pの最適カットオフ値は、Youden指数を最大化することで決定した。相関性の評価にはPearsonおよびSpearman相関解析を用いた。予後解析では、miR‑486‑3p発現量の中央値で患者を層別化し、Kaplan–Meier曲線とlog-rank検定を用いて群間の生存転帰を比較した。単変量Cox回帰分析においてP < 0.1であった変数を多変量Coxモデルに投入した。P < 0.05を統計的に有意と見なした。
結果
ACI群およびACI・OSAS併存群におけるベースライン特性
表1に示すように、ACI群は男性68名、女性32名で構成され、平均年齢は62.84 ± 12.65歳であり、ACI・OSAS併存群は男性16名、女性54名で構成され、平均年齢は61.31 ± 1.25歳であった。ACI・OSAS併存群では、AHI、NIHSSスコア、およびCRP値が有意に高かった。一方で、年齢、性別、BMI、高血圧、DM、心疾患、脂質異常症、喫煙、飲酒、血栓溶解療法、およびTOASTの分布については、両群間で同等であった。
OSAS重症度サブグループ間におけるmiR-486-3pおよび炎症マーカーの変化
OSASの重症度と分子変化との用量依存的な関係を評価するため、ACIおよびOSASを伴う170人の患者を、AHI基準に基づき軽症（5 ≤ AHI < 15, n = 60）、中等症（15 ≤ AHI < 30, n = 75）、重症（AHI ≥ 30, n = 35）のサブグループに層別化した。図1A–Cに示されるように、4つのグループ（ACI、軽症、中等症、重症OSAS）全体で明確な段階的パターンが観察された。具体的には、miR-486-3pの発現は、ACI群から重症OSASサブグループにかけて漸次的に減少した（図1A, P < 0.01 vs. ACI群）。対照的に、血清TNF-αおよびCRPレベルは、OSASの重症度に伴い段階的に上昇した（図1B,C, P < 0.01 vs. ACI群）。これらの結果は、OSASによる低酸素負荷が、miR-486-3pの段階的な抑制およびそれに並行した全身性炎症の増強に関連していることを示している。
ACI患者におけるOSASに対するmiR-486-3pの診断的価値
miR-486-3pは、ACIに合併したOSASにおいて重要な診断的価値を持つ可能性があり、AUCは0.927（最適カットオフ値は0.845）、感度および特異度は92.94%および79.0%であった（Figure 1D）。診断モデルの堅牢性を評価し、潜在的な過学習を排除するために、miR-486-3pのROC解析について5分割交差検証を実施した。Supplementary Table 1に示すように、5つのフォールドにおける平均AUCは0.928（範囲：0.847〜0.969）であり、これは元の解析で得られた見かけ上のAUC 0.927と非常に一致していた。平均感度および特異度は、それぞれ8.83%および87.0%であった。
ACI合併OSASにおけるmiR-486-3pと脳卒中重症度および炎症性マーカーとの相関
ACI合併OSAS群において、Spearman相関分析を行った結果、miR-486-3pの発現量はNIHSSスコア（図2A）、TNF-α（図2B）、およびCRP（図2C）と有意に負の相関があることが明らかになった。
予後良好群および予後不良群における予後指標
ACIにOSASを合併した患者を、mRSスコアに基づき予後良好群と予後不良群に分けた。表2に示す通り、予後不良群ではmRSスコア、SAQLIスコア、ESSスコア、HIF-1α、およびTNF-αが上昇していた。
ACIおよびOSAS合併患者における1年後予後に対するmiR-486-3pの予後予測価値
Kaplan-Meier曲線の結果から、miR-486-3pの高発現は良好な予後と関連し、低発現は不良な予後と関連していることが示された（Figure 2D）。単変量解析では、miR-486-3pの発現量およびNIHSSスコアが臨床転帰と関連していた。その他の変数であるSAQLIスコア（P = 0.078）、HIF-1α（P = 0.086）、TNF-α（P = 0.072）、年齢（P = 0.082）、DM（P = 0.067）、心疾患（P = 0.065）、およびAHI（P = 0.069）は、予後と境界域の有意な関連を示し、これらも多変量Cox解析に組み込まれた。多変量解析において、miR-486-3pは独立した保護因子であり続け（HR = 0.437, 95% CI: 0.278–0.684, P < 0.001）、一方で心疾患（HR = 1.82, 95% CI: 1.070–3.104, P = 0.027）およびNIHSSスコア（HR = 1.597, 95% CI: 1.08–2.529, P = 0.046）が不良な臨床転帰の独立したリスク因子として抽出された（Table 3）。
知見のまとめ
要約すると、本研究により、OSASを合併したACI患者においてmiR‑486‑3pが有意にダウンレギュレートされており、この集団におけるOSASの同定に対して高い診断精度を示すことが実証されました。OSASの重症度サブグループ間で明確な用量依存的関係が観察され、軽症から重症のOSASに向かうにつれて、miR‑486‑3pは漸次的に減少し、炎症マーカー（TNF‑αおよびCRP）は段階的に増加しました。相関分析により、miR‑486‑3pが脳卒中の重症度（NIHSS）および全身性炎症の両方と負の相関があることがさらに確認されました。重要な点として、miR‑486‑3pの低発現は1年後の機能的予後不良を予測し、多変量Cox回帰分析では、NIHSSやAHIなどの潜在的な交絡因子で調整後も、miR‑486‑3pが独立した保護因子であることが特定されました。総合すると、これらの知見は、miR‑486‑3pが全身性炎症における調節的役割を通じて、ACI-OSAS合併症の新たな診断および予後バイオマーカーとして機能し得るという仮説を支持しています。
データの可用性：
本研究の結果を裏付ける生データは補完ファイル 1で入手可能であり、これには登録されたすべての患者のベースライン特性、miR‑486‑3p 発現レベル、ELISA 測定値、および 1 年間の mRS フォローアップデータが含まれています。
図1ACI合併OSAS重症度サブグループにおけるmiR-486-3pおよび炎症マーカーの変化と、OSASに対するmiR-486-3pの診断能. (A) ACI群およびACI・OSAS合併群におけるmiR-486-3pの相対的発現量。 (B) 血清TNF-α濃度の統合結果。 (C) ACI群における血清CRP濃度（AHI < 5、n=10) および軽症（5 ≤ AHI < 15、n=60）、中等度（15 ≤ AHI < 30、n=75) および重症 (AHI ≥ 30, n=35) のOSASサブグループ。 (DOSASを合併するACI患者と合併しない患者を識別するためのmiR-486-3pのROC曲線。***P < 0.001. この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2miR-486-3pと脳卒中の重症度および炎症性マーカーとの相関、ならびに1年後の転帰に対する予後予測価値. (A–C) miR-486-3pの発現量とNIHSSスコア、TNF-αおよびCRPとの相関に関するスピアマン相関分析。 (DmiR-486-3p発現量の中央値で層別化した、1年後フォローアップ時における良好な予後確率のカプラン・マイヤー生存曲線。***P < 0.001. この図の拡大表示をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 変数 | ACI (n=10) | ACIおよびOSAS（n=170） | P値 | |
| 年齢（歳） | 62.84 ± 12.65 | 61.31 ± 11.25 | 0.303 | |
| 性別（オス/メス） | 68/32 | 116/54 | 0.968 | |
| BMI (kg/m²2) | 24.74 ± 3.57 | 25.02 ± 3.47 | 0.531 | |
| 高血圧、n (%) | 74 (74%) | 134 (78.82%) | 0.365 | |
| 糖尿病、n (%) | 22 (22%) | 43 (25.29%) | 0.543 | |
| 心疾患, n (%) | 13 (13%) | 25 (14.71%) | 0.698 | |
| AHI（回/時） | 2.07 ± 1.42 | 19.95 ± 9.19 | < 0.001*** | |
| NIHSSスコア | 1.70 ± 1.18 | 4.05 ± 1.73 | < 0.001*** | |
| CRP (ng/mL) | 2.03 ± 0.17 | 3.01 ± 0.27 | < 0.001*** | |
| ACIグレード（軽度/中等度） | 99/1 | 69/101 | < 0.001*** | |
| 脂質異常症（あり／なし） | 52/48 | 96/74 | 0.478 | |
| 喫煙（あり／なし） | 48/52 | 91/79 | 0.382 | |
| 飲酒（はい/いいえ） | 40/60 | 87/83 | 0.076 | |
| 血栓溶解療法（あり/なし） | 38/62 | 81/89 | 0.124 | |
| TOAST | 0.487 | |||
| 心原性塞栓症 (n) | 22 | 36 | ||
| 小血管閉塞 (n) | 18 | 28 | ||
| 大動脈アテローム性動脈硬化症（n） | 13 | 25 | ||
| 原因不明の脳卒中 (n) | 5 | 19 | ||
| その他の特定された病因による脳卒中 (n) | 42 | 62 | ||
表1：OSASを合併するACI患者と合併しないACI患者のベースライン特性データは、連続変数については平均値 ± 標準偏差（SD）、カテゴリ変数については件数（％）として的に示した。 P 値は独立した手法を用いて算出された t検定 連続変数にはt検定を、カテゴリー変数にはカイ二乗検定を用いた。ACI：急性脳梗塞、OSAS：閉塞性睡眠無呼吸症候群、BMI：ボディマス指数、DM：糖尿病、AHI：無呼吸低呼吸指数、NIHSS：米国国立衛生研究所脳卒中スケール、CRP：C反応性蛋白、TOAST：急性期脳卒中治療におけるOrg 10172試験。
| 変数 | 良好な予後 (n=97) | 予後不良（n=73） | p値 |
| mRSスコア | 0.88 ± 0.84 | 4.55 ± 1.08 | < 0.001*** |
| SAQILスコア | 2.59 ± 1.17 | 3.12 ± 1.48 | 0.009** |
| ESSスコア | 8.69 ± 2.76 | 10.05 ± 2.79 | 0.002** |
| HIF-1α (pg/mL) | 1159.94 ± 277.86 | 1283.88 ± 445.15 | 0.027* |
| TNF-α (pg/mL) | 121.4 ± 12.87 | 128.4 ± 11.67 | < 0.001*** |
表2：OSASを併発したACI患者における予後良好群および予後不良群の予後指標。1年後のmRSスコアに基づき、患者を予後良好群（mRS 0–2, n = 97）と予後不良群（mRS 3–6, n = 73）に分けた。データは平均値 ± SDで示す。P値は独立t-testを用いて算出した。mRS：modified Rankin Scale、SAQLI：Calgary Sleep Apnea Quality of Life Index、ESS：Epworth Sleepiness Scale、HIF‑1α：hypoxia‑inducible factor‑1α、TNF‑α：tumor necrosis factor‑α。
| 変数 | HR | 単変量 95%CI | P | HR | 多変量 95%CI | P | ||
| 下限 | 上限 | 下限 | 上限 | |||||
| miR-486-3p | 0.42 | 0.28 | 0.679 | <0.01 | 0.437 | 0.278 | 0.684 | <0.01 |
| SAQLIスコア | 0.628 | 0.375 | 1.053 | 0.078 | 0.713 | 0.416 | 1.2 | 0.217 |
| ESSスコア | 0.92 | 0.595 | 1.429 | 0.718 | ||||
| HIF-1α | 0.694 | 0.457 | 1.053 | 0.086 | 0.802 | 0.523 | 1.229 | 0.31 |
| TNF-α | 1.469 | 0.96 | 2.23 | 0.072 | 1.494 | 0.978 | 2.284 | 0.063 |
| 年齢 | 1.45 | 0.95 | 2.18 | 0.082 | 1.29 | 0.845 | 1.97 | 0.238 |
| 性別 | 0.829 | 0.534 | 1.285 | 0.401 | ||||
| BMI | 1.196 | 0.786 | 1.821 | 0.402 | ||||
| 高血圧 | 0.754 | 0.465 | 1.22 | 0.252 | ||||
| DM | 1.512 | 0.972 | 2.351 | 0.067 | 1.246 | 0.79 | 1.965 | 0.343 |
| 心疾患 | 1.61 | 0.971 | 2.673 | 0.065 | 1.82 | 1.07 | 3.104 | 0.027 |
| AHI | 1.468 | 0.97 | 2.2 | 0.069 | 1.125 | 0.734 | 1.725 | 0.58 |
| NIHSSスコア | 1.58 | 1.027 | 2.45 | 0.037 | 1.597 | 1.08 | 2.529 | 0.046 |
| 脂質異常症 | 1.178 | 0.76 | 1.78 | 0.42 | ||||
| 喫煙 | 0.895 | 0.593 | 1.35 | 0.596 | ||||
| 飲酒 | 1.16 | 0.738 | 1.689 | 0.603 | ||||
| 血栓溶解療法 | 1.259 | 0.834 | 1.902 | 0.272 | ||||
表3：OSASを伴うACI患者における1年後の予後不良に関する単変量および多変量Cox回帰分析。HR：ハザード比、CI：信頼区間、SAQLI：カルガリー睡眠時無呼吸症候群QOL指標、ESS：エプワース眠気尺度、HIF‑1α：低酸素誘導性因子‑1α、TNF‑α：腫瘍壊死因子‑α、BMI：体格指数、DM：糖尿病、AHI：無呼吸低呼吸指数、NIHSS：米国国立衛生研究所脳卒中スケール。単変量分析でP < 0.1であった変数を多変量Coxモデルに投入した。
補足図 1：患者の選定およびサブグループ層別化のフローチャート。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
付録表1：miR-486-3pの診断的価値を内部検証するための5分割交差検証。AUC：曲線下面積、CI：信頼区間。平均AUC、感度、および特異度は、5つのフォールド全体の算術平均として算出された。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
補足ファイル 1：本研究の結果を裏付ける生データ。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
OSAS患者は、気道の虚脱と閉塞を繰り返し起こし、それによって間欠的低酸素血症（IH）と日中の過剰な眠気（EDS）が生じ、これが神経細胞の損傷を引き起こす可能性がある。14OSAはACI後の患者に非常に多く見られ、約72%の患者に影響を及ぼし、心血管リスクを有意に悪化させます。15ACI（急性脳梗塞）は、血流不全に起因する局所的な脳虚血および低酸素状態から生じる、一連の神経学的欠損を構成している。16OSAS（閉塞性睡眠時無呼吸症候群）の病理の中心である間欠的低酸素症は、ACI（急性脳梗塞）による虚血性損傷と相乗的に作用し、脳損傷を増幅させる可能性が高い。それにもかかわらず、この高リスクな併存状態に特化した研究は不足している。蓄積されつつあるエビデンスは、miRNAがOSASとACIの両方の病態形成において重要な役割を果たしていることを示唆している。17,18miR-486-3pがOSASおよびACIに関連している可能性が以前に指摘されている。したがって、我々はOSASとACIを結びつける潜在的な分子的なリンクとしてmiR-486-3pを検討した。特筆すべき点として、本コホートはCOVID-19パンデミック期間に相当する2020年11月から2023年12月にかけて登録された。蓄積されたエビデンスは、SARS-CoV-2感染によって引き起こされる持続的な全身性炎症が、神経損傷を悪化させ、神経変性病変の進行を促進させる可能性を示唆している。19,20しかしながら、本研究はSARS-CoV-2/COVID-19感染に焦点を当てたものではなく、研究目的および設計はCOVID-19とは無関係である。ACIにOSASを合併した症例において血清miR-486-3pが有意に低下していたことが判明し、この共存疾患におけるmiR-486-3pの役割に関する初期の臨床的根拠が示されたとともに、さらなる研究の必要性が浮き彫りとなった。
NIHSSスコアにより、脳卒中の重症度を評価することができる11。ポリソムノグラフィーによるAHIは、一般的にOSASの診断に使用され、AHIスコアが高いほどOSASは重症である21。ポリソムノグラフィーに伴う臨床的およびロジスティクス上の課題を考慮すると、脳卒中患者における閉塞性睡眠時無呼吸症候群の簡便なバイオマーカーを同定することが極めて重要である22。今回の知見は、miR-486-3pのレベルがAHIおよびNIHSSスコアの両方と負の相関を示し、疾患の重症度を反映していることから、ACIに併発したOSASに対してmiR-486-3pが重要な診断的有用性を持つことを示唆している。
方法論的に、本研究は、単一のコホートにおいて分子プロファイリングと定量的臨床フェノタイピングを統合し、診断精度、用量反応関係、および予後価値を同時に評価することの実現可能性を実証しています。この統合的な枠組みは、複数の病態生理学的経路間の複雑な相互作用によって従来の単一エンドポイント解析が困難となることが多い、脳卒中関連併存疾患における将来のバイオマーカー探索研究のリファレンスとなる可能性があります。
IHはOSASの特徴であり、前炎症性シグナル伝達経路を活性化することで、炎症と組織損傷を誘発します23。極めて重要な点として、この炎症状態はACIの病態と交差し、それを悪化させます。ACIでは、虚血後の炎症が二次性脳損傷を媒介します24,25。TNF-αやCRPなどの主要な炎症性メディエーターは、低酸素誘発性および虚血誘発性の炎症カスケードの結節点に位置しており、両方の疾患において上昇しているため、ACIとOSAの併存病理における極めて重要な分子となります26,27,28。したがって、ACIにOSASを合併した患者におけるTNF-αおよびCRPの血清濃度を測定しました。本研究において、ACI合併OSASにおける血清miR-486-3pレベルとTNF-αおよびCRPレベルとの間に認められた負の相関は、このmiRNAと、この併存疾患に特徴的な全身性炎症状態との間に潜在的な関連があることを示唆しています。
OSASは生活の質に非常に悪影響を及ぼし、SAQLIはOSAに特化した生活の質に関する質問票である29。EDSはOSASの一般的な症状であり、EDSを伴うOSASはより多くの有害事象と不良な予後につながる30。日中の眠気の重症度を判定するには、一般的にESSが用いられる31。OSASにおいて、反復するIHのエピソードは血管疾患の独立したリスク因子と考えられている32。さらに、IHに起因する酸化ストレスは、骨粗鬆症、心血管リスクの増大、神経学的変化などの合併症を引き起こす可能性がある33。そのため、本研究ではHIF-1αの発現についても検討した。OSASを合併したACIの予後不良群においてHIF-1αの上昇が認められたことは、OSASにおける慢性間欠的低酸素症の病態生理と一致している。さらに、miR-486-3pおよびTNF-αがOSAS合併ACIの予後と相関しており、miR-486-3pの低値が不良な予後に関連していることが結果から示された。これは、IHによって誘導されたHIF-1αがmiR-486-3pを抑制し、それによってTNF-αなどの炎症性メディエーターの上方制御に寄与し、結果としてACIにおける脳損傷を悪化させるという潜在的なカスケードの存在を示唆している。
本研究には依然として限界がある。対照群（健康成人、OSASのみの群）が欠如しているため、miR-486-3pの正常範囲を定義することや、併存疾患に特異的な変化をOSAS単独による変化と区別することができない。したがって、miR-486-3pの発現プロファイルを完全に解明するためには、今後の研究でこれらの群を含める必要がある。さらに、相関関係のみに基づいてmiR-486-3pの特異的な調節メカニズムを推論することは不十分である。今後の実験において、その分子メカニズムをさらに検証する予定である。
トランスレーショナルな視点から見ると、miR‑486‑3pの高い診断精度と独立した予後予測能は、いくつかの潜在的な臨床応用を示唆しています。血液ベースのバイオマーカーとして、これを脳卒中のルーチン検査に組み込むことで、OSASを併発しているACI患者を特定し、ポリソムノグラフィーへの早期紹介とタイムリーな介入を促進できる可能性があります。急性期および亜急性期に miR‑486‑3p レベルをモニタリングすることで、炎症ダイナミクスを追跡し、予後リスクに基づいて患者を層別化し、個別化されたリハビリテーション戦略を可能にするかもしれません。これらのトランスレーショナルな方向性は、今後の前向き多施設共同研究によるさらなる調査が必要です。総じて、miR-486-3pは炎症因子を調節することでOSASを合併したACIに関与している可能性があり、OSASを合併したACIにおいて診断的および予後的価値を有しています。
開示事項
本研究は、「脳卒中予防および治療技術に関する研究」（No. WKZX2023CZ0143）の助成を受けたものです。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3.0T MRIスキャナー | Siemens Healthineers（ドイツ） | MAGNETOM Skyra | 急性脳梗塞確認のための脳画像診断 |
| 96ウェルELISAマイクロプレート | 深圳市新博盛生物科技有限公司（中国） | XBSプレート | ELISA検出のための抗原抗体反応 |
| 睡眠呼吸障害に関するAASM臨床診療ガイドライン | 米国睡眠医学会 | 2020年完全ガイドライン | 標準化されたAHI診断およびOSAS重症度層別化基準 |
| カルガリー睡眠時無呼吸症候群生活の質指標（SAQLI）中国語妥当性確認済み版 | カルガリー大学 | 2021年翻訳版 | ACIを合併したOSAS患者のクオリティ・オブ・ライフ評価 |
| EDTA-K2 5 mL 真空採血管 | BD Biosciences, USA | 367863 | 血清分離のための末梢静脈血採取 |
| エプワース眠気尺度（ESS）中国語妥当性確認済みバージョン | ジョンズ・ホプキンス大学 | 2018年改訂版 | 脳卒中患者における日中傾眠の評価 |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software, USA | バージョン 9.4.1 | 散布図、箱ひげ図、ROC曲線の視覚化 |
| ヒトCRP ELISAキット | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd.（中国、深圳） | XBS-H001 | 血清C反応性タンパク質の定量検出 |
| ヒトHIF-1α ELISAキット | 深圳市欣博盛生物科技有限公司（中国、深圳） | XBS-H007 | 血清中低酸素誘導因子-1の定量検出α |
| ヒトTNF-αα ELISAキット | 深圳市信博盛生物科技有限公司（中国、深圳） | XBS-H003 | 血清TNF-αの定量検出α 炎症因子 |
| IBM SPSS Statistics 23.0 | IBM、ニューヨーク州アーモンク、米国 | バージョン 23.0 | すべての統計解析（t検定、相関分析、ROC曲線、Kaplan-Meier解析–マイヤー・カプラン法、コックス回帰分析) |
| マイクロプレート分光光度計 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | Multiskan FC | 450 nmにおけるELISAプレートの吸光度測定 |
| miR-486-3p & U6 qPCRプライマー | Sangon Biotech（中国、上海） | カスタム合成 | qPCRのための標的遺伝子およびリファレンス遺伝子の増幅 |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen GmbH, Hilden, Germany | 218073 | miR-486-3pおよびU6のリアルタイム定量PCR増幅 |
| NIHストロークスケール（NIHSS）中国語妥当性確認済みバージョン | 米国国立神経疾患・脳卒中研究所 (NINDS) | 標準臨床版 | ACI患者におけるベースラインの神経学的重症度評価 |
| PSG睡眠スコアリングソフトウェア | BMC Medical Co., Ltd.（中国） | v3.2 | 睡眠呼吸イベントの自動予備スコアリング |
| QuantStudio 6 Pro リアルタイムPCRシステム | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | QuantStudio 6 Pro | RT-qPCR増幅、融解曲線解析、Ct値の記録 |
| QuantStudio リアルタイム PCR ソフトウェア | Applied Biosystems, USA | v1.7 | qPCR生データのエクスポート、Ct値解析 |
| 冷却ベンチトップ遠心機 | Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.（中国、湖南省） | TDZ5-WS | 全血からの血清分離 (2700 × g, 4 °C) |
| RevertAid RT逆転写キット | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1691 | 血清miRNAのcDNAへの逆転写 |
| RNaseフリー 1.5 mL マイクロ遠心チューブ | Axygen, USA | MCT-150-C | 分離した血清の分注および保存 |
| TRIzol RNA分離試薬 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15596026 | ヒト血清サンプルからの全RNA抽出 |
| 超低温冷凍庫 | Haier Biomedical、中国、山東省 | DW-86L388 | 血清サンプルの長期保存における −80 °C |
| YH-600B ポリソムノグラフィーモニター | BMC Medical Co., Ltd.（中国、北京） | YH-600B | OSAS診断のための夜間睡眠モニタリングおよびAHI算出 |
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