本プロトコルでは、ex vivoのEnterococcus faecalis根管モデルを用い、根管内消毒におけるダイオードレーザー、ツリウムレーザー、およびエルビウムレーザーを比較し、抗菌効果と根表面の温度を評価することで、安全かつ効果的な照射パラメータを特定します。
研究記事
根管内汚染除去のためのツリウム、エルビウム、およびダイオードレーザー：Enterococcus faecalisに対する抗菌活性とex vivoでの熱安全性
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2026年9月11日
この記事について
サマリー
要約
レーザー補助灌流は、根管消毒のための有望な補助的手段として登場していますが、標準化された実験条件下で異なるレーザーシステムを直接比較したエビデンスは依然として限られています。本ex vivo研究では、Enterococcus faecalisに対する根管内除染において、808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、および2940 nmエルビウムレーザーの抗菌効果と熱的安全性を比較しました。標準化された感染ヒト根管検体に対し、臨床的に適切な照射パラメータを用いて処理を行いました。抗菌効果は、コロニー形成単位（CFU）の減少および細菌増殖曲線の解析によって評価し、熱的安全性は、レーザー照射中の根外表面の温度変化を測定することで評価しました。3つのレーザーシステムすべてにおいて、生理食塩水で処理したコントロールよりも高い抗菌活性が示されました。エルビウムレーザーは、30 mJで30 s照射した際に、根外表面の温度上昇を許容される熱的安全しきい値の10°C未満に維持しつつ、最高の平均抑制率（9.0%）を達成しました。ツリウムレーザーは同等の抗菌活性を示しましたが、最高照射設定では熱的安全しきい値を超えました。ダイオードレーザーは、試験条件下において、ツリウムおよびエルビウムレーザーよりも抗菌効果が低く、温度上昇が大きいことが示されました。このex vivoモデルの限界内において、2940 nmエルビウムレーザーは抗菌効果と熱的安全性の間で最も良好なバランスを示し、根管内消毒のための有望な補助的アプローチであることが示唆されました。
概要
歯髄炎および根尖性歯周炎の主な原因は、根管系への細菌感染です1。ある研究によると、根管治療後の慢性または再発性感染患者において、Enterococcus faecalisが主要な分離菌として同定されています2,3。この細菌はバイオフィルム形成を含む多数の毒性因子を有しており、象牙細管内に最大800 µmの深さまで侵入し、栄養制限条件下でも生存することが可能です2,3。これらの特性により、根管治療で使用される標準的な根管内消毒剤や、生体本来の防御機構に対する耐性がもたらされます。したがって、根管系から残存するすべてのE. faecalisを除去できないことが、根管治療失敗の重大な原因となっています4。
現在の根管治療では、根管システムから微生物を除去するために、器具による機械的デブライドメントと化学的洗浄を組み合わせて行われます5。機械的な器具操作は細菌数を減少させるのに非常に有効ですが、複雑な根管形態の内部には、器具だけでは到達できない領域が多く残されています5。そのため、根管システムの消毒において化学的洗浄剤が重要な役割を果たします。しかし、いかに強力な化学薬剤であっても、細菌バイオフィルムを完全に除去することはできないことが研究で示されています6。さらに、歯内療法で使用される一部の化学薬剤は、象牙質の構造的完全性を損なう可能性があります6,7。消毒効率を向上させ、根管システムから細菌バイオフィルムをより完全に除去するために、化学的洗浄剤を活性化させるいくつかの手法が検討されてきました。その中でも、レーザー活性化洗浄は、より有望な代替案の一つとして登場しました8。また、ダイオード、ツリウム、エルビウムレーザーについても、細菌の細胞壁やバイオフィルムを破壊しうる光熱効果および光機械的効果を誘発する可能性が評価されています9。
これらの各レーザータイプと、それらが相互作用する組織との間の相互作用は、波長によって大きく異なります。通常 808 から 980 nm の範囲の波長で光を放出するダイオードレーザーは、生体組織内の発色団に吸収され、タンパク質の変性と細菌の死滅を伴う光熱反応を引き起こします10。ツリウムレーザーは 1940 nm で動作し、水による高い吸収を示します。したがって、ツリウムレーザーは、洗浄液で満たされた根管を含む湿潤環境に適していることが示されています1。高い水吸収率のため、ツリウムレーザーを洗浄済みの根管に使用すると、液体を急速に加熱し蒸発させることができます。この蒸発によって衝撃波が発生し、細菌バイオフィルムの破壊を助ける可能性があります。エルビウムレーザー、特に 2940 nm で動作するものは、歯科用レーザーの中で水に対する吸収係数が最も高くなります12。洗浄済みの根管において、この特性は爆発的な蒸発と衝撃波を発生させ、周囲の象牙質への熱伝達を抑制しつつ、細菌を機械的に剥離させ死滅させることができます13。
根管治療におけるレーザー技術への関心は高まり続けていますが、異なるレーザーシステムにおける最適な臨床パラメータについては、依然として不明な点が多く残されています。現在の臨床的な使用方法は、通常、経験則やメーカー推奨のガイドラインに基づいており、根拠に基づいた裏付けは限定的です14。さらに、これまでの研究のほとんどはレーザーの抗菌効果を評価したものであり、レーザー治療の重要な側面である歯周組織への熱損傷のリスクについては、比較的注目されてきませんでした。一般的に、外根面の温度が10°C以上上昇すると、歯根膜や周囲の骨に永続的な損傷が生じる可能性があるとされています15。管理された実験条件下で、抗菌有効性と熱的安全性の両方を体系的に評価し、異なるレーザーシステムを直接的に比較した報告は見当たりません。
このex vivo研究の主な目的は、根管壁からE. faecalisバイオフィルムを除去するための3つのレーザーシステム（808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、2940 nmエルビウムレーザー）の抗菌有効性と熱的安全性を調査し、比較することでした。熱的安全性を維持しつつ効果的な細菌除去を実現するパラメータの組み合わせを特定するため、本研究では臨床的に関連のある照射パラメータを評価しました。これらの知見が、臨床医が根管消毒のための安全で効果的なレーザー補助的アプローチを選択するのに役立つことが期待されます。
プロトコル
本研究は、同済大学医学院附属上海市第四人民病院の倫理基準に従って実施され、施設審査委員会（承認番号 2026013-01）の承認を得た。本研究に使用した抜去人歯は、矯正歯科的または歯周病的な理由で抜歯を受けた患者から収集した。検体採取前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本研究の目的で、追加の臨床的介入は行わなかった。本研究は、抜去人歯の使用に関する施設要件に従って実施された。
検体の準備および選択基準
上海第四人民病院の同済大学附属口腔科より、最近抜去された単根の永久歯（下顎切歯および小臼歯）計141本を提供してもらった。すべての歯は、矯正歯科的または歯周病的な理由により抜去されたものである。各患者からインフォームドコンセントを得た。本研究の組み入れ基準は、歯周プローブで測定して根長が10 mm以上であること、う蝕や亀裂のない健全歯であること、根形成が完了していること、およびSchneider法による根管湾曲度が10度未満であることとした。除外基準は、多根管、根管石灰化、内部吸収、または過去に根管治療を受けたことがある歯とした。抜去後、歯周スケーラーを用いて、可視的な歯石および軟組織の残渣をすべて除去した。その後、脱水を防ぐため、歯は0.9%生理食塩水中で4°Cで保存し、すべての実験は抜去から3ヶ月以内に行った。検体は、あらかじめ定義された交互割り付けシーケンスを用いて実験群に割り当てた。具体的には、各群の必要サンプル数に達するまで、検体を各群に順次交互に割り付けた。正式なa prioriパワー計算は行わなかった。サンプルサイズは、過去の同等のex vivo研究、評価した照射パラメータの組み合わせ数、および適格な抜去歯の入手可能性に基づいて決定した。
根管の形成および滅菌
各歯冠を、連続水冷下で低速ダイヤモンドソーを用いてセメントエナメル接合部で除去し、標準的な10 mmの根端セグメントを得た。作動長は、サイズ10のKファイルを用い、根尖孔から1 mm短い位置に決定した。根管形成には、製造元の指示に従いProTaper Universalニッケルチタン回転式システムを使用し、根尖部の形成サイズがF3に達するまで、S1、S2、F1、F2、F3の順に用いた。器具操作の間、回転式ファイルを1本使用するごとに約2 mLの5.25%次亜塩素酸ナトリウムで根管を洗浄し、1根管あたりの総洗浄量は約10 mLとした。最終すすぎとして、17% EDTA 5 mLで1分間洗浄した後、滅菌生理食塩水 5 mLで洗浄した。根管系を閉鎖系にするため、根尖孔をフローティングレジンコンポジットで封鎖した。形成後の歯根を121°Cで20分間オートクレーブ滅菌し、4°Cの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に保存し、滅菌後24時間以内に細菌を接種した。
細菌株および培養条件
感染根管モデルの作製には、E. faecalis ATCC 29212を使用した。本菌株をBHI（brain heart infusion）寒天培地を用い、好気的条件下の37°Cで24時間培養した。単一コロニーをBHIブロスに接種し、37°Cで18～24時間インキュベートした。細菌懸濁液は、60 nmにおける吸光度（OD60）値が0.08～0.10となるよう調整し、0.5 McFarland標準に相当する約1.5 × 108 CFU/mLとした。
〜の確立 *E. faecalis* 感染根管モデル
感染根管バイオフィルムモデルを構築するため、セメント質からの細菌浸入を防ぐ目的で、滅菌済み根管の外面に透明なネイルポリッシュを2層塗布した。根尖孔をフローティングレジンコンポジットで封鎖した後、根尖部をコーティングし、細菌を接種できるよう根管口は未コーティングのままにした。滅菌済みのマイクロピペットを用いて、 10 µL の *E. faecalis* 懸濁液を個々の根管に注入し、液が溢れないように根管の全長を満たした。その後、接種した試料を滅菌済みの24ウェル培養プレートに個別に配置し、各ウェルにBHIブロス1.5 mLを加えた。試料を以下の条件で培養した。 37°C 好気条件下で21日間培養した。細菌の継続的な増殖に必要な栄養分を供給し、蓄積した細胞残渣を除去するため、2日ごとに培地を除去し、新鮮な滅菌済みBHIブイヨンに交換した。培地交換時にE. faecalisを追加的に接種することは行わなかった。培養期間の終了後、実験的評価に先立ち、緩く付着したプランクトン状細菌を除去するため、すべての生存サンプルをPBSで1回洗浄した。成熟したバイオフィルムの形成および象牙細管への細菌浸透を走査電子顕微鏡（SEM）で可視化するため、ランダムに選択した2つのサンプルを使用した。検体は2.5%グルタラールデヒドで固定し、 4°C 24時間おき、PBSで3回洗浄し、段階的なエタノール系列（30%、50%、70%、80%、90%、10%）を用いて脱水した（各工程10分間）。その後、縦方向に分割して風乾させ、アルミニウムスタブに固定し、金でスパッタコーティングを施した後、SEMにより観察した。
実験群およびレーザー照射プロトコル
感染した135個の根サンプルを、使用するレーザーシステムに基づいて、808 nmダイオードレーザー群、1940 nmツリウムレーザー群、2940 nmエルビウムレーザー群の3つの主要な実験群に分けた。各レーザー群には45個のサンプルがあり、それぞれを照射パラメータに従ってさらに細分化した。ダイオードレーザーは、平均出力1.0、1.5、または2.0 Wで動作させ、各出力設定を10、20、または30 sの間適用した。これにより、1サブグループにつき3サンプルとする9つのサブグループを設けた。ツリウムレーザーは、平均出力1.5、2.5、または3.5 Wで動作させ、各出力設定を10、20、または30 sの間適用し、同様に1サブグループにつき3サンプルとする9つのサブグループを設けた。エルビウムレーザーは、15 Hzの固定周波数で超短パルスモードで動作させた。パルスエネルギー10、20、または30 mJを10、20、または30 sの間適用し、1サブグループにつき3サンプルとする9つのサブグループを設けた。808 nmダイオードレーザーと1940 nmツリウムレーザーは、ともに連続波モードで動作させた。
合計で6つの追加サンプルを加え、陰性対照群と陽性対照群にそれぞれ3サンプルずつ割り当てた。陰性対照群には滅菌生理食塩水を投与し、陽性対照群には5.25%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）で30 s処理した。
レーザー群に対しては、標準化された照射プロトコルに従った。光ファイバーを作業長まで根管内に挿入し、照射期間中、根尖から根冠方向へゆっくりと連続的にらせん状に動かした。単一の交換可能なファイバーではなく、レーザー専用のデリバリーファイバーまたはチップを使用した。808 nmダイオードレーザーは20 µmのエンドファイアリングファイバー、1940 nmツリウムレーザーは200 µmのエンドファイアリングファイバー、2940 nmエルビウムレーザーは40 µmのラジアルファイアリングチップを用いて照射した。デリバリーファイバーまたはチップは、約1 mm/sの速度で後退させた。根管口に達した後、再び作業長まで戻し、割り当てられた照射時間が完了するまで根尖から根冠へのらせん状の動きを繰り返した。
ツリウムレーザーおよびエルビウムレーザーでは、水支援によるレーザー活性化をシミュレートするため、照射中に根管内を滅菌生理食塩水で満たした状態に維持した。照射前に、根管口のレベルまで満たすように、各根管に約 10 µL の滅菌生理食塩水を注入した。治療全体を通して根管内を液体で満たした状態に保つため、必要に応じて各照射サイクルの前に生理食塩水を補充した。ダイオードレーザー群では、808 nm ダイオードレーザーは水への吸収率が比較的低く、根管内で直接的な光熱殺菌効果を及ぼすために使用するため、照射前に滅菌ペーパーポイントで根管内を乾燥させた。対照的に、1940 nm ツリウムレーザーおよび 2940 nm エルビウムレーザーは水への吸収率が大幅に高く、水介在性の光熱効果および光機械的効果を促進させるため、生理食塩水で満たした根管に適用した。レーザー治療は、3日間連続して1日1回繰り返した。
根表面外側の温度測定
レーザー照射の初日に、根表面外側のリアルタイムな温度変化を測定した。各根標本を室温（2°C ± 1°C）でレトルトスタンドに垂直に固定した。デジタル温度計に接続したK型熱電対を、根の長軸に対して垂直に、根表面外側の中央3分の1の領域にしっかりと接触させた。熱電対プローブは調節可能なクランプを用いて配置し、測定期間中に確実かつ一定の接触を維持するため、耐熱性粘着テープで根表面に固定した。熱電対プローブは、沸騰水（10°C）と氷水混合液（0°C）を用いて、各測定セッションの前に校正した。照射期間（10、20、または30 s）を通じて、50 ms間隔で温度を記録した。各標本について、ベースライン温度およびレーザー照射中または直後に記録された最高温度の両方を測定した。ベースラインからピーク温度までの温度上昇をΔTとして算出した。ΔTが10°Cを超えた場合を、歯周組織への潜在的な損傷の閾値とした。
微生物学的評価：コロニー計数および抑制率
レーザー処理の抗菌効果を判定するため、各レーザー処理後にサンプルを回収した。根管内は滅菌済みのペーパーポイントで乾燥させた。サンプルの相互汚染を防ぐため、各検体に対して新しい滅菌済みサイズ40のヘドストロームファイルを用い、根管壁から象牙質チップを採取した。各象牙質チップを、1 mLの滅菌PBSを含む個別のマイクロ遠心チューブに移した。チューブを30 sの間激しくボルテックスし、象牙質チップから細菌を遊離させた。各希釈段階で、細菌懸濁液10 µLを90 µLの滅菌PBSに移すことで、10−1から10−6までの10倍段階希釈系列を調製した。各希釈液のアリコート（30 µL）を個別のBHI寒天培地に塗布し、37°Cで24 h培養した。コロニーを計数し、コロニー形成単位（CFU）として記録した。各希釈液を3枚のプレートに播種し、3枚のプレートから得られた平均コロニー数を分析に使用した。プレートは計数前にコード化され、コロニー計数を行う研究者は処理条件を伏せられた状態で作業を行った。
ここで、Cは陰性対照（生理食塩水）群の平均CFU数であり、Tは実験群の平均CFU数である。
細菌増殖曲線の解析
さまざまなレーザー処理が細菌の増殖速度に及ぼす影響を、増殖曲線をプロットすることで調査した。最終レーザー処理から3日後、根管内を5 mLの滅菌生理食塩水で洗浄した。根管内の内容物を滅菌ペーパーポイントで回収し、5 mLのBHIブロスを含む遠心チューブに移した。チューブをボルテックスし、細菌をブロス中に懸濁させた。細菌懸濁液を1 × 106 CFU/mLに調整した。細菌濃度は、あらかじめ作成したE. faecalis ATCC 29212の検量線を用いたOD60測定に基づいて調整し、その後、生菌数測定により確認した。懸濁液の分注量20 µLを、滅菌済み96ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。さらに、蒸発を最小限に抑えるため、各ウェルに20 µLの滅菌ミネラルオイルを添加した。マイクロプレートを37°Cに維持された分光度計付きインキュベーターに設置し、OD60を24時間にわたり1時間ごとに測定した。各OD60測定の前に、細菌懸濁液を均質にするため、マイクロプレートを約30 rpmで10秒間オービタルシェーキングした。各サンプルは5つの複製ウェルで試験した。
統計解析
すべての数値データは平均値 ± 標準偏差 (SD) で表示しています。統計解析にはSPSS Version 26.0を使用しました。データの分布はShapiro–Wilk検定を用いて評価しました。3群以上の比較には分散分析 (ANOVA) を行い、続いてペアごとの比較にTukeyの正直有意差 (HSD) 検定を用いました。2群間の比較には独立標本 t検定を行いました。パラメトリック検定を適用する前に、Levene検定を用いて分散の均一性を評価しました。分散の均一性の仮定が満たされない場合は、適宜Welchの補正を適用しました。統計的有意性は P < 0.05 と定義しました。グラフの作成にはGraphPad Prism Version 9.0を使用しました。
結果
E. faecalisに対する異なるレーザー処置の抗菌活性
3種類のレーザーシステムによるE. faecalisへの抗菌有効性を、3回連続の処置後のCFU数で評価した。結果を図1および補足図1に示す。滅菌生理食塩水の陰性対照群では大幅な細菌増殖が認められ、コロニー数の平均グレー値は396618.7 ± 6787.5であった。5.25% NaOClの陽性対照群では、全体の平均抑制率が47.2% ± 3.0%となり、個別の抑制値は46.8%、43.1%、および51.7%であった。
図1～に対するレーザー治療の抗菌有効性 Enterococcus faecalis. 異なる照射パラメータを用いた808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、および2940 nmエルビウムレーザーシステムによる3日間連続処置後の細菌抑制率。陽性対照として5.25%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）を、陰性対照として抑制率0%の滅菌生理食塩水を用いた。データは、処置群あたりn = 3の独立したサンプルからの平均値 ± 標準偏差（SD）で示す。エラーバーはSDを表す。*は P < 0.05、**は〜を示す P < 0.01、***は～を示す P < 0.001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
すべてのレーザー処理群において、5.25% NaOCl陽性対照群よりも高い抑制率が示されました。レーザー出力またはパルスエネルギーの増加、および照射時間の延長に伴い、抗菌活性の向上が観察されました。例えば、808 nmダイオードレーザー群では、平均抑制率が1.0 Wで10 s照射した際の53.1% ± 6.5%から、2.0 Wで30 s照射した際の80.2% ± 2.6%へと上昇しました。1.0 Wで30 s照射した群と2.0 Wで30 s照射した群の間には、統計的に有意な差が認められました（P < 0.01）。
ほとんどの試験条件下において、1940 nmのツリウムレーザーはダイオードレーザーよりも高い抗菌活性を示した。1.5 Wで10秒間照射した場合、平均抑制率は78.8% ± 1.9%であった。2.5 Wで30秒間照射すると、抑制率は91.6% ± 0.4%に上昇した。ツリウムレーザー群における最高の抑制率は3.5 Wで30秒間照射した時に観察され、97.4% ± 0.8%に達した。この値は、5.25% NaOClの陽性対照群（P < 0.01）および2.0 Wで30秒間照射した808 nmダイオードレーザー（P < 0.01）よりも有意に高かった。
3つのレーザーシステムの中で、2940 nm Er:YAGレーザーが最も高い抗菌活性を示しました。10 mJで10秒間照射した際の平均抑制率は84.3% ± 1.5%に達しました。20 mJで30秒間照射した際の抑制率は96.5% ± 2.0%でした。最高の抑制率は30 mJで30秒間照射した時に観察され、9.0% ± 0.6%に達しました。この値は、陽性対照群である5.25% NaOCl (P < 0.01)、2.5 Wで30秒間照射した1940 nm ツリウムレーザー (P < 0.01)、およびすべての808 nm ダイオードレーザー処理群 (P < 0.01) よりも有意に高い値でした。
結果は、3つのレーザーシステムすべてがE. faecalisに対して抗菌活性を示し、一般に照射パラメータが高くなるほど抑制率も高くなることを示しています。試験した条件の中では、2940 nm Er:YAGレーザーが最も高い抗菌抑制効果を達成し、次いで1940 nm ツリウムレーザー、808 nm ダイオードレーザーの順となりました。これにより、試験した実験条件下において、レーザー支援による根管内消毒が細菌負荷を効果的に減少させることができるという研究仮説が支持されました。
レーザー処理が細菌の増殖速度論に及ぼす影響
処理後の細菌の再増殖は、24時間にわたってOD60を測定することで評価した。結果を図2および付随図2に示す。滅菌生理食塩水コントロール群では、約4時間の誘導期に続き、4時間から12時間の間で急速な対数増殖期が見られ、その後、最大OD60値が1.167から1.245の範囲となる定常期に達するという、典型的な細菌増殖パターンを示した。
図2〜の増殖曲線 Enterococcus faecalis レーザー治療後。 の増殖速度論 Enterococcus faecalis 治療後の根管から24時間にわたって回収され、60 nmにおける吸光度（OD60）として測定された600）。滅菌生理食塩水コントロール、5.25%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）コントロール、および選択した808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、2940 nmエルビウムレーザー治療群の代表的な増殖曲線を Figure に示す。データはn = 3の独立したサンプルからの平均値 ± 標準偏差（SD）として提示されており、1サンプルあたり5つのテクニカルレプリケートウェルを用いている。エラーバーはSDを表す。*は P < 0.05、**は〜を示す P < 0.01、および***は～を示す P < 0.001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
808 nmダイオードレーザー群では、パラメータに依存した細菌増殖の抑制が認められました。1.0 Wで10秒間照射した場合、増殖曲線は5.25% NaOCl群と同様であり、約8時間後から指数増殖が始まりました。2.0 Wで30秒間照射した場合、誘導期は約10時間まで延長され、14時間後のOD60値は5.25% NaOCl群よりも有意に低い値を示しました（0.59 ± 0.042 vs. 0.934 ± 0.042, P < 0.01）。
1940 nm ツリウムレーザー群は、ダイオードレーザー群よりも高い細菌増殖抑制能を示した。1.5 Wで10秒間照射した場合、指数増殖は約10時間後に開始した。2.5 Wで30秒間照射した場合、誘導期は約1時間まで延長し、対応する時点におけるOD60値は、滅菌生理食塩水コントロールおよび808 nmダイオードレーザー（2.0 Wで30秒間）の両方よりも有意に低かった（いずれも P < 0.01）。3.5 Wで30秒間照射した場合、細菌の増殖は著しく抑制され続け、OD60値は12時間後から約0.15以下となり、その後もほぼ変化しなかった。
2940 nm Er:YAGレーザー群において、細菌の再増殖が最も強く抑制されました。10 mJで10秒間の照射を行った場合、処理後約10時間まで細菌増殖の指数関数的な増加は見られませんでした。パルスエネルギーを増加させると、指数関数的増殖の開始がさらに遅延しました。30 mJで30秒間の照射を行った場合、指数関数的増殖は約12時間まで遅延し、その間の平均OD60は0.20未満に維持されました。12時間後のOD600値は、30 mJで30秒間処理した2940 nm Er:YAGレーザー群の方が、2.0 Wで30秒間処理した808 nmダイオードレーザー群よりも有意に低い値を示しました（0.120 ± 0.01 vs. 0.274 ± 0.04, P < 0.01）。
全体として、3つのレーザーシステムすべてにおいて、対照群と比較して細菌の再増殖が抑制され、照射パラメータの増加に伴い抑制効果が次第に強まることが観察されました。試験条件下では、2940 nm エルビウムレーザーが細菌再増殖に対して最大の抑制効果を示し、次いで 1940 nm ツリウムレーザー、808 nm ダイオードレーザーの順となり、本研究の仮説が支持されました。
根面外部における異なるレーザー処置の熱的安全性の評価
抗菌活性に加えて、根面外部の温度上昇（ΔT）を測定することで、3つのレーザーシステムの熱的安全性を評価した。10°Cを超える温度上昇を、潜在的な歯周組織損傷の閾値とした。結果を図3に示す。
図3レーザー照射中の根表面の外気温変化。 異なる照射パラメータを用いた808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、および2940 nmエルビウムレーザーシステムによる照射後の根表面温度の変化（ΔT）。破線の水平線は、 10°C 潜在的な歯周組織損傷に関連して一般的に想定される閾値。データはn = 3の独立したサンプルからの平均値 ± 標準偏差（SD）として提示されている。エラーバーはSDを示す。*は以下を示す。 P < 0.05、**は～を示す P < 0.01、および***は、 P < 0.001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
808 nmダイオードレーザーが、根の外表面温度において最大の温度上昇を示した。1.0 Wで10秒間照射した場合、平均温度上昇（ΔT）は6.0°C ± 0.7°Cであった。出力を同じに維持して照射時間を30秒に延長すると、平均ΔTは10.4°C ± 0.9°Cまで上昇した。2.0 Wで30秒間照射した場合、平均ΔTはさらに14.8°C ± 3.8°Cまで上昇し、すべてのサンプルで10°Cの安全閾値を超えた。
1940 nmのツリウムレーザーにより、緩やかな温度上昇が認められた。1.5 Wで10 s照射した際の平均ΔTは2.5°C ± 0.7°Cであった。出力を2.5 Wに、照射時間を30 sに上げると、平均ΔTは8.8°C ± 0.9°Cまで上昇し、1つのサンプルでは10.2°Cに達した。3.5 Wで30 s照射した場合、平均ΔTは12.7°C ± 1.9°Cまで上昇し、すべてのサンプルが安全しきい値である10°Cを超えた。3.5 Wで30 s照射した際の温度上昇は、2.5 Wで30 s照射した際よりも有意に高かった（P < 0.01）。
テストしたすべてのパラメータにおいて、2940 nmエルビウムレーザーが外根表面温度の最も小さい上昇を示した。10 mJで10秒間照射した場合、平均ΔTは0.8°C ± 0.1°Cであった。テストした最大設定である30 mJで30秒間照射した場合、平均ΔTは3.6°C ± 1.0°Cであり、測定された温度範囲は2.1°Cから5.0°Cであった。記録されたすべての温度上昇は、安全閾値である10°Cを下回った。1940 nmツリウムレーザーを3.5 Wで30秒間照射した際に観察された温度上昇は、2940 nmエルビウムレーザーを30 mJで30秒間照射した際に観察されたものよりも有意に高かった（P < 0.01）。
全体として、2940 nmエルビウムレーザーは、すべての試験条件下で根面外部温度の上昇が最も低いことが示された。一方、808 nmダイオードレーザーおよび高出力設定の1940 nmツリウムレーザーではより大きな温度上昇が認められ、一部の条件ではあらかじめ定義された安全閾値を超えた。
データの利用可能性：
本研究の知見を裏付けるすべての生データは、補足ファイルとして提供されています。代表的なコロニー形成単位（CFU）画像および完全な細菌増殖曲線は、それぞれ補足図1および2で確認いただけます。個々の検体レベルの外根表面温度の測定値は補足表1に、また、すべての処理群におけるコロニー面積のグレー値および算出された抑制率を含む抗菌活性の生データは補足表2に提供されています。これらの補足ファイルには、本論文で提示された結果の根拠となる一次データが含まれています。
補足ファイル
補足図1. Enterococcus faecalisへのレーザー照射後の代表的なコロニー形成単位（CFU）プレート。3回の連続処理後に根管サンプルから回収されたコロニー形成単位（CFU）を示す代表的なbrain heart infusion（BHI）寒天培地プレート。サンプルは播種前に段階希釈（10−3）し、24時間培養した。滅菌生理食塩水の陰性対照、5.25%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）の陽性対照、808 nmダイオードレーザー（2.0 W, 30 s）、1940 nmツリウムレーザー（3.5 W, 30 s）、および2940 nmエルビウムレーザー（30 mJ, 30 s）処理群の代表的な画像を示す。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
補足図2. レーザー処理後のEnterococcus faecalisの24時間完全増殖曲線。処理済みの根管から回収したEnterococcus faecalisの24時間にわたる増殖速度を、60 nmにおける吸光度（OD60）として測定した。細菌懸濁液を1 × 106 colony-forming units (CFU)/mLに調整し、37°Cでbrain heart infusion (BHI) 液体培地を用いて培養した。滅菌生理食塩水の陰性対照、5.25% 次亜塩素酸ナトリウム (NaOCl) の陽性対照、およびすべての実験的レーザー処理群（808 nm ダイオードレーザー（1.0, 1.5, 2.0 Wで10, 20, 30 s）、1940 nm ツリウムレーザー（1.5, 2.5, 3.5 Wで10, 20, 30 s）、および2940 nm エルビウムレーザー（10, 20, 30 mJ、15 Hzで10, 20, 30 s））の増殖曲線を示す。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
付録表1. レーザー照射中の歯根外表面温度の測定結果
808 nmダイオード、1940 nmツリウム、または2940 nmエルビウムレーザーを用い、指定の出力またはパルスエネルギーおよび照射時間条件下で処理した各試料について、照射前および照射後の歯根外表面温度を報告する。温度差は ΔT = 照射後温度 − 照射前温度 として算出した。各パラメータの組み合わせについて、3つの独立した試料を評価した。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。
補足表2. レーザー処理後の抗菌活性に関する生コロニー形成単位（CFU）解析データ。
指定された照射パラメータ条件下で、808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、または2940 nmエルビウムレーザーで処理した各検体のコロニー領域のグレー値および算出された抑制率を示す。生理食塩水および5.25%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）をそれぞれ陰性対照群および陽性対照群とした。抑制率は生理食塩水対照群に対する相対値として算出した。各処理条件について、3つの独立した検体を解析した。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
本ex vivo研究では、感染した根管からE. faecalisバイオフィルムを除去するための、808 nmダイオードレーザー、1940 nmツリウムレーザー、および2940 nmエルビウムレーザーの抗菌 efficacyと熱的安全性を比較した。3つのレーザーシステムすべてにおいて、5.25% NaOClよりも高い細菌抑制効果が認められたが、抗菌 efficacyと熱プロファイルには大幅な差があった。2940 nmエルビウムレーザーは、最高の抗菌活性と根表面温度の最小の上昇を兼ね備えており、全体として最も良好なバランスを達成した。1940 nmツリウムレーザーも強い抗菌 efficacyを示したが、最大の照射パラメータでは10°Cの熱的安全しきい値を超えた。808 nmダイオードレーザーは、相対的に抗菌活性が低く、熱的安全性が劣っていた。これらの知見は、根管内消毒と歯周組織の安全性のバランスを維持する上で、レーザーの波長と照射パラメータが重要な要因であることを示している16。しかし、各波長は異なる臨床的適応、デリバリーシステム、および作用機序を持つため、異なるレーザーシステム間の直接的な比較は慎重に解釈されるべきである。本研究では標準化されたex vivo条件下で抗菌 efficacyを比較したが、各レーザーの最適な適用は、特定の臨床シナリオ、治療目的、および利用可能な器具に依存する可能性がある。
これら3つのレーザーシステムで結果が異なった理由は、主に水、象牙質、および細菌バイオフィルムに対する波長依存的な相互作用によって説明できます。808 nmダイオードレーザーは水による吸収率が低く、主に直接的な光熱効果によって作用します。ダイオードレーザーは、熱誘発性のタンパク質変性と細菌細胞膜の破壊を通じて細菌を死滅させることができます17。しかし、その有効性はレーザーファイバーが標的となる細菌にどれだけ密接に接触または接近できるかに依存しており、根管系の複雑な解剖学的構造においては困難が伴います。このことが、2.0 Wで30 sという条件であっても、ダイオードレーザーによる細菌抑制効果が中程度にとどまった理由と考えられます。増殖曲線の分析では、ダイオードレーザー処理後に一部の細菌が生存し、再増殖能力を維持していたことが示されており、既存のバイオフィルムが完全に除去されなかったことが示唆されました18。1940 nmツリウムレーザーはダイオードレーザーよりも水吸収率が高く、液体で満たされた根管内において光熱効果と光機械的効果の両方を引き起こすことができます19。この高い水吸収率が、より強力な抗菌効果をもたらしている可能性があります。しかし、高出力設定では温度上昇が大きくなるという結果も招きます。例えば、3.5 Wで30 sの照射では顕著な抗菌活性が認められましたが、歯周組織への損傷を避けるために推奨される10°Cの閾値を超えました11,20。したがって、感染した根管の十分な消毒の達成と、周囲組織を損傷させる可能性のある過度な温度上昇の回避との間には、トレードオフの関係があると考えられます。これらのレーザーシステムは、波長によって主要な発色団とエネルギー伝達メカニズムが異なるため、直接的に代替可能なものと考えるべきではありません。ダイオードレーザーは主に直接的な光熱効果を及ぼすのに対し、ツリウムレーザーおよびエルビウムレーザーは根管内の水とより強く相互作用し、さらなる液体媒介効果を生成します。したがって、観察された差異は、照射パラメータと3つのレーザーシステムのそれぞれ異なる作用機序の両方を反映している可能性があります。
2940 nmエルビウムレーザーは、主に水による強い吸収特性のため21、全体として最も良好なプロファイルを示しました。灌流された根管内で活性化されると、レーザーエネルギーが薄い水層に急速に吸収され、キャビテーション、衝撃波、および流体移動が発生します。これにより、外部根表面への熱伝達を制限しつつ、バイオフィルムを機械的に破壊することが可能になります21,2。このメカニズムが、エルビウムレーザーが照射に関連するすべての温度上昇を事前に定義された安全閾値内に維持しながら、最高の抑制率を達成した理由であると考えられます。したがって、本ex vivo研究で評価された実験条件下では、テストしたレーザーシステムの中で、エルビウムレーザーが抗菌効果と熱的安全性の間で最も良好なバランスを示しました。しかし、これらの知見はテストしたex vivo条件に限定されており、エルビウムレーザーの臨床的な優越性を立証するものではありません。これらの知見を臨床的な治療推奨に変換するには、さらなるin vivoおよび臨床研究が必要です。5.25% NaOClで観察された抑制率の低さも注目に値します。NaOClは、根管治療中の細菌除去のための標準的な灌流剤として長年使用されてきましたが、浸透の制限、化学的中和、およびバイオフィルムマトリックスの保護的な性質のため、成熟したバイオフィルムや深い象牙細管における抗菌効果は限定的である可能性があります23,24。これらの知見は、キャビテーション、衝撃波、およびアコースティックストリーミングを含むレーザーによって生じる物理的効果が、次亜塩素酸ナトリウム灌流単独よりも細菌除去を強化できる可能性を示唆しています8,25。したがって、本研究の結果は、レーザー支援灌流を従来の灌流プロトコルの代替としてではなく、根管消毒の補助的な手法として使用することを支持するものです。本研究の主目的は、標準化された実験条件下で3つのレーザーシステムを比較することであったため、生理食塩水とNaOClをそれぞれ陰性対照および従来の化学的対照として組み込みました。本研究は、レーザー照射を現代的なソニック、超音波、またはその他の活性化灌流プロトコルと比較するように設計されたものではありません。その結果、これらの比較群が欠如していることは知見の臨床的妥当性を制限することになり、今後の研究で対処されるべき事項です。
臨床応用に際しては、熱的な安全性が引き続き重要な検討事項となります。ダイオードレーザーによる30秒間の照射では、複数の照射パラメータにおいて温度上昇が10°Cの閾値を超過または接近しており、歯周組織を損傷させる潜在的なリスクが示唆されました26。ツリウムレーザーはダイオードレーザーよりも優れた抗菌効果を示しましたが、出力設定が高くなるにつれて、特に3.5 Wで30秒間照射した場合に安全域が狭まりました。対照的に、2940 nmのエルビウムレーザーは、最高出力設定においても温度上昇を5°C未満に維持しました。これらの結果は、ダイオードレーザーやツリウムレーザーを使用する際には慎重なパラメータ選択が必要である一方で、エルビウムレーザーは本研究で評価した条件下において、より広い熱的安全域を持つことが示されたことを示唆しています。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、ex vivoモデルを使用したため、臨床的な感染時の生物学的環境を完全に再現することはできない。特に、血流による灌流や生理的な組織冷却がないことは、放熱や根管外表面の温度変化に影響を及ぼす可能性がある。加えて、宿主の免疫応答が欠如しているため、抗菌性の知見はレーザー照射の直接的な効果のみを反映しており、免疫介在性の細菌除去は考慮されていない。第二に、検討した細菌種がE. faecalisの1種のみであったが、ほとんどの感染根管には多種細菌によるバイオフィルムが含まれている27。単一種モデルでは、臨床的な多種細菌感染に特徴的な種間相互作用、不均一なバイオフィルム構造、または多様な薬剤感受性を再現することはできない。したがって、E. faecalisに対して観察された抗菌効果を、感染根管内に存在する微生物コミュニティ全体に一般化すべきではない。第三に、すべての実験は静的なラボ条件下で実施されたが、in vivoの歯は周囲組織や血流の影響を受け、それが放熱に影響を与える可能性がある28。最後に、選択した特定の波長と照射パラメータの組み合わせのみを評価した。テストした波長は、異なる水吸収特性と抗菌作用機序を持つレーザーシステムを代表するように選択し、照射設定は、臨床的に実行可能な出力またはエネルギーレベルおよび照射時間を代表するように選択した。それにもかかわらず、パラメータの組み合わせ数が限られているため、知見の一般化には制限があり、今後の研究でさらなる設定を評価すべきである。E. faecalisは、その持続性と抗菌剤への耐性から、根管治療研究における代表的な生物として頻繁に使用されるが、根管感染や治療失敗の唯一の指標と見なすべきではない。臨床的な感染は通常、多種細菌によるものであり、根管内微生物叢の複雑さをより適切に反映させるためには、多種細菌バイオフィルムモデルを用いた今後の研究が必要である。
要約すると、いずれのレーザーシステムも、5.25% NaOCl単独よりもE. faecalisに対して高い抗菌活性を示しました。本ex vivo研究で評価した実験条件下では、2940 nmエルビウムレーザーが、抗菌 efficacyと熱的安全性の間で最も良好なバランスを示しました。1940 nmツリウムレーザーも強い抗菌活性を示しましたが、高出力設定では組織への熱損傷のリスクが高まりました。808 nmダイオードレーザーは、ツリウムおよびエルビウムレーザーよりも抗菌 efficacyが低く、熱的安全性も劣っていました。これらの知見は、根管治療の有望な補助的アプローチとして、2940 nmエルビウムレーザーを用いた消毒法のさらなる研究を支持するものです29。
開示事項
利益相反：
著者らは、本研究に関連して競合する利益がないことを宣言します。雇用、コンサルタンシー、株式保有、謝礼、または有償の専門家証言を含め、金銭的または非金銭的な利益相反は存在しません。
謝辞
本研究は、虹口区衛生健康委員会の医学研究プログラムの支援を受けて実施されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理食塩水 | Beyotime | ST341-50ml | 歯の保存、洗浄、および陰性対照 |
| 1.5 mL マイクロ遠心チューブ | Axygen | MCT-150-C | サンプルの回収および段階希釈 |
| 24ウェル培養プレート | Corning | 3524 | バイオフィルムの培養 |
| 96ウェルマイクロプレート | Corning | 359 | 細菌増殖曲線アッセイ |
| オートクレーブ | Tuttnauer | 2540E | 準備した歯根の滅菌 |
| Brain heart infusion (BHI) 寒天培地 | BD Biosciences | 21065 | 細菌培養およびCFU計測 |
| Brain heart infusion (BHI) 液体培地 | BD Biosciences | 23750 | 細菌培養および増殖曲線分析 |
| クリアネイルポリッシュ | Beyotime | C0187 | 歯根外面の封鎖 |
| ダイヤモンドソー（低速） | Buehler | IsoMet Low Speed Saw | 歯冠の切断 |
| デジタル温度計（K型熱電対対応） | OMEGA Engineering | HH802U | 歯根外表面温度の測定 |
| Enterococcus faecalis ATCC 29212 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 29212 | 細菌株 |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 17% | Sigma-Aldrich | E984 | 最終根管洗浄 |
| フローアブルレジンコンポジット | 3M ESPE | 6031A2 | 根尖孔の封鎖 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.0 • RRID: SCR_02798 | グラフ作成 |
| Hedströmファイル, サイズ 40 | Dentsply Maillefer | 8060301042 | 象牙質チップの回収 |
| Kファイル, サイズ 10 | Dentsply Maillefer | 80-0210 | 作製長の決定 |
| レーザーシステム, 1940 nm ツリウムドープファイバー | Menovex Medical Technology (Shenzhen) Co., Ltd. (Arpadent) | TN20 | レーザー照射 |
| レーザーシステム, 2940 nm Er:YAG | PointNix Co., Ltd. | Modular-beam | レーザー照射 |
| レーザーシステム, 808 nm ダイオード | elexxion AG | Claros Nano | レーザー照射 |
| マイクロピペット | Eppendorf | 3123063 | サンプルの接種 |
| ミネラルオイル（滅菌済み） | Sigma-Aldrich | M5904 | 細菌増殖曲線アッセイ中の蒸発防止 |
| ニッケルチタン回転ファイルシステム (F3 準備) | Dentsply Sirona | ProTaper Gold | 根管形成 |
| 1940 nm ツリウムドープファイバーレーザー用光ファイバー | Menovex Medical Technology (Shenzhen) Co., Ltd. (Arpadent) | 40 µm diameter | レーザー照射 |
| 2940 nm Er:YAGレーザー用光ファイバー | PointNix Co., Ltd. | 60 µm diameter | レーザー照射 |
| 808 nm ダイオードレーザー用光ファイバー | elexxion AG | elexxion longlife 20, 20 µm (Art. No. 1063) | レーザー照射 |
| 周波数プローブ | Hu-Friedy | PCPUNC156 | 歯根長の測定 |
| 周波数スケーラー | Hu-Friedy | SJ34-35 | 歯石および軟組織の除去 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 101023 | 洗浄および細菌の希釈 |
| ピペットチップ (10 µL, 20 µL, 10 µL) | Axygen | T-30 / T-20-Y / T-10-B | 液体の分注 |
| レトルトスタンド | Biosharp | BS-IT-01 | 歯根検体の固定 |
| 走査電子顕微鏡 (SEM) | Hitachi High-Technologies | TM40Plus | バイオフィルムのイメージング |
| 振盪インキュベーター | Thermo Fisher Scientific | MaxQ 40 | 液体培地培養のインキュベーション |
| 次亜塩素酸ナトリウム (NaOCl), 5.25% | Sigma-Aldrich | 42504 | 根管洗浄および陽性対照 |
| 分光度計/インキュベーター（マイクロプレートリーダー） | BioTek / Agilent Technologies | Epoch 2 | 60 nmにおける吸光度 (OD60) の測定 |
| SPSS | IBM | Version 26.0 • RRID: SCR_02865 | 統計分析 |
| 滅菌済みペーパーポイント | Dentsply Maillefer | Absorbent Paper Points, ISO 20, 0.02 taper, 28 mm | 根管の乾燥および細菌サンプリング |
| 熱電対プローブ (K型) | OMEGA Engineering | 800 | 温度測定 |
| ボルテックスミキサー | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | 細菌懸濁液の混合 |
参考文献
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