根瘤線虫の感染は、綿花の収量と繊維品質を著しく低下させます。リグニンは植物の細胞壁を強化し、害虫に対する構造的な防御に寄与しますが、綿花における根瘤線虫耐性におけるリグニンの役割はこれまで検証されていません。本研究では、フロログルシノール染色を用いて、根瘤線虫耐性および感受性を持つ綿花（Gossypium arboreum）系統の根におけるリグニン沈着を可視化するための組織化学的なワークフローについて記述します。
この記事について
サマリー
要約
腎形線虫（Rotylenchulus reniformis）は、特に米国南部において、綿花生産の大きな制約となっています。腎形線虫は、400種以上の線虫の中で2番目に重要な害虫です。これらの線虫は、世界の食糧安全保障に対する脅威となっています。環境および人体への健康への懸念の高まりと、殺線虫剤のコスト上昇により、抵抗性を持つ綿花生殖質への関心が高まっています。植物の細胞壁、特にリグニンは、生物的ストレスへの抵抗性に関与する重要なバイオポリマーです。線虫は根の組織に感染するため、リグニンなどの細胞壁成分が防御に寄与している可能性がありますが、綿花の根におけるリグニン介在性の障壁については十分に解明されていません。本研究では、標準化されたフロログルシノール-HCl組織化学染色プロトコルを用いて、非感染条件下での本葉期における、腎形線虫抵抗性（A2-514、A2-995）および感受性（Gossypium arboreum）の綿花遺伝子型におけるリグニン沈着の違いを可視化しました。この染料は、酸の存在下でリグニンのコニフェリルアルデヒドやシナピルアルデヒドなどのヒドロキシシンナミルアルデヒドに 特異的に 結合し、リグニンを可視化するためにピンクがかった紫色を呈します。抵抗性遺伝子型と感受性遺伝子型の間で異なるリグニン染色パターンが観察され、リグニンに関連した構造的防御の潜在的な役割が支持されました。
概要
綿花は繊維を目的として世界中で栽培されていますが、土壌伝染性病害虫、特に甚大な収穫量減少を引き起こす線虫に対して非常に脆弱です。なかでも、腎形線虫（Rotylenchulus reniformis）は、綿花およびその他の作物に世界的に影響を及ぼす主要な病原体であり、特に米国南部では、この線虫による被害で収穫量が50%以上減少することがあります。1この顕微鏡サイズの土壌棲生物は、綿花の根に寄生します。2、水および養分吸収の妨げや摂食部位の形成を通じて、植物の樹勢、バイオマス、および繊維収量を低下させ（図1）。根 nematodes（ネコブセンチュウの一種であるreniform nematode）の感染は、開花時期の遅延、ボール（蒴果）のサイズおよび数の減少、ならびにリンター（種子繊維）品質の低下を引き起こし、綿花植物の成長を変化させる。3ミシシッピ州、アラバマ州、およびルイジアナ州で深刻な被害が報告されている。4線虫駆除剤は線虫の被害を管理するために一般的に使用されていますが、その高コストであること、および環境や人体への悪影響から、代替策の必要性が生じています。5,6抵抗性系統の開発は、 RENIFORM NEMATODE（腎形線虫）による被害を軽減するための有望なアプローチである。4線虫は根組織内で摂食するため、細胞壁に基づく防御、特にリグニン化が、侵入を制限し、病原体由来の細胞壁分解酵素を抑制し、さらに線虫の摂食部位の形成および拡大を制限すると仮説を立てている。7,8,9リグニン化の亢進は、さまざまな植物種において病原体への感受性の低下と相関している。10,11,12,13,14綿における先行研究では、リグニンおよびラッカーゼ遺伝子の発現がVerticillium dahliaeに対する耐性と関連していることが示されている。15 また、Fusarium耐性品種および感受性品種を用いた研究により、耐性品種においてより高いリグニンレベルであることが明らかになりました。16～における同様の観察結果が シロイヌナズナ およびイネにおいて、リグニン合成遺伝子の抑制が感受性を高めたことは、植物の防御におけるリグニン化の重要性を強調している。
リグニンは管束植物の二次細胞壁に存在する複雑なフェノール性バイオポリマーであり、構造的な剛性、機械的強度、および疎水性を付与します17。シキミ酸経路およびフェニルプロパノイド経路を通じて合成されるリグニンは、セルロースに次いで地球上で2番目に豊富な陸上バイオポリマーであり、地球上の有機炭素の約30%を占めています18,19。リグニンはセルロース-ヘミセルロースネットワークを補強することで、荷重支持組織を強化し、植物全体の成長を支えます。リグニンは、道管、厚壁組織、師管繊維、および周皮などの高度に分化した組織で特に顕著であり、水やミネラルの効率的な輸送に不可欠な撥水性バリアを形成します。構造的な機能に加えて、リグニンは生化学的および物理的な防御バリアとして機能し、病原体の侵入を制限し、生物的および非生物的ストレスによる損傷を最小限に抑えます20,21,22。リグニン化は、死物寄生菌、活物寄生菌、および半活物寄生菌を含む幅広い病原体に対する抵抗性の中心となる動的なプロセスです。主要なモノリグノールであるシナピルアルコール、コニフェリルアルコール、p-クマルアルコールからの生物合成は、種、組織型、および発達段階によって異なり、それが抵抗性の程度に影響を与えます。病原体の侵入や非生物的ストレスは、しばしば局所的なリグニン沈着を誘発し、植物の防御能をさらに強化します23,24。
根形線虫への耐性におけるリグニンの役割を解明することは、綿花の管理戦略を進展させる上で極めて重要です。リグニン分布の視覚的および生化学的な特性評価は、初期防御応答を支える細胞壁修飾の空間的および時間的なダイナミクスに関する知見を提供します。本研究では、組織化学的なフロログルシノール染色を用いて、根形線虫耐性および感受性綿花遺伝子型に自然に存在するリグニン沈着パターンを解析し、細胞壁関連の耐性形質を評価するための実用的な予備的枠組みを提供するとともに、作物のレジリエンス向上を目指した育種プログラムに情報を供します。
プロトコル
実験は、以下に記載する植物材料を用いて温室内で実施した。本研究で使用したすべての化学薬品、装置、および試薬については、材料表に詳細を記載している。
植物材料
感受性系統（A2‑20, PI 129742; A2‑40, PI 183202）および耐性系統（A2‑514, PI 616008; A2‑995, PI 629323）の両方の種子を入手した。さらに、感受性品種であるDeltapine 16を本研究に含めた。種子を滅菌水に入れ、室温で24時間浸漬させた。浸漬後、種子を新鮮な滅菌水で十分にすすぎ、残留した汚染物質を除去した。その後、すすいだ種子を、あらかじめ湿らせてオートクレーブ滅菌したペーパータオルを敷いた滅菌ペトリ皿に移し、発芽を促進させるため室温で2日間培養した（図2）。
温室への定植
プラスチックポットに、あらかじめ湿らせた水分調節用培養土を充填した。土壌は移植の2日前から十分に加湿しておいた。その後、発芽した苗を湿らせた土壌に注意深く移植し、本葉期に至るまで、温室内の制御条件下（昼夜サイクル 28 °C/25 °C）で維持した（図2）。各遺伝子型について3つの生物学的反復を植え付けた。
サンプルの採取
本葉期の植物を、根へのダメージを最小限にするため周囲の土壌を緩めてから慎重に土から取り出した。根に付着した土粒子を取り除くため、水で2～3回洗浄した。各遺伝子型の根および地上部組織を、切片作製の目的で回収した（図 3）。
フロログルシノール染色液の調製
ドラフトチャンバー内で、0.45 gのフロログルシノールを、100%エタノール（10 mL）2部と濃塩酸（5 mL）1部の混合液に溶解させ、3%フロログルシノール溶液を調製した。染色液は、既報の方法16に従って調製した。
リグニンの組織化学的分析のための切片作製および染色手順
滅菌済みのカミソリ刃を用いて根およびシュートの組織を切断し、薄い横断切片を作製した（図3）。新鮮な切片を顕微鏡スライドに載せ、3%フロログルシノール染色液20 µLを滴下して1分間静置した。その後、切片を滅菌水で洗浄し、カバーガラスで封入して撮影した（図4、図5、図6）。茎組織に対しても同様の手順を用いた（付録図1）。
顕微鏡イメージング
デジタル顕微鏡を用いてイメージングを行った。染色した組織サンプルを含む調製済みのガラススライドを顕微鏡のプラットフォームに設置した。顕微鏡イメージングソフトウェアを起動した後、明視野モードで100倍、200倍、300倍の目的の倍率を選択した。粗調整および微調整を行い、組織切片内のリグニン染色パターンを明確に可視化した。画像はそれぞれのサンプル識別番号とともに記録し、保存した。その後、抵抗性遺伝子型と感受性遺伝子型の両方の画像を検討し、リグニン染色の違いを評価する比較分析を行った。抵抗性遺伝子型と感受性遺伝子型の画像をImageJを用いて比較し、均一な閾値を用いて染色面積の割合の違いを決定した。3つの反復試料すべてを処理した後、結果をCSVファイルとして書き出した。その後、抵抗性遺伝子型と感受性遺伝子型を比較するためのグラフを作成した。
結果
抵抗性および感受性綿ゲノタイプのリスト化学的解析
本葉期における根および茎の横断面の組織化学的検討により、抵抗性系統と感受性系統の間で視覚的な差異があることが明らかになり、それは以下の通り示されている。 図4, 図5、および 補足図1 （茎の横断面）。高倍率（100倍～300倍）では、これらの相違点の詳細な観察が可能となりました（図4A–C および 図5A–C 耐性遺伝子型および 図4D–F および 図5D–F （感受性遺伝子型の場合）。リグニンの染色パターンは組織型によって異なり、抵抗性遺伝子型では茎のリグニン染色パターンが低いか同等であったのに対し、感受性遺伝子型では視覚的に茎のリグニン化が相対的に高く認められた（補足図1A–D).
リグニン染色の定量的な画像解析
本研究に含まれる感受性品種であるDeltapine 16は、リグニンの染色性が低く（Figure 6A–C）、染色面積率の値は12、17.8、および16.3であった（Figure 6D）。感受性遺伝子型A2-40の染色面積率は25.2、19.9、および28.75であり、一方で耐性遺伝子型A2-995の染色面積率は54.95、58.71、および69.85であった（Figure 7）。しかし、A2-20の染色面積率は16.6、21.3、および20.4であったのに対し、A2-514の染色面積率は49.8、34.1、および43.38であった（Figure 8）。この比較によるp値は0.06であった。これらの値は異なる閾値を用いて算出されたため、反復実験間での再現性を確保するために、同一の色相（hue）、彩度（saturation）、および明度（brightness）の閾値を用いた一様閾値によるImageJ解析を実施した。その結果、耐性遺伝子型（A2-514）は感受性遺伝子型（A2-20）よりも相対的に強い染色性を示した。染色面積率は、切片内の全組織ピクセル数に対するリグニン陽性ピクセル数の比として算出した。感受性遺伝子型A2-20と耐性遺伝子型A2-514の一様閾値による定量比較をFigure 9に示す。全体として、一様閾値解析により、これらの遺伝子型間で遺伝子型特有のリグニン化の差異が存在することが示された。
データの可用性：
生データは、～として追加されます。 補足ファイル.
図1綿根を摂食する腎形線虫の顕微鏡像赤色食用色素で染色後、50倍の倍率で観察した、綿花の根に寄生する腎形線虫を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2リグニン組織化学分析のための植物材料の調製ワークフローは以下の手順で構成される：(1) 綿花種子を水に浸漬する。(2) ラベルを貼った滅菌シャーレ内の濡れたペーパータオルの上に種子を置く。(3) 2日間発芽させ、苗を土の入ったラベル付きのポットに移す。(4) 苗を子葉期まで成長させる。(5) さらに本葉期まで植物を成長させ、茎と根の横断切片を作製する。(6) 回収した組織切片を染色し、顕微鏡下で観察する。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: フロログルシノール-HClを用いた綿花の根および茎の切片の採取と染色。ワークフローは以下の手順で構成される：(1) 3つの生物学的反復を本葉ステージまで育成する；(2) 植物を土壌から慎重に取り出し、水で洗浄して切片作成の準備をする；(3) 滅菌ブレードを用いて茎の横断切片を作成する；(4) 滅菌ブレードを用いて根の横断切片を作成する；(5) 茎の切片を3% フロログルシノール-HClで染色し、水ですすぎ、顕微鏡下で観察する；(6) 根の切片を3% フロログルシノール-HClで染色し、水ですすぎ、顕微鏡下で観察する；(7) 染色した切片を顕微鏡下で観察し、フロログルシノール染色の差異を可視化して画像を記録する。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 4: 綿の遺伝子型 A2-514 および A2-20 の根の横断切片におけるリグニン染色. 耐性遺伝子型 A2-514 のリグニン染色された根の横断切片を (A) 100倍、(B) 200倍、(C) 300倍の倍率で示したもの. 感性遺伝子型 A2–20 のリグニン染色された根の横断切片を (D) 100倍、(E) 200倍、(F) 300倍の倍率で示したもの. ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図5: 綿の遺伝子型A2-995およびA2-40の根の横断切片におけるリグニン染色。抵抗性遺伝子型A2-995のリグニン染色した根の横断切片（A）100倍、（B）200倍、（C）300倍の倍率。感受性遺伝子型A2-40のリグニン染色した根の横断切片（D）100倍、（E）200倍、（F）300倍の倍率。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 6: Deltapine 16の根の横断面におけるリグニン染色および定量分析。感受性品種Deltapine 16の生物学的反復3検体における、100倍で観察したリグニン染色根横断面：(A) 生物学的反復1、(B) 生物学的反復2、(C) 生物学的反復3。(D) ImageJを用いた定量分析により決定された、生物学的反復3検体の染色面積率。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図7: 綿の遺伝子型A2-40およびA2-995におけるリグニン染色の定量分析. 感性遺伝子型A2-40および抵抗性遺伝子型A2-995の3つの生物学的反復について、ImageJ解析により決定した染色面積の割合。 こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図8綿花遺伝子型A2-20およびA2-514におけるリグニン染色の定量分析感受性遺伝子型A2-20および耐性遺伝子型A2-514の3つの生物学的反復について、ImageJ解析により決定した染色面積の割合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9綿花遺伝子型A2-20およびA2-514におけるリグニン染色の均一しきい値定量化一様しきい値による画像解析後の、感受性遺伝子型A2-20および耐性遺伝子型A2-514における染色面積率。統計的比較にはWelchのt検定を用いた（t = −1.52, p = 0.267). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10: 異なる根の領域におけるリグニン染色の可視化. 根の成熟領域、伸長領域、および根端領域におけるリグニン染色を示す代表的な画像。 こちらの画像をクリックして拡大表示してください。
補足図1：抵抗性および感受性綿遺伝子型の茎横断面におけるリグニン染色。100倍で拡大したリグニン染色済みの茎横断面：（A）感受性A2-20、(B) 抵抗性A2-514、(C) 感受性A2-40、および (D) 抵抗性A2-995。 こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
植物細胞壁に関連するリグニンは、線虫を含む害虫に対する重要な物理的バリアとして機能します。本研究において、抵抗性および感受性の綿花遺伝子型は、リグニン染色において明確な視覚的差異を示しました。これは、Fusarium抵抗性および感受性品種で以前に報告されたパターンと同様の傾向でした。染色により、根の各領域（成熟帯、伸長帯、根端）におけるリグニンの分布を明確に可視化することができ、リグニンの強度は根の上部から根端に向かって漸進的に増加しました（Figure 10）。これらのパターンは有用な解剖学的知見を提供しますが、線虫感染に応答したリグニンの動態は本研究では評価されておらず、今後の研究での確認が必要です。先行研究では、病原体の存在がリグニン生合成を誘導することが示唆されており、線虫の負荷条件下でリグニンの変化を検証する必要性が強調されています。リグニンの量と組成に関する生化学的分析を組み込むことで、これらの遺伝子型で観察された染色パターンの解釈をさらに強化できると考えられます。総じて、これらの知見は、綿花におけるとうがた線虫への抵抗性におけるリグニン介在性の構造的防御の役割を浮き彫りにし、これらの形質を特性づける上でのフロログルシノール染色の有用性を実証しています。解剖学的、生化学的、および分子生物学的アプローチを継続的に統合することで、リグニン生合成の理解と、とうがた線虫に対する持続的な抵抗性の構築への寄与についての理解が深まるでしょう。
開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
免責事項
USDAは、機会均等を提供する提供者、雇用主、および貸し手です。本出版物における商標名または商用製品への言及は、特定の情報を提供することを唯一の目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。本記事における知見および結論は著者によるものであり、USDAまたは米国政府の公式な決定または方針を代表するものとして解釈されるべきではありません。
謝辞
著者らは、本研究で使用した顕微鏡検査室の設備へのアクセスを提供してくださったKatherine Parys博士に感謝いたします。また、原稿の改善に向けた提案と支援をいただいたJunping Chen博士およびAbdulraheem博士に感謝いたします。本研究は、USDA-ARSプロジェクト6066-21000-053-00Dの支援を受けて行われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 保水性ポットミックス | Miracle-Gro | 073561005197 032247557832 | Amazon ウェブサイト |
| 顕微鏡 | Keyence VHX | VHX3000 | 同等の明視野顕微鏡であれば使用可能 |
| 滅菌カミソリ刃 | Workpro | W018057 | Amazon ウェブサイト |
| まな板 | Freshware | 15.75"L x 9.8"W x 0.3"Th | Amazon ウェブサイト |
| スライドグラスおよびカバーグラス | Amscope | BS-50P-100S-22X4 | どのブランドでも使用可能。本製品はAmazonで購入可能 |
| 滅菌水/蒸留水/オートクレーブ滅菌水 | Gibco | 15230147 | どのブランドの滅菌オートクレーブ水でも使用可能 |
| フロログルシノール染色液 | Fischer Scientific | AC241761000 | Fischer Scientificで入手可能 |
| 濃塩酸 (Concentrated HCl) | Fischer Scientific | CAS: 7647-01-0 | Fischer Scientificで入手可能 |
| 絶対エタノール | Fischer Scientific | 64-17-5 | Fischer Scientificで入手可能 |
| ポット | BTPLASTIK | B0DSBQMXHN | 任意のプラスチックポットが使用可能。Amazonで購入可能 |
| シャーレ | Kingdder | B0BS95MCGS | Amazonで購入可能。また他のブランドでも使用可能 |
| ペーパータオル | Tork | MB540A | Amazonで購入可能。また他のブランドでも使用可能 |
| Image J | ソフトウェア | オンラインで入手可能 | 無料で利用可能なソフトウェア |
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