本研究は、Qiming Granule (QMG) が腸-網膜軸を調節することにより、糖尿病網膜症 (DR) を改善することを実証しています。QMGは腸内細菌叢を再構築し、全身性炎症を抑制し、CMKLR1を中心とする調節ネットワークを回復させることで、網膜の組織病理学的損傷を改善しました。これらの知見は、QMGがDRに対する有望な腸-網膜治療戦略となることを示唆しています。
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本研究は、Qiming Granule (QMG) が腸-網膜軸を調節することにより、糖尿病網膜症 (DR) を改善することを実証しています。QMGは腸内細菌叢を再構築し、全身性炎症を抑制し、CMKLR1を中心とする調節ネットワークを回復させることで、網膜の組織病理学的損傷を改善しました。これらの知見は、QMGがDRに対する有望な腸-網膜治療戦略となることを示唆しています。
糖尿病網膜症（DR）は、慢性的な高血糖と全身性炎症によって引き起こされる神経血管合併症であり、近年、腸-網膜軸が重要ながらも十分に活用されていない治療標的であることが明らかになってきています。本研究では、啓明顆粒（QMG）が腸-網膜軸を調節することにより、DRに対して保護効果を発揮するかどうかを検討しました。C57BL/6マウスをランダムに実験群に分け、異なる介入を行いました。網膜の組織病理学的変化は、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色によって評価しました。血清中の炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α）レベルは、酵素結合免疫吸着法（ELISA）により測定しました。網膜および結腸組織における主要な調節タンパク質（CMKLR1、Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、TP53）の発現は、ウェスタンブロッティング（WB）により検出しました。腸内細菌叢の組成と多様性は、フルレングス16S rDNAシーケンシングにより特徴付けました。腸内細菌叢と炎症因子または主要タンパク質との関係を評価するために、相関分析を行いました。QMG投与は、網膜の層構造の回復、網膜神経節細胞数の部分的な回復（P < 0.001）、および網膜薄層化の改善（P < 0.01）によって示されるように、網膜の組織病理学的異常を改善しました。また、血清中のIL-1β、IL-6、およびTNF-αレベルを有意に低下させました（P < 0.0001）。腸-網膜軸において、QMGは主要な調節タンパク質、特にCMKLR1を中心としたネットワーク（Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、TP53）の異常発現を是正しました。さらに、QMGは腸内細菌叢の組成、多様性、および機能を回復させ、相関分析により、QMGが全身性炎症とこれらの調節タンパク質を結合させて腸-網膜軸を調節することが明らかになりました。 本研究は、QMGが腸-網膜軸を介してCMKLR1を中心とする調節ネットワーク（Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、およびTP53を含む）と全身性炎症を結合させることでDRを改善するという予備的な薬理学的根拠を提供し、QMGがDRに対する有望な腸-網膜治療戦略であることを示しています。
糖尿病網膜症（DR）は、糖尿病（DM）の最も一般的な微小血管合併症の一つであり、世界中の労働年齢層の成人における失明の主要な原因となっています1。世界的に、DRはDM患者の約20～30%に影響を及ぼします2。慢性的高血糖は、神経血管カップリングの障害、炎症反応の亢進、および酸化ストレスを含む一連の病理的イベントを誘発することで、DRの病態を進行させます3。最近では、網膜症を伴う糖尿病患者において、網膜症を伴わない患者と比較して、腸内細菌叢の多様性と組成に変化があることが観察されています4,5。その結果、腸の恒常性と網膜の健康を結ぶ双方向の通信ネットワークである「腸-網膜軸」が、DR進行の新たな寄与因子として浮上しています。しかし、腸-網膜信号を網膜病理へと変換する具体的な分子媒介物質は依然としてほとんど解明されておらず、信頼性の高いバイオマーカーや治療標的の特定を制限しています。
腸–網膜軸は、免疫学的、代謝的、神経内分泌的、および血管経路を通じて、腸内細菌叢およびその代謝産物と網膜組織との間の複雑な双方向通信ネットワークを規定しており、それによって恒常性維持を調節しています6。分子レベルでは、腸–retina軸は、主要なストレス応答性および細胞運命決定タンパク質、具体的にはAP-1およびTP53の調節不全によって特徴付けられます7,8,9。さらに、主要なケモカイン受容体であるCMKLR1が、内皮機能不全および代謝調節不全の主要な媒介因子として現れ、腸内細菌叢の変化と糖尿病網膜症の病態形成との間の重要な連結を確立しています10。重要なことに、Wntシグナル伝達は、網膜血管の恒常性と腸上皮バリア機能の維持において二重の調節的役割を担っており11、一方でPPARシグナル伝達は、眼組織と腸組織の両方における炎症反応および代謝プロセスのマスターレギュレーターとして機能しています12,13。これらの分子因子は、腸–網膜軸内において相互に連結したシグナリングネットワークを共同で構成しており、糖尿病関連合併症に対する新たなメカニズム的な洞察と治療の機会を提示しています。したがって、この軸に沿った構造的および機能的な変化を標的にすることは、DRを管理するための有望な戦略となります。
伝統的な中医学（TCM）は、歴史的に糖尿病および関連する網膜症の治療において重要な役割を果たしており、その治療方針は証（しょう）の鑑別に的に基づいて決定されています。14Qiming Granule（QMG）は、以下の成分で構成されています。 Astragalus membranaceus、Pueraria lobata、Rehmannia glutinosa、Lycium barbarum、Senna obtusifolia、Leonurus japonicus、Typha angustifolia および Whitmania pigraは、糖尿病網膜症（DR）の治療に広く適用されています。中国国家薬品監督管理局の承認（承認番号：Z20090036）を受け、QMGは臨床試験を完了し、販売承認を得ています。QMGは、網膜毛細血管における基底膜の肥厚を防ぐことで、保護効果を発揮します。 ペリサイトおよび網膜微小血管への損傷を軽減し、眼の局所的な病理学的形態を維持すること15これにより、DRへのアプローチとして有望な治療法となります。QMGの有効成分は、主要なタンパク質および炎症因子を標的とすることで、～を及ぼします。 抗炎症作用、抗酸化作用、および抗アポトーシス作用を有し、～の調節に関する機序的根拠を提供する 腸–網膜軸16これらの特性は、QMGが腸・網膜軸を調節し得る機序的な根拠となるが、この関連性を探究した研究は少ない。したがって、本研究では、腸・網膜軸を調節するQMGの有効性を検証し、DRにおける治療への可能性を裏付ける実験的根拠を提示することを目的とする。
本研究では、理論的な予測とin vivoの実験データを結びつけ、腸–網膜軸の調節におけるQMGの有効性を検証した。これらの知見は、QMGが腸–網膜軸を介して全身性炎症をCMKLR1を中心とした調節ネットワーク（Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、およびTP53を含む）と結合させることでDRを改善することを示しており、QMGがDRに対する有望な腸–網膜標的治療戦略となることを位置づけている。グラフィカルアブストラクトは図1に示されている。
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すべての動物実験はARRIVEガイドラインに準拠して実施されました。本研究は、Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd.の倫理審査委員会によって承認されました（IACUC ISSUE SYST-2024-011）。 研究デザインをまとめた詳細な実験タイムラインを、以下に示します。 補足図1.
動物の調製および処置
マウスを2%イソフルラン吸入により深く麻酔した。深い麻酔下で、後眼窩血採血により血液を採取した。採血後直ちに、網膜組織を回収するために眼球を摘出した。続いて、安楽死を確実にするため、深い麻酔下で頸椎脱臼を行った。その後、直ちに結腸組織を摘出した。 有害事象を示した動物は速やかに研究から除外され、適切な獣医学的処置を受けた。
ランダム化と盲検化
週齢5週、体重20～30gのC57BL/6系統の雄マウスを、温度および湿度を厳密に制御した条件下で飼育した。1週間の馴化期間の後、コンピュータで生成した乱数を用いて、C57BL/6マウスを3群（ブランク群、モデル群、介入群）にランダムに割り当てた。ランダム化のシーケンスは、動物の取り扱いやアウトカム評価に関与しない研究者によって作成された。
盲検化を確実にするため、すべての動物飼育、薬剤投与、およびデータ収集は、群の割り当てを知らされていない研究者によって行われました。コード化された群の割り当ては、すべての実験および統計解析が完了した後にのみ開示されました。盲検化は、経口投与を行う技術者、網膜組織学を評価する病理学者、およびWestern blot（WB）バンドを定量化する解析者に適用されました。
サンプルサイズの計算
サンプルサイズは、同一の実験条件下で網膜神経節細胞（RGC）数を評価した予備実験に基づいて決定されました。両側有意水準（α）を0.05、統計的検出力（1-β）を0.80と仮定し、モデル群と介入群の間でRGC数に臨床的に意味のある差を検出するために、1群あたり最低5匹のマウスが必要であると算出されました。約20%の脱落率を考慮し、各群のマウス数は6匹に設定されました。
糖尿病動物モデルの作製
空白群には標準食を投与し、介入群およびモデル群には4週間にわたって高脂肪・高糖質食（HFHSD）を投与した。この食事期間の後、介入群およびモデル群に1%ストレプトゾトシン（STZ）溶液を35 mg/kgの用量で腹腔内投与した17,18,19,20。投与から72時間後、非空腹時血糖値が16.7 mmol/Lを超えたマウスをDMモデルの導入成功とみなし、さらなる実験のために選出した。DM動物にはさらに4か月間高脂肪・高糖質食を継続させ、空白群は引き続き標準食を維持させた。
分類学的検証および品質評価
QMGに含まれる8つの成分は、Modernized Plant Names Search (MPNS, http://mpns.kew.org/mpns-portal/)を用いて分類学的に検証されました。QMGの組成報告の質は、ConPhYMPツールを用いて評価されました。
投与方法
介入群の動物にはQMGを経口投与した。QMGはZhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd.（中国国家薬品承認番号 Z20090036）から購入した。QMG懸濁液は、QMGを蒸留水で均一に混合して調製した。 介入群のマウスには、モデル群およびブランク群と同量の懸濁液を経口投与（ゾンド投与）した。投与量は、FDAおよびReagan-Shaw21が推奨する体表面積（BSA）標準化法を用い、成人60 kgあたり4.5 gという臨床単回治療量（市販製剤の標準単位用量）に基づいて算出した。成人（Km = 37）とマウス（Km = 3）の間の換算係数は12.33であり、その結果、マウスへの投与量は体重1 kgあたり0.9 gとなった。モデル群およびブランク群には、同量の生理食塩水を経口投与した。投与は、3ヶ月間にわたり、毎日午前9時から午前11時の間に行った。
観察および試験指標
一般的なバイタルサインのモニタリング
治療的介入を包括的に評価し、潜在的な合併症を検出するために、体重、血糖値、水分および食物摂取量、尿量、活動レベルと行動、体温、ならびに被毛および皮膚の状態を含む、一般的なバイタルサインおよび生理学的指標を系統的に観察し、記録した。
HE染色分析による網膜の形態学的変化の観察
すべての検体は、固定後、一連のエタノールおよびキシレン溶液を用いた自動脱水機で処理し、その後パラフィンに埋め込んだ。続いて、4 µmのパラフィン切片を作成し、HE染色を行い、中性粘着剤で封入した。網膜画像は3DHISTECH Pannoramic SCANスキャナーを用いてスキャンした。画像解析およびデータ測定にはImage-Pro Plusを使用した。
ELISA分析による血清IL-6、TNF-α、およびIL-1βの検出
血球サンプルは後眼窩脱出法により採取した。血清は 1,000 × g 、4 °C で 15 分間遠心分離して分離し、分析まで -80 °C で保存した。IL‑1β、IL‑6、および TNF‑α の血清レベルは、試薬の平衡化、サンプルの添加、インキュベーション、洗浄、コンジュゲートおよび基質の添加、反応停止、吸光度測定、および標準曲線に基づく濃度算出を含む標準手順に従って測定した。吸光度はマイクロプレートリーダーを用いて 450 nm で読み取り、サイトカイン濃度は標準曲線を用いて算出した。
WB解析による網膜および結腸における主要調節タンパク質の検出
3つの独立した生物学的反復試行を単一のメンブレン上で行い、標的タンパク質に対して順次プローブした。すべての反復試行は、同時に犠牲にした単一の動物コホートから得られたものである。標的タンパク質の分子量がGAPDHの分子量に近すぎた場合、<（5 kDaの差があるため）、シグナルの重なりを防ぐために独立した膜で解析した。正確な定量を行うため、各膜では標的タンパク質またはGAPDHのいずれかのみをプローブした。一次抗体として以下を使用した：GAPDH ポリクローナル 抗体（1:5000）、CMKLR1ポリクローナル抗体（1:1000）、Wnt5aポリクローナル抗体（1:1000）、TP53ポリクローナル抗体（1:1000）、AP-1モノクローナル抗体（1:5000）、およびPPARガンマ（PPAR-γ）ポリクローナル抗体（1:1000）。細胞溶解後、遠心分離を行うことで全タンパク質を回収した。タンパク質濃度を測定した。 BCA法を用いて定量した。抽出したタンパク質を12%分離ゲルのSDS-PAGEで分離し、その後メンブレンに転写した。メンブレンを5%脱脂粉乳を含むTBSTでブロッキングし、適切な一次抗体とともに一晩、以下の温度でインキュベートした。 4 °C洗浄後、メンブレンを10,000倍に希釈したHRP標識抗ウサギまたは抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。最後に、化学発光イメージングによりタンパク質バンドを可視化し、解析した。可視化およびデータ処理において、不要な分子量領域を除去するためにブロットを水平方向にクロッピングしたが、レーン間の領域は除去せず、すべてのサンプルレーンを保持した。不要なゲル領域を除去するためのクロッピング時に、エッジ部分にわずかな歪みが生じている場合がある。
16S rDNAシーケンシング解析による腸内細菌叢の検出
最終処置の前に、各マウスから新鮮な糞便サンプルを採取した。マウスを個別に滅菌ケージに10–15分間入れ、自然排便を促した。糞便ペレットを滅菌鉗子で直ちに回収し、滅菌済みの1.5 mLチューブに移し、液体窒素で急冷後、DNA抽出まで-80 °Cで保存した。交差汚染を最小限に抑えるため、すべての操作は滅菌条件下で行った。微生物組成の整合性を確保するため、排便から凍結までの間隔は10分以内に維持した。糞便ゲノムDNA（gDNA）サンプルをFecal gDNA extraction kitを用いて精製し、次いでユニバーサルプライマー8F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)および1492R (5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、16S rDNA遺伝子の全長増幅を行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、精製および定量して、後続のアプリケーションに使用した。ハイスループットシーケンシングは、Nanopore GridIONシーケンサーを用いて実施した。データ解析プロセスには、ベースコーリング、データ品質管理、種アノテーション、系統樹構築、コミュニティ解析、AlphaおよびBeta多様性解析、そして 差分的に豊富に存在する種の解析およびコミュニティ機能予測が含まれる。解析には、NanoFilt、Usearch、Rプログラミング言語、Python、およびSILVAデータベースなどのさまざまなツールとデータベースを利用した。
腸-網膜軸と全身性炎症および多層的な腸内細菌叢の相関分析
多レベルの腸内細菌叢と血清炎症性サイトカインおよび主要な調節タンパク質との潜在的な関連性を探索するため、Luoning Bio-Cloudプラットフォームを用いて相関分析を実施した。まず、シークエンシング結果から、界、門、綱、目、科、属、種の各レベルにおける種豊富度データを抽出した。血清炎症性サイトカインおよびタンパク質発現レベルを含む物理化学的因子を、環境因子ファイルにまとめた。相関の信頼性と可視化を確保するため、微生物の豊富度と臨床測定単位の間のスケールの差を排除するようにデータの正規化を行った。相関係数（R値）および対応する有意水準（P値）を算出した。結果は相関ヒートマップを用いて可視化し、色のグラデーションで相関の強さと方向を示し（赤は正の相関、青は負の相関を表す）、アスタリスク（**）で統計的有意性（P < 0.01）を示した。
統計手法
すべての統計解析および視覚化はGraphPad Prismを用いて行われた。平均値の比較には、正規分布に従うデータに対してt検定を用いた。データが正規分布から逸脱している場合は、Kruskal-Wallis検定を使用した。変数間の関係については、SpearmanまたはPearsonの相関分析を行った。すべての統計検定は両側検定として実施し、統計的有意水準は0.05とした。
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General situation of experimental animals
Blood glucose levels were significantly elevated in the model group (27.21 ± 6.03 mmol/L) compared with the blank group (P < 0.001), indicating the successful induction of the DM model. During the study period, the experimental animals showed stable body weight, continuous water and food intake, normal urine output, body temperature, healthy fur and skin condition, and normal behavior during the experiment.
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糖尿病網膜症（DR）は、慢性的高血糖、炎症、および代謝調節不全によって引き起こされる複雑な神経血管合併症である22。米国眼科学会は、DRを非増殖性DRと、新生血管の出現を特徴とする増殖性DRに分類している23。現在の治療戦略には限界があるため、新たなメカニズムの探索がDRへの対処に向けた有望な方向性として浮上している。特に、最近の画期的な研究により、腸・網膜軸がDRにおける重要ながらも十分に活用されていない治療標的であることが特定された。2017年にSheldon Rowanによって初めて導入・記述された腸・網膜軸は6、眼疾患の病態生理学的プロセスにおいて注目を集めている。しかし、DRの発症および進行における腸・網膜軸の役割を支える具体的な分子メカニズムは依然として不明であり、これがこの軸を標的とした治療戦略の開発および臨床応用を妨げている。
本研究では、DRに対するQMGの有効性とその基礎となるメカニズムを体系的に評価した。これらの知見は...
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著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼしたと考えられる既知の競合する利害関係や個人の関係がないことを宣言します。
著者は、本研究を完遂するために多大なるサポートと協力を提供してくれたすべてのチームメンバーに感謝いたします。
本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号：82474580）および成都中医药大学附属医院の病院基金自由探索プロジェクト（No. 23ZYTS1601）の支援を受けて行われました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AP-1モノクローナル抗体 | Proteintech | 66313-1-IG | 1:5000 |
| CMKLR1ポリクローナル抗体 | 親和性 | AF5291 | 1:1000 |
| GAPDHポリクローナル抗体 | 親和性 | AF7021 | 1:5000 |
| ヤギ抗マウスIgG(H+L) HRP標識抗体 | マルチサイエンス | GAM0072 | 1:10000 |
| ヤギ抗ウサギIgG(H+L) HRP | マルチサイエンス | GAR0072 | 1:10000 |
| GraphPad Prism | / | バージョン 9.5 | |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc.（米国メリーランド州ロックビル） | バージョン 6.0 | |
| Luoning Bio-Cloudプラットフォーム | http://www.biomediv.cn/login.html | ||
| マウスIL-1β(インターロイキン1β) ELISAキット | Elabscience | E-EL-M0037 | 血清サイトカイン検出 |
| マウスIL-6（インターロイキン-6）ELISAキット | Elabscience | E-EL-M0044 | 血清サイトカイン検出 |
| マウスTNF-αα(腫瘍壊死因子アルファ) ELISAキット | Elabscience | E-EL-M3063 | 血清サイトカイン検出 |
| NanoFilt | / | バージョン 2.7.1 | |
| Nanopore GridION シーケンサー | Oxford Nanopore Technologies | https://store.nanoporetech.com/gridion.html | |
| Pannoramic SCAN II | 3DHISTECH Pannoramic SCANスキャナー | Pannoramic Scan II デジタルスキャナー Pannoramic Scan IIは、組織切片のデジタル化に特化した高性能なスライドスキャナーです。高解像度のイメージング、高速スキャン、そして使いやすさを兼ね備え、病理学研究および診断におけるワークフローを最適化します。 主な特徴 高解像度イメージング： 精密な細胞レベルの構造を捉え、診断や研究に必要な詳細な情報を提供します。 高速スキャン： 効率的なスループットを実現し、大量のサンプルを迅速にデジタル化することが可能です。 直感的な操作性： ユーザーフレンドリーなインターフェースにより、専門的なトレーニングを最小限に抑えつつ、スムーズな操作が可能です。 正確なフォーカシング： 高度なオートフォーカス機能を搭載し、組織の厚みや形状に関わらず、全視野で鮮明な画像を維持します。 応用分野 病理診断： 組織切片の高精細なデジタル画像により、遠隔診断や共同診断を支援します。 がん研究： 腫瘍微小環境やバイオマーカーの解析において、広範囲かつ詳細な観察を可能にします。 デジタルアーカイブ： 貴重な標本をデジタル化して保存することで、物理的な劣化を防ぎ、永続的なアクセスを確保します。 技術仕様 光学系：高倍率・高解像度レンズを搭載 スキャン速度：高速スキャンモードを実装 対応フォーマット：主要なデジタル病理画像フォーマットとの互換性 ソフトウェア：画像解析および管理のための統合ソフトウェアを提供 | |
| PPAR γ (PPAR-γポリクローナル抗体 | ImmunoWay | bs-0530R | 1:1000 |
| Python | / | バージョン 3.7.4 | |
| 清明顆粒 | 浙江三生曼迪製薬有限公司 | 中国国家薬品管理局承認番号 Z20090036 | 0.9 g/kg、経口投与 |
| Rプログラミング言語 | / | バージョン 4.0.3 | |
| SILVAデータベース | / | バージョン 138 | |
| ストレプトゾトシン (STZ) | Sigma-Aldrich | S0130 | 35 mg/kg, 腹腔内投与 |
| TP53ポリクローナル抗体 | Abcam | ab131442 | 1:1000 |
| Usearch | / | バージョン 10.0.240 | |
| Wnt5aポリクローナル抗体 | Proteintech | 55184-1-AP | 1:1000 |
| Zymo Research BIOMICS DNA Microprep Kit | Zymo Research | D4301 | 糞便gDNA抽出 |
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