便微生物叢移植を受けたパーキンソン病患者6名を対象としたこの探索的研究では、運動症状および非運動症状の改善とともに、腸内微生物の多様性、分類学的組成、および予測機能プロファイルの経時的な変化が観察されました。これらの知見は、微生物叢に基づいた介入法のさらなる検討を支持する予備的な根拠となるものです。
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便微生物叢移植を受けたパーキンソン病患者6名を対象としたこの探索的研究では、運動症状および非運動症状の改善とともに、腸内微生物の多様性、分類学的組成、および予測機能プロファイルの経時的な変化が観察されました。これらの知見は、微生物叢に基づいた介入法のさらなる検討を支持する予備的な根拠となるものです。
腸内細菌叢の変化はパーキンソン病（PD）との関連が指摘されていますが、便微生物移植（FMT）後の微生物の経時的変化およびその臨床的関連については、まだ十分に解明されていません。この単施設後方視的観察研究では、疾患期間に基づいて高重症度群（>6年）と低重症度群（≤6年）に層別化した6名のPD患者を対象としました。FMT前およびその後5ヶ月間にわたって毎月、計36検体の便サンプルを採取しました。16SリボソームRNA遺伝子配列解析を用いて、微生物の多様性、コミュニティ構造、分類学的組成、および予測機能プロファイルを評価しました。解析には、α多様性とβ多様性、分類学的アバンダンス、線形判別分析（LEfSe）、Tax4Fun2に基づく機能予測、および微生物学的特徴と臨床指標との間のスペアマン順位相関が含まれます。記述的解析により、重症度サブグループ間およびFMT後の各時点間で、微生物の豊富さ、多様性、コミュニティ構造、および予測機能に差異があることが示されました。ベースラインにおいて、低重症度群は高重症度群よりも微生物の豊富さと多様性が高く、BifidobacteriumやLactobacillusを含む分類群の相対的アバンダンスが高い傾向にありました。FMTの1ヶ月後、高重症度群ではベースラインから豊富さと多様性が増加し、それに伴い分類学的組成も変化しました。両サブグループにおいて、FMT後の微生物多様性と予測されるKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）パスウェイの濃縮度に時間的な変動が認められました。予測された機能には、糖質およびアミノ酸代謝、二次代謝産物生合成、膜輸送、および信号伝達が含まれていました。いくつかの操作的分類単位（OTU）は、運動機能障害、便秘、睡眠の質、機能的状態、および神経精神症状の指標と相関していました。したがって、FMTは腸内微生物の多様性、組成、および予測機能の経時的変化に関連しており、特定の微生物学的特徴が運動および非運動指標と関連していることが示唆されました。本研究は小規模な後方視的コホートであるため、これらの知見は予備的なものであり、より大規模な対照研究による確認が必要です。今後の研究では、これらの微生物学的変化が再現可能であるか、5ヶ月以降も持続するか、ドナー由来の定着を反映しているか、そしてPDにおける移植後の測定可能な臨床的改善に対応しているかを明らかにする必要があります。
パーキンソン病（PD）は、緩慢運動、筋強剛、安静時振戦、および姿勢不安定性を特徴とする、一般的な進行性神経変性疾患である1。その病態生理は完全には解明されていないが、神経炎症、環境曝露、遺伝的感受性を含む複数の要因が、疾患の発症および進行に関与していると考えられている2。疫学的根拠によれば、PDは高齢者において最も一般的な神経疾患の一つであり、加齢とともに有病率が増加し、深刻な機能障害を伴う3。現在の治療法、特にドパミン補充療法は、運動症状をある程度軽減させることができるが、疾患の進行や多くの非運動症状に対する効果は限定的であり、治療反応には個人差がある4。したがって、PDに関連する生物学的変化および潜在的な治療ターゲットのさらなる研究は、臨床的に重要である。
腸内細菌叢は、腸管バリアの完全性の維持、免疫応答の調節、および代謝恒常性のサポートにおいて重要な役割を果たしています5。糞便微生物移植（FMT）は、腸内細菌叢のバランスを回復させるために、健康なドナーからレシピエントへ糞便微生物を移植する手法です6,7。多くの動物研究により、腸内細菌叢の移植が神経行動表現型に影響を与える可能性が示唆されています8,9。うつ病や不安症の患者由来の微生物叢がマウスに相応の行動変化を誘発することから、健康なドナー由来の微生物叢は行動学的アウトカムを改善させる可能性があります10。さらに、一部のPD（パーキンソン病）および自閉症の患者において、FMT後の症状改善が予備的な臨床観察で報告されており、微生物ベースの介入が神経疾患および神経精神疾患において潜在的な関連性を有することが示唆されています11,12。それにもかかわらず、これらの効果の根底にあるメカニズムは依然として不明であり、PDにおけるFMTの安全性と有効性を確立するための臨床研究が必要です。
腸内細菌叢とパーキンソン病（PD）との関連性は先行研究で示唆されていますが、糞便微生物移植（FMT）後の腸内細菌組成の経時的変化およびそれらと臨床的特性との関連については、まだ十分には解明されていません。また、臨床的な重症度が異なる患者において、FMT後に異なる微生物学的反応を示すかどうかも不明なままです。
この単施設レトロスペクティブ観察研究では、日常的な臨床診療においてFMTを受けたPD患者をレビューしました。FMT前後の臨床スコアを分析し、利用可能な糞便サンプルを用いて16S rRNA遺伝子シークエンシングを行い、腸内細菌叢の多様性、分類学的組成、予測機能プロファイル、および臨床指標との相関を探索しました。本研究は、PDにおけるFMT後の臨床転帰と腸内細菌叢プロファイルを特徴づけ、将来的な前向き対照研究に向けた予備的なエビデンスを提供することを目的としました。
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本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、プロトコルは南京医科大学第二附属病院の倫理委員会によって承認されました（承認番号：2021-KY-100-01）。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得ました。
この単施設レトロスペクティブ観察研究は、南京医科大学第二附属病院神経内科にて実施されました。2022年1月から2023年12月まで、パーキンソン病診断基準（2020年版）を満たす原発性PD患者計32名を組み入れました。最終的に、厳格な選択基準を満たし、すべての研究手順を完了した6名の患者を後続の解析対象としました。スクリーニング、除外、およびフォローアップの詳細は、付随図1に示されています。
糞便サンプルの採取および微生物コミュニティ解析
健康なボランティアから糞便微生物叢を採取した。ドナーのスクリーニングプロセスは、「糞便微生物叢移植の臨床応用に関する中国専門家コンセンサス」に従って厳格に実施した。ドナーの組み入れ基準は以下の通りである：年齢18–40歳で慢性疾患の既往がないこと。胃腸疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患、または精神疾患の既往がないこと。過去3ヶ月間に抗生物質、プロバイオティクス、免疫抑制剤、またはプロトンポンプ阻害薬の使用がないこと。過去6ヶ月間に流行地域への渡航、輸血、または手術歴がないこと。感染症および病原体を排除するための血液および糞便のスクリーニング項目は以下の通りである：ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、Clostridium difficile、Salmonella、Shigella、Campylobacter、病原性Escherichia coli、腸管ウイルス、および寄生虫。有効な1回あたりの糞便検体量は少なくとも 50 g とした。自動糞便微生物叢精製システム（Table of Materialsを参照）を用い、新鮮な糞便 100 g ごとに 500 mL の滅菌生理食塩水を加え、標準化された遠心分離と洗浄（700 × g、3 min）を3回繰り返し、滅菌生理食塩水で 1:2 の容量比で懸濁液を調製した後、直ちに接種した。被験者に、約 5 × 10^13 の生存細菌を含む懸濁液 150 mL を1回注入した13。
すべてのレシピエントに対し、大腸内視鏡を用いてFMTを実施し、スコープを盲腸および上行結腸まで挿入した。右側結腸への優先的な定着を促進するため、懸濁液を生検チャンネルを通じてゆっくりと均一に注入した。注入後、患者は少なくとも2時間、右側臥位を維持した。処置前の準備として、3日間の低残渣食の後、処置前24時間は全液食とし、注入前6時間は固形物を、2時間は液体を絶食させた。移植前夜には、ポリエチレングリコール電解質溶液を用いて、便の混じらない透明な排液が得られるまで標準的な全結腸洗浄を行った。薬剤の制限として、FMTの少なくとも72時間前から全身性抗菌薬の使用を中止し、移植後1週間は回避させた。プロトンポンプ阻害薬（PPI）は処置の24–48時間前に中止し、下剤およびプロバイオティクスは移植当日に投与を停止した。
処置中は、心拍数、血圧、および酸素飽和度を継続的にモニタリングし、腹部膨満感、疼痛、または悪心などの症状を確認しました。激しい腹痛または低血圧が発生した場合は、直ちに注入を停止しました。移植後の最初の7日間は、排便回数、便の形状、および腹痛、下痢、発熱、血便を含むすべての有害事象を記録するため、毎日のフォローアップを実施しました。長期的なフォローアップは5か月まで継続し、腸内細菌叢解析のための定期的な便サンプリング、およびUnified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS) とWexner Constipation Scoreを用いた臨床評価を実施するとともに、有効性と安全性の両方を包括的に評価するため、症状の変化および併用薬の使用状況を記録しました。
糞便サンプルは、FMT前およびFMT後1、2、3、4、5ヶ月目の計6つの時点で採取した。すべての参加者に、糞便サンプルの採取に関する標準化された指示を提供した。滅菌鉗子を用いて、糞便の中間部を約10–20 g採取し、滅菌採取容器に入れた。サンプルは採取後2–3 h以内にラボに搬送し、訓練を受けた研究者が無菌条件下で滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブ（Table of Materials参照）に分注した。すべての分注サンプルは、さらなる解析まで直ちに−80 °Cで保存した。
糞便サンプルの採取後、すべての検体は16S rRNA遺伝子シーケンシングのため、ドライアイスを用いて商業シーケンシングプロバイダー（Materials表を参照）に輸送されました。ライブラリ調製、シーケンシング、および初期品質管理は、プロバイダーの標準プロトコルに従って実施されました。各糞便サンプルからゲノムDNAを抽出し、プライマー341Fおよび805Rを用いて、細菌16S rRNA遺伝子のV3–V4ハイパーバリアブル領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅しました。FMT前およびFMT後の異なる追跡時点における患者の腸内細菌叢プロファイルを特徴付けるため、2 × 300 bpペアエンド法を用いたベンチトップ型のショートリードシーケンシングプラットフォーム（Materials表を参照）でシーケンシングを実施しました。シーケンシング後、後続の微生物解析に使用する高品質な配列を得るために、生リードの処理を行いました。分類学的分類は、商業用16S分類割り当てパッケージおよびその関連微生物同定データベース（Materials表を参照）を用いて行いました。得られた分類学的プロファイルは、その後の微生物多様性、コミュニティ組成、相対存在量の差、および予測微生物機能の解析に使用されました。
臨床評価および分析ラベル
PD患者は、疾患期間に基づいて2つの重症度グループに層別化されました。高重症度群（>6年、「_H」と定義）と低重症度群（≤6年、「_L」と定義）です。FMT前に採取された糞便サンプルはベースラインサンプルと定義され、対応する重症度グループに応じてFB_HまたはFB_Lとラベル付けされました。FMT後1、2、3、4、5か月目に採取されたサンプルは、高重症度群ではFP1M_H、FP2M_H、FP3M_H、FP4M_H、FP5M_H、低重症度群ではFP1M_L、FP2M_L、FP3M_L、FP4M_L、FP5M_Lとラベル付けされました。評価した臨床パラメータには、Wexner便秘スコア、非運動症状尺度（NMSS）、非運動症状質問票（NMSQ）、神経精神機能検査（NPI）、Hoehn–Yahr重症度、日常生活動作（ADL）尺度、ピッツバーグ睡眠尺度（PSQI）、元の（UPDRS I–VI）、および合計UPDRSスコアが含まれます。記述統計および推測統計の手法を組み合わせて、高重症度群（_H群）および低重症度群（_L群）のPD患者における6つの時点での臨床指標の変化を分析しました。全時点における群間差を予備的に探索するため、各時点での_H群と_L群の指標の分布をWilcoxon順位和検定を用いて比較し、さらに、患者個別のランダム切片を用いたより厳格な線形混合モデル（LMM）を適用しました。サンプルサイズが限定的であるため、混合効果モデルの結果は探索的な参照としてのみ提示しています。この探索的研究の主要エンドポイントは、ベースラインから糞便微生物移植後の各時点までの腸内細菌の多様性と組成の変化であり、臨床的変化を副次エンドポイントとして評価しました。
OTUクラスタリング、多様性解析、および分類学的存在量
微生物コミュニティ組成を要約するために操作的分類単位（OTU）を用い、類似度が97%以上の配列を同一のOTUとしてクラスター化した。シーケンシング深度はシャノン指数に基づく希薄化曲線を用いて評価し、曲線のプラトー（平坦化）により、後続の多様性解析に十分なカバレッジが一般的に得られていることを確認した。
α多様性は、微生物の豊富さについてはChao1および豊富さに基づくカバー率推定（ACE）指数を用いて評価し、全体の多様性と均一性についてはShannonおよびSimpson指数を用いて評価した。β多様性は、加重および非加重UniFrac距離を用いて評価し、次いで主座標分析（PCoA）を行い、群間における微生物コミュニティ組成の違いを可視化した。α多様性とβ多様性の群間差は、統計解析のセクションに記載されている通り、それぞれノンパラメトリック検定および permutational multivariate analysis of variance（PERMANOVA）を用いて評価した。
16S rRNA遺伝子シーケンシングデータに基づき、門、綱、目、科、属のレベルで分類学的組成をまとめました。Rのコミュニティ生態系解析パッケージ（材料表を参照）を用いて、各分類レベルで最も含有量の多い上位10個のタクサを特定し、可視化します。分類学的プロファイルは棒グラフで表示し、選択したタクサについて群間でのさらなる比較を箱ひげ図を用いて行いました。
微生物分類群の特異的存在量解析
事前定義されたグループ間で相対的に豊富に存在する分類群を、線形判別分析エフェクトサイズ（LEfSe）を用いて特定しました。LEfSeは、クルスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、および線形判別分析（LDA）を統合し、統計的有意性と判別能の両方を備えた分類群を特定します。P < 0.05かつLDAスコア（log10）が> 3の分類群を、有意に豊富であるとみなしました。判別分類群の相対存在量は、分類学的バープロットを用いて可視化しました。
機能予測および臨床相関分析
腸内細菌叢の予測機能プロファイルは、Tax4Fun2を用いて16S rRNA遺伝子シーケンシングデータから推論され、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) データベースに従ってアノテーションが行われた。有意に濃縮された予測パスウェイはLEfSeを用いて同定し、閾値を P < 0.05 および LDAスコア (log10) > 3 とした。これらの機能プロファイルは、メタゲノミクスまたはメタボロミクス的手法によって直接測定されたものではなく推論されたものであるため、予測上の機能差として解釈した。微生物学的特徴と臨床指標との関連性を検討するため、Spearmanの順位相関分析を実施した。
統計解析
統計解析はRソフトウェアを用いて行った（Materials Tableを参照）。臨床変数は中央値および範囲（最小値–最大値）として要約した。α多様性指数はWilcoxon順位和検定を用いて群間比較を行い、β多様性は999回の置換を用いたPERMANOVAにより評価した。有意に変動したタクサおよび予測機能経路はLEfSeを用いて同定し、有意性の閾値をP < 0.05かつLDAスコア（log10） > 3とした。縦断的な差分的豊富さの解析には、患者個別のランダム切片を持つ混合効果モデルを適用し、次いでBenjamini-Hochberg法による偽発見率補正を用いたpost-hocのペア比較を行った。腸内細菌叢の特徴と臨床指標との関連性を評価するためにSpearmanの順位相関解析を用い、相関のP値にBenjamini–Hochberg法による偽発見率補正を適用した。両側P < 0.05を統計的に有意とした。相関解析およびタクサの豊富さの解析には多重比較補正を適用した。サンプルサイズが小さく、また縦断的な反復サンプリング設計であるため、統計解析は探索的なものとし、結果の解釈は慎重に行った。
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患者の選定およびベースライン特性
最終解析には、男性3名、女性3名を含む計6名のPD患者が組み込まれた。年齢の中央値は69.0歳（範囲：61～75歳）であり、ボディマス指数の中央値は22.6 kg/m2であった。コホートには、剛体優位が2名、振戦優位が2名、混合型の臨床表現型が2名含まれていた。ベースラインの臨床的特徴を表1に示す。
パーキンソン病（PD）の中・高度群と軽度群の間で、臨床的特徴に差異が認められた（表1）。この探索的コホートにおいて、総UPDRSスコアは、事前に定義された重症度分類と一致してFB_L群よりもFB_H群で高く、全体的な運動機能障害がより重度であることが示された。また、UPDRSサブスケール、PSQI、Wexner便秘スコア、ADLスケール、NMSSを含む、いくつかの運動および非運動臨床パラメータにおいても差異が観察された。これらの知見は、事前に定義された重症度サブグループが、運...
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FMTは、健康なドナーの糞便微生物叢をレシピエントの腸内に移植することで、腸内微生物のバランスを回復させる微生物叢ベースの介入法である14。腸内微生物叢が神経系の恒常性維持に重要な役割を果たしていることを示す根拠が増えている15。双方向の腸脳軸からの知見は、腸内微生物叢がPDにおける中枢神経系の炎症、神経伝達物質の代謝、および行動応答に影響を及ぼす可能性を示唆している16,17。そのため、微生物叢移植は潜在的な介入策として注目されているが、神経精神疾患および神経変性疾患への臨床応用は依然として探索的な段階にある18。本単施設レトロスペクティブ観察研究では、通常の臨床診療において糞便微生物叢移植（FMT）を受けたPD患者を対象に、臨床結果、安全性、および腸内微生物叢の探索的プロファイルを評価した。その結果、PDの重症度サブグループ間およびFMT後の経過時間において、腸内微生物の豊富...
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利益相反：著者らは利益相反がないことを宣言します。
本研究にご協力およびご支援をいただいたすべての共同研究者の皆様に感謝いたします。皆様のご協力と励ましは、私たちの研究にとって非常に貴重なものでした。
資金提供：本研究は、Jiangsu Provincial Key Program for Elderly Health (LKZ2022004) の助成を受けて行われました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MiSeqシステム | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | 16S rRNA V3に使用されるベンチトップ型ショートリードシーケンシングプラットフォーム–2つの（試薬/サンプル/プライマー等）を用いたV4アンプリコンシーケンス × 300 bp ペアエンド法。 |
| Metagenome@KIN | World Fusion株式会社 | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | 16S rRNAの分類学的割り当ておよび微生物コミュニティ解析に使用される市販ソフトウェア。 |
| 微生物同定データベース（細菌） | 株式会社テクノスルガラボラトリー | DB-BA、データベース v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | 微生物同定に使用される細菌16S rDNAリファレンスデータベース。 |
| 341Fプライマー | BGI Genomics Co., Ltd. | カスタムオリゴヌクレオチド；カタログ番号なし | フォワードプライマー配列：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| 805Rプライマー | BGI Genomics Co., Ltd. | カスタムオリゴヌクレオチド、カタログ番号なし | リバースプライマー配列：5'′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| 16S rRNA遺伝子シーケンシングサービス | BGI Genomics Co., Ltd.（中国、武漢） | 16S/18S-ITSシーケンシング BGIの16S/18S-ITSシーケンシングサービスは、細菌、古細菌、真菌などの微生物コミュニティの組成および多様性を解析するための包括的なソリューションを提供します。最新のシーケンシング技術を駆使して、環境サンプル、臨床検体、または複雑なバイオームにおける微生物叢の包括的なプロファイリングを可能にします。 サービス内容 16S rRNA遺伝子シーケンシング（細菌および古細菌） 16S rRNA遺伝子の可変領域を標的としたアンプリコンシーケンシングにより、細菌および古細菌の分類学的組成を同定し、多様性を解析します。 18S rRNAおよびITSシーケンシング（真菌および原生動物） 真菌の同定に標準的な内部転写スペーサー（ITS）領域および18S rRNA遺伝子を標的とし、真菌コミュニティおよび原生動物の組成を解析します。 技術的特徴 高精度なシーケンシング：BGIの高度なプラットフォームにより、高精度かつ深層的なリードを提供し、低存在量のタクソン（分類群）の検出を可能にします。 最適化されたパイプライン：サンプルの調製からデータ解析まで、最適化された標準ワークフローを採用し、一貫性と再現性を確保しています。 包括的なデータ解析：分類学的アノテーション、α多様性およびβ多様性の解析、およびコミュニティ構造の視覚化を含む詳細な解析レポートを提供します。 アプリケーション 環境微生物学：土壌、海水、淡水などの環境における微生物群集の変動を調査します。 臨床および医学研究：ヒトの腸内フローラや皮膚微生物叢などのホスト関連微生物叢と疾患の関連性を解析します。 農業および食品科学：作物の根圏微生物や食品の発酵過程における微生物組成の変化を追跡します。 生態学：生物種間の相互作用や、環境変化に伴う微生物コミュニティの遷移を研究します。 ワークフロー サンプル受領および品質チェック DNA抽出（オプション） 標的領域のPCR増幅およびライブラリ調製 高スループットシーケンシング データ処理およびバイオインフォマティクス解析 最終レポートの作成 | 商業的シーケンシングサービスプロバイダー；ライブラリ調製、シーケンシング、および初期品質管理を実施。 |
| Eppendorf Safe-Lock マイクロ遠心チューブ, Biopur, 1.5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | 分注して保存するための、糞便検体用滅菌ポリプロピレンチューブ −80 °C. |
| LEfSe | 瀬方研究室/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | 差分的に存在量が多いタクサおよび予測パスウェイを特定するために使用された、線形判別分析効果量（LEfSe）ソフトウェア。 |
| Tax4Fun2 | Tax4Fun2開発チーム | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | 16S rRNAデータからKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）の機能プロファイルを推定するために使用されるRパッケージ。 |
| microeco Rパッケージ | Chi Liu および共同研究者 | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | 微生物の豊度および多様性解析のためのコミュニティ生態学解析および可視化パッケージ。 |
| Rソフトウェア | R Foundation for Statistical Computing | バージョンは未報告；https://www.r-project.org/ | 臨床およびマイクロバイオーム解析に使用された統計計算環境。正確なバージョンについては、著者に確認すること。 |
| GenFMTer自動糞便微生物叢精製システム | 南京FMTMedical有限公司 | モデル：GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | 糞便微生物叢懸濁液の標準化された遠心分離、洗浄、および調製に使用される自動化システム。 |
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