方法論記事

遺伝子編集および体細胞核移植を用いた遺伝子組換え胚の作製によるヒト疾患モデル羊の生産

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DOI:

10.3791/72709

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2026年9月15日

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1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University

この記事について

サマリー

本稿では、ヒト疾患の羊モデルを作製するために、CRISPR-Cas9遺伝子編集と体細胞核移植を用いて遺伝子改変胚を作製する方法について説明します。このアプローチは、ドナー細胞における精密な遺伝子編集を行い、遺伝的モザイク現象のないクローン胚を作製するのに最適です。

要約

大型動物モデルは、ヒトの疾患を研究するための貴重なツールです。羊、豚、山羊は、ヒトの臓器の解剖学的・生理学的構造や疾患の複雑さをより正確に再現することが多く、そのためげっ歯類に比べて臨床的妥当性が高まります。CRISPR-Cas9および体細胞核移植（SCNT）を用いることで、より高い精度、汎用性、および遺伝的一様性を持つ大型動物モデルの作製が可能になります。接合子へのマイクロインジェクションと比較した本アプローチの主な利点は、動物を個体として作製する前に、目的の遺伝子改変および潜在的なオフターゲット変異が遺伝子編集細胞に存在するかどうかをin vitroで確認できる点にあります。さらに、SCNTは、接合子へのマイクロインジェクションで頻繁に発生する遺伝的モザイク現象を排除できます。本稿では、非相同末端結合（NHEJ）および相同組換え修復（HDR）による遺伝子編集羊細胞の作製と、それに続く目的の変異を持つクローン胚の作製について説明します。遺伝子改変は、培養体細胞（通常は胎児線維芽細胞）にCRISPR-Cas9システムをトランスフェクションすることで導入されます。プールされた細胞における変異効率は、編集済み遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびサンガーシーケンシングによって評価し、Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) または Tracking of Insertions, Deletions, and Recombination events (TIDER) ソフトウェアを用いて解析します。プールされた細胞の限界希釈を行い、単一細胞由来のコロニーを得て、編集済み遺伝子のPCRおよびDNAシーケンシングによるスクリーニングを行います。目的の編集が導入されたドナー細胞をその後増殖させ、SCNTによる胚作製に使用します。限界希釈と細胞スクリーニングの結果、NHEJで改変されたコロニーの22/114（19.3%）にノックアウト（KO）変異が含まれ、HDRで改変されたコロニーの4/56（7.1%）にF508del変異が含まれていました。4つのコロニーから計370個の遺伝子改変胚が作製されました。これらの手法は、胎児線維芽細胞における精密な遺伝子編集および遺伝子組み換え胚の作製に成功しており、ヒト疾患の羊モデルの作製に活用されます。

概要

動物モデルは、ヒト疾患の生物学的メカニズムの解明および新しい治療法の開発において不可欠なツールです。細胞培養やオルガノイド培養などのin vitroモデルでは、器官内でin vivo に起こる細胞サブタイプや細胞間相互作用の複雑さを再現することはできません1,2。そのため、動物を用いることで、細胞レベルおよびシステムレベルの相互作用、疾患の進行、および治療法の安全性をより詳細に把握できる個体全体のモデルを得ることができます。げっ歯類は、低コストであること、世代交代が早いこと、および遺伝学的特性が包括的に解明されていることから、実用的なモデル生物となります。しかし、ヒト疾患に対するげっ歯類モデルは、ヒトとの生理学的および解剖学的な相違に加え、代謝が速く寿命が短いという点に制限があります3,4。これは、動物モデルで検証された治療法のうち、臨床試験で失敗する割合が高いことに裏付けられており、その大部分にげっ歯類が使用されています5,6,7,8。ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、および非ヒト霊長類は、多種多様なヒト疾患のモデル作成に使用されており、これにより新しい治療法や医薬品の臨床へのトランスレーション率を高めることができる可能性があります3,9,10,11,12。これらの種は、ヒトとの類似性が高いため、げっ歯類モデルに比べて多くの利点があります。したがって、ヒト疾患に対する大型動物モデルは、利用可能な中で最も正確なモデルを提供し、動物実験を臨床応用に橋渡しする上で極めて重要な役割を果たしています。

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9は、動物細胞の遺伝子改変や、正確な疾患原因変異の導入に用いられる汎用性が高くプログラミング可能な手法である。CRISPR-Cas9による遺伝子編集では、標的部位に相補的なガイドRNA (gRNA) を用いることで、CRISPR関連タンパク質9 (Cas9) が標的部位に二本鎖切断 (DSB) を形成させる13。DSBの細胞内修復は、主に非相同末端結合 (NHEJ) と相同組換え修復 (HDR) という2つのメカニズムを通じて行われる。NHEJ経路はDNA末端を結合させることでDSBを修復するが、この機構はエラーが起こりやすく、切断部位にランダムな挿入または欠失 (indel) が形成されることがある14。これらの変異は、フレームシフト変異や早期終止コドンを生成して遺伝子の機能を破壊し、遺伝子をノックアウト (KO) する可能性がある。主に細胞周期のS期およびG2期に起こるHDRは、細胞が相同なアレルを修復テンプレートとして利用してDSBを修復する過程である15,16。目的の編集を含む合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド (ssODN) またはその他のテンプレートDNAを導入し、細胞にそれを修復に利用させることで、ノックイン (KI) と呼ばれる特定の挿入、欠失、または置換を取り入れることが可能である。また、CRISPR-Cas9は、多遺伝子疾患のモデル化のために複数の変異を一度に導入するマルチプレックス編集にも利用できる3。ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) や転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALEN) などの従来の遺伝子編集技術と比較して、CRISPR-Cas9は大動物の細胞においてより簡便でリソース効率が高く利用可能である17。新しいgRNAを設計することで異なる遺伝子座を容易に標的にできるため、CRISPR-Cas9を用いた新しい大動物モデルの導入が加速している3,13。しかしながら、種、細胞環境、および編集の内容によって大幅に変動しうるCRISPR-Cas9の編集効率など、いくつかの制限が依然として存在する18,19。特にHDRの効率はNHEJよりも低く、細胞種、ゲノム上の遺伝子座、および細胞周期の段階に大きく依存する20,21。さらに、オフターゲット部位、あるいはオンターゲット部位において意図しない編集が導入されることも課題となっている22。それでもなお、CRISPR-Cas9は遺伝子組換え大動物モデルを作製するための主要な遺伝子編集プラットフォームとなっている。

体細胞核移植（SCNT）は、高い精度と均質性を持った遺伝子改変胚の作製を可能にします。1997年に哺乳類で初めて成功したこのプロセスは、脱核した卵細胞に細胞核を移植するものです23。SCNTは、遺伝物質やDNA編集システムを接合子や初期胚に直接注入する接合子マイクロインジェクションなどの他の手法と比較して、多くの利点があります24,25,26。接合子マイクロインジェクションでは、遺伝子改変前にDNA複製や細胞分裂が起こると、胚内の細胞間に遺伝的な不均一性、すなわちモザイシズムが生じる固有のリスクがあります27,28,29。このようなモザイク胚は、ジェノタイピングや表現型解析が困難であるため、動物モデルとしての価値が低下します29。SCNTでは、遺伝子編集と胚の作製が切り離されています。各クローン胚は単一の細胞に由来するため、モザイシズムのリスクが排除され、胚が遺伝的に均質であることが保証されます30,31,32。さらに、ドナー細胞はSCNT処置の前にin vitroで編集され、クローナリティおよび目的の改変の有無が慎重にスクリーニングされるため、時間と資源を節約できます25,26。これは、特定のノックイン（KI）を導入する場合に特に重要です。また、細胞スクリーニングにより、オフターゲット部位における潜在的な変異を特定できるため、他の遺伝子座における遺伝子破壊のリスクを低減できます。これらの利点は、CRISPR-Cas9に関連する多くの懸念を解消します。したがって、SCNTは接合子マイクロインジェクションと比較して、得られる胚の遺伝学的制御能が高く、特にマルチプレックス編集、巨大挿入、ヒト化アレルなどの複雑な編集において有効です33。一方で、SCNTはクローニング効率の低さ、技術的要件、および異常なエピジェネティック再プログラミングという制約があります。後者はクローンにおける分子レベルおよび表現型の乱れを引き起こし、創始動物における遺伝子改変の影響を不明確にする可能性があります。しかし、これらのエピジェネティックな変化は次世代には継承されません32,33。これらの制限があるものの、SCNTとCRISPR-Cas9を組み合わせることで、胚の遺伝学を厳格に制御した精密なゲノムエンジニアリングが可能となり、モザイシズムのない大型動物疾患モデルの信頼性の高い作製がサポートされます。本稿では、NHEJまたはHDRを用いて羊胎児線維芽細胞（SFF）を遺伝子改変し、続いてSCNTによりクローン胚を作製して、最終的にヒト疾患の羊モデルを作製するための詳細なアプローチについて説明します。この手法は他の家畜種にも広く適用可能ですが、細胞型によって遺伝子編集の最適化が必要な場合があり、本プロトコルが有用な出発点となります。

プロトコル

すべての動物実験手順は、ユタ州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC：#15508および#10089）によって承認され、米国国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って実施された。本研究では、家畜種であるロムニー種羊（*Ovis aries*)を用いて、羊胎児線維芽細胞を単離した（補完ファイル 134）。参照してください。 図1 プロトコルの概要について。

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図1: 遺伝子組換え胚を生成するために用いられるCRISPR-Cas9およびSCNT法の概要。プロトコルの主要な7つのステップそれぞれの要約が描かれている。BioRenderを用いて作成。Perisse, I. (2026). こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

1. PCRプライマー、gRNA、およびテンプレートssODNの設計

  1. Benchling (https://www.benchling.com/academic) で、編集対象のゲノム領域を開きます。
  2. 目的のゲノム領域を増幅および配列決定するためのPCRプライマーを設計する。
    1. 増幅させる標的領域に加え、その上流および下流に200塩基対をハイライトしてください。これにより、クオリティの高いトレースコールを確保し、TIDEソフトウェアを用いて変異効率を正確に解析するための十分な距離を確保します。
    2. 右側のナビゲーションバーでクリックしてください プライマー > プライマーの作製 > ウィザード.
    3. 下 領域、クリック 選択を使用の下 アンプリコン、調整する サイズ それに応じて、必要に応じて他のパラメータを調整してください。
    4. クリック プライマーの設計ペナルティスコアが低いプライマーペアを1つまたは複数選択し、注文する。
      ​注：導入する編集内容に応じて、正しく編集されたDNAにのみ結合するプライマーを設計し、陽性コロニーをより迅速にスクリーニングすることを推奨します。
  3. CRISPR-Cas9を用いたDNA編集のためのgRNA設計
    1. Benchlingで編集対象となる領域をハイライトし、右側のナビゲーションバーにある［ ］をクリックします。 CRISPR > ガイドの設計と解析.
    2. をクリックしてください ゲノム ドロップダウンメニューからモデル生物のゲノムを選択またはインポートします。必要に応じてその他のパラメータを調整してください。
    3. クリック 完了 > +.
    4. 〜の下に ゲノム領域 クリック 地域未設定 そして、標的部位を含むゲノム領域を選択または入力します。「クリック」を選択してください。 ゲノム領域の設定.
    5. オンターゲットスコアとオフターゲットスコアの両方が高いガイドを1つ以上選択して注文してください。
  4. KI編集を行う場合は、ssODNテンプレートを設計してください。
    1. 右側のナビゲーションバーにある[ ]をクリックしてください。 CRISPR > HRテンプレートのデザイン（ssODN）).
    2. クリックしてください ゲノム ドロップダウンメニューからモデル生物のゲノムを選択またはインポートします。クリックして 作成.
    3. 以下をクリックしてください シーケンスマップ タブを押し、編集する塩基をハイライトし、キーボードで希望の編集内容を入力して、修正後のDNA配列を作成します。次に戻ります。 HRテンプレートの設計 タブを選択し、クリックする 次へ.
    4. 調整する テンプレート領域 編集部位の両側に少なくとも50塩基対のホモロジーアームを含め、その後クリックします。 次へ.
    5. ステップ 1.3.5 で選択した gRNA の配列を、以下に記入してください。 ガイド Protospacer隣接モチーフ（PAM）を破壊するサイレント変異を導入するためのボックス。クリック 次へ.
    6. クリック テンプレートをコピーする そして、作製したssODNテンプレートを注文する。
      注：ノックアウト（KO）変異またはF508del変異を有する羊嚢胞性線維症モデルを作製するためにBenchlingを用いて設計したPCRプライマー、CRISPR-Cas9 gRNA、およびテンプレートssODNの配列を以下に示す。 表 1.

2. 培地の調製

  1. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) high Glucoseに15% 胎児牛血清 (FBS) および1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Pen/Strep) (v/v) を添加して、細胞培養培地を調製する。使用前に37 °Cのウォーターバスで予熱しておく。
  2. DMEMに45% FBSおよび10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を添加して、凍結培地を調製する。
  3. M199培地に1% Pen/Strep、0.3% 牛血清アルブミン (BSA) fraction V、1% FBS、および0.06% ヘパリンナトリウム塩を添加して、卵母細胞回収培地を調製する。
  4. 市販されている、それぞれウシ卵母細胞の成熟および胚培養用に処方された無血清培地である In Vitro Maturation (IVM) および In Vitro Culture (IVC) 培地を用意する。
    注：融合後およびIVC用ディッシュは、IVC培地を40 µLずつ7滴滴下し、胚テスト済みミネラルオイルで覆って調製する。
  5. DMEM high Glucoseに0.5% FBSおよび1% Pen/Strep (v/v) を添加して、細胞飢餓培地を調製する。使用前に37 °Cのウォーターバスで予熱しておく。
  6. 既報35に従い、HEPES添加合成卵管液 (HSOF) 培地を調製する。
  7. 500 µLのHSOF培地に4.5 mM ショ糖および10 µg/mL シトカラシンB (CB) を添加して、脱核培地を調製する。
  8. 500 µLのHSOF培地に10 µg/mL シトカラシンB (CB) を添加して、注入培地を調製する。
    注：脱核培地および注入培地は、SCNTの当日に調製して使用する。各培地を1滴 (200 µL) ずつ100 mmディッシュに分注し、胚テスト済みミネラルオイルで覆う。
  9. 既報35に従い、融合培地を調製する。4 °Cで保存していた融合培地を5–10 mL取り出し、使用時まで室温に置いておく。
  10. IVC培地に10 µg/mL CBを添加して、CB培地を調製する。
    注：CB用ディッシュは、CB培地を40 µLずつ7滴滴下し、胚テスト済みミネラルオイルで覆って調製する。
  11. HSOF培地に5 µM イオノマイシンカルシウム塩を添加して、イオノマイシン培地を調製する。
  12. IVC培地に2 mM 6-ジメチルアミノプリン (DMAP) および10 µg/mL シクロヘキシミド (CHX) を添加して、活性化培地を調製する。
    注：活性化用ディッシュは、活性化培地を40 µLずつ7滴滴下し、胚テスト済みミネラルオイルで覆って調製する。

3. SFFへのCRISPR-Cas9の導入

  1. （条件）すべての細胞培養操作は、バイオセーフティキャビネットまたはラミナーフローフード内で行う。導入前のT-25フラスコ内で、細胞培養培地を用いて37 °C、5% CO2、5% O2、90% N2の条件下で、SFFが約70%–80%コンフルエントになるまで培養する。
  2. フラスコからすべての培地を除去し、5 mLのDulbecco’sリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で細胞を1回洗浄する。1 mLのトリプシン様解離酵素を加え、細胞が解離するまで5–10分間インキュベートする。
  3. 等量の細胞培養培地を用いてトリプシン様解離酵素を希釈し、細胞を200 × gで5分間遠心分離する。
  4. （タイミング）100 µMのgRNA 2.5 µLと5 µg/µLのCas9タンパク質2.5 µLを混合し、室温で10分間インキュベートしてgRNA: Cas9リボ核タンパク質（RNP）複合体を調製する。
    注：Cas9 RNP: gRNAの比率は、細胞型、標的遺伝子、および標的数に応じて最適化が必要な場合がある。
  5. 82 µLのニュークロフェクション溶液と18 µLのサプリメント溶液を混合し、ニュークロフェクション溶液を調製する。
  6. ニュークロフェクション溶液とRNP複合体を混合し、ssODNを使用する場合は200 µMのssODNを2 µL加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。
  7. 遠心分離後、上清を慎重に除き、チューブを糸くずの出ないティッシュの上に逆さまに置いて残留培地を除去する。
    注：残留した培養培地は、導入効率や細胞生存率に影響を及ぼす可能性がある。細胞ペレットをニュークロフェクション溶液で再懸濁する前に、余分な液体を完全に除去しておくこと。
  8. （重要）線維芽細胞をニュークロフェクション溶液で再懸濁し、気泡が入らないように混合液を100 µLニュークロキュベットに移す。ニュークロキュベットを硬い表面で軽く叩き、混合液をキュベットの底に集める。
    注：ニュークロキュベット内の気泡は、エレクトロポレーションを妨げる可能性がある。
  9. （関連設定）プログラムEH-100、またはメーカーの推奨に従って細胞にエレクトロポレーションを行う。室温で10分間、細胞を回復させる。
  10. エレクトロポレーションした細胞を転送ピペットを用いて、HDRエンハンサーを最終濃度1–2 µMとなるように添加し、あらかじめ平衡化した5 mLの細胞培養培地に移す。なお、他の細胞型では最適化が必要な場合がある。
  11. （条件）ゲノムDNAの単離前に、細胞培養培地を用いて37 °C、5% CO2、5% O2、90% N2の条件下で48時間、細胞を培養する。
  12. 細胞から培地を除去し、DPBSで1回洗浄した後、1 mLのトリプシン様解離酵素を加える。
  13. 細胞が剥離した後、1 mLの細胞培養培地を加えてトリプシン様解離酵素を希釈する。
  14. 細胞懸濁液の約3分の2を凍結保存用に、3分の1をゲノムDNA抽出用に、ラベル付きの1.5 mLチューブに分注する。すべてのチューブを200 × gで5分間遠心分離する。
  15. 凍結保存用の細胞ペレットを500 µLの凍結培地で再懸濁する。再懸濁した細胞をクライオバイアルに移し、-80 °Cのプログラムフリーザーに入れ、-80 °Cへ移すまで細胞が凍結培地にさらされる時間を最小限にする。
  16. DNA抽出用の細胞ペレットを200 µLのDPBSで再懸濁する。メーカーの指示に従い、ゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出する。

4. ゲノム編集効率の解析

  1. 高忠実度DNAポリメラーゼと事前に設計したPCRプライマーを用いて、単離したDNAから標的遺伝子座を増幅させる。
  2. 1%アガロースゲルを用い、1 kb DNAラダーとともにアガロースゲル電気泳動を行うことで、PCR増幅を確認する。
  3. PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、サンガーシーケンシングに提出する。
  4. KO（ノックアウト）を行った場合は、TIDEソフトウェア（https://apps.datacurators.nl/tide）を使用して編集効率を評価してください。36正確な編集効率分析を行うため、バックグラウンド信号を最小限に抑えた高品質なクロマトグラムを使用してください。
    1. TIDEを開き、サンプルに名前を付けてください。 タイトルプロット ボックス。下 ガイド配列、 使用したgRNAの配列を入力してください。
    2. 以下に コントロール試料クロマトグラム クリック 閲覧 そして、編集されていないコントロールサンプルのクロマトグラムをアップロードしてください。
    3. 下 テストサンプルクロマトグラム クリック 閲覧 そして、編集したテストサンプルのクロマトグラムをアップロードしてください。
    4. ～へ移動してください 分解 インデルスペクトルおよび変異効率を表示するためのタブ。Rの確認。2 indelスペクトルの右上の値。
    5. もしRが2 値が0.9未満である場合は、以下を確認してください。 詳細設定 下部のボックス パラメーター そして、アライメントウィンドウ、デコンボリューションウィンドウ、およびインデルサイズのスライダーを、Rがになるまで調整します。2 値が0.9を超え、適切なアライメントが達成されている。
  5. KI（ノックイン）を実施した場合は、TIDERソフトウェア（https://apps.datacurators.nl/tider）を使用して編集効率を評価してください。37.
    1. TIDERを開きます。サンプルに名前を付けます。 タイトルプロット ボックス。下。 ガイド配列 使用したgRNAの配列を入力してください。
    2. 下 コントロール試料クロマトグラム クリック 閲覧 そして、編集されていないコントロールサンプルのクロマトグラムをアップロードしてください。
    3. 下 参照クロマトグラム クリック 閲覧 そして、目的の編集が導入された参照サンプルのクロマトグラムをアップロードします。
      注：そのような配列が存在しない場合は、DNA配列に変異を導入するように設計した追加のプライマーを用い、PCR増幅によって生成することができる。38.
    4. 下部 テスト試料クロマトグラム クリック 閲覧 そして、編集したテストサンプルのクロマトグラムをアップロードしてください。
    5. ～へ移動してください 分解 indelスペクトラム、変異効率、およびHDR効率を確認するためのタブを表示してください。Rを確認してください。2 インデルスペクトルの右上の値。
    6. もしRが2 値が0.9未満である場合は、以下を確認してください。 詳細設定 下部のボックス パラメータ アライメントウィンドウ、デコンポジションウィンドウ、ブレイクサイトからの上流距離、およびインデルサイズのスライダーを調整し、Rが2 値が0.9を超え、適切なアライメントが達成されている。
      注：（重要）ファイルのシーケンシング品質が低い場合は、再シーケンシングが必要となる可能性があります。

5. 単一細胞コロニーの分離およびスクリーニング

  1. （条件）トランスフェクションしたSFFをT-25フラスコで一晩解凍し、以下の条件で培養する。 37 °C 5% CO含有2, 5% O22、および90% N2, または、細胞が約80%のコンフルエンスに達するまで。
  2. 培地を除去し、5 mLのDPBSで細胞を1回洗浄した後、1 mLのトリプシン様解離酵素を用いて細胞を解離させる。
  3. 細胞培養培地を加えてトリプシン様解離酵素を希釈し、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移す。細胞を200で遠心分離する。 × g 5分間。
  4. 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの細胞培養培地で再懸濁する。穏やかに、かつ十分に混ぜ合わせ、均一な単一細胞懸濁液とする。
  5. （重要）細胞懸濁液を1:10に希釈し、トリパンブルーを用いてヘモサイトメーターで細胞数を計測する。
  6. 1ウェルあたり約1細胞を播種するために必要な希釈細胞懸濁液の量を算出してください。
    注意：96ウェルプレート5枚分として、約500個の細胞を準備してください。
  7. 50 mLコニカルチューブに、96ウェルプレート1枚あたり10 mLの細胞培養培地を調製します。
  8. 計算した量の10倍希釈細胞懸濁液を培地に加え、穏やかなピペッティングと転倒混和によって十分に混ぜ合わせる。
  9. 希釈した細胞懸濁液を滅菌済みの試薬リザーバーに注ぎます。
  10. 分注する 100 µL 細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。
  11. （条件）プレートを以下の条件でインキュベートする。 37 °C 5% CO中で2, 5% O22、および90% N2 5日間。
  12. 各ウェルを顕微鏡下で観察し、コロニーが1つ含まれるウェルに印を付ける。コロニーが2つ以上含まれるウェルは除外する。
    注：単一細胞由来のコロニーは、通常、円形でコンパクトであり、形態学的に均一です。
  13. プレートをインキュベーターに戻し、同じ条件下でさらに2日間培養する。
  14. 96ウェルプレートで合計7日間培養した後、単一のコロニーが成長しているウェルから培地を除去する。選択した各ウェルをDPBSで1回洗浄する。
  15. 追加 100 µL 選択した各ウェルにトリプシン様解離酵素を添加し、細胞が剥離するまでインキュベートする。次に、 100 µL トリプシン様解離酵素を希釈するため、各ウェルに細胞培養液を添加します。
  16. 各ウェルの全量を、24ウェルプレートの1つのウェルに移行します。
  17. 元の96ウェルプレートを細胞培養液でさらに洗浄し、その洗浄液を対応する24ウェルプレートのウェルに移して、細胞の回収率を最大化します。各24ウェルプレートのウェルの最終液量を、以下の量まで調整します。 500 µL 細胞培養培地を用いて。
  18. （条件）24ウェルプレートを以下の条件でインキュベートする： 37 °C 5% CO条件下で2, 5% O22、および90% N2 3日間。
  19. 顕微鏡下でウェルを確認し、コンフルエンスに近いコロニーを選択する。
  20. 回収用に選択したウェルから培地を除去し、DPBSで1回洗浄した後、以下を添加する。 500 µL トリプシン様解離酵素の。
  21. 細胞が剥離した後、1 mLの細胞培養液を加えてトリプシン様解離酵素を希釈します。
  22. ステップ3.14～3.16に従って、細胞を凍結し、ゲノムDNAを単離する。
  23. PCRにより標的部位を増幅し、サンガーシーケンシングによって遺伝子型を確認する。
  24. シーケンシングの結果に基づき、野生型、KO、およびKIコロニーを特定します。ステップ4.4および4.5で述べられているTIDE/TIDER解析を用いてHDR率およびインデルスペクトラムを推定し、正しい編集が行われたかの検証および、単一細胞由来ではないコロニーの特定を行います。
    注：このステップでオフターゲット解析を行うことも可能です（補足ファイル 1).
  25. 下流のSCNT実験に使用するため、目的の遺伝子型を持ち、かつ正常な細胞形態を示すコロニーのみを拡大培養する。

6. ヒツジ卵母細胞の回収およびin vitro成熟

  1. 地元の屠畜場から羊の卵巣を回収し、回収後4時間以内に0.9%生理食塩水を用いて25 °Cで研究室まで運搬する。
  2. 卵子をin vitroで成熟させる。
    1. 卵巣を卵子回収培地中に浸し、メスで卵巣表面を切断して、卵丘細胞-卵細胞複合体（COC）を放出させる。
    2. （タイミング）1〜3層の密集した卵丘細胞と均一な細胞質を持つCOCをIVM用に選択する。COCを新鮮な卵子回収培地で洗浄し、あらかじめ平衡化したIVM培地で培養する。4ウェルプレートの各ウェル（IVM培地500 µL）あたり最大40個のCOCを加え、38.5 °C、5% CO2条件下で21〜22時間インキュベートする。
  3. 卵子の成熟度を確認する。
    1. 200 µLピペットを用いて必要な数のCOCを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、同量（1:1）の0.6 mg/mLヒアルロニダーゼをチューブに加える。
    2. すべての卵丘細胞が除去されるまで、混合液をピぺッティングする。卵子を1 mLのHSOFドロップに移し、さらに3回、HSOFドロップで洗浄する。
    3. マウスピペットまたは10 µLピペットとチップを用い、実体顕微鏡下で卵子を転がしながら、極体を持つ卵子を選択する。許容される極体放出率は50%〜80%である。

7. 体細胞核移植

  1. SCNT前のドナー細胞の調製。
    1. SCNTの3～5日前に、凍結保存細胞を37 °Cの水浴で1～2分間、チューブ内に氷がなくなるまで融解させる。
    2. 細胞懸濁液を取り出し、等量の細胞培養培地を15 mL遠心チューブに加え、406 x gで5分間遠心分離する。
    3. 上清を除去し、細胞ペレットを500 µLの細胞培養培地で再懸濁する。
    4. (条件) 細胞をさまざまな濃度で4ウェルディッシュに播種し、1ウェルあたり最終容量500 µLとし、37 °C、5% CO2、5% O2、90% N2の条件下で培養する。
    5. 細胞培養培地を48時間ごとに交換する。細胞が完全にコンフルエントに達した後、SCNTの24時間～48時間前に細胞飢餓培地に交換する。
      ​注：48時間を超える細胞飢餓は、アポトーシスの割合を増加させる可能性がある39,40。
  2. ドナー細胞の調製（SCNT当日）。
    1. ウェルから飢餓培地を除去し、500 µLのDPBS (-)で1回洗浄する。
    2. 250 µLのトリプシン様解離酵素を加え、37 °Cで5分間、または細胞がディッシュから剥離するまでインキュベートする。
    3. 500 µLの細胞培養培地を加え、トリプシン様解離酵素を希釈する。
    4. 細胞を15 mL遠心チューブに移し、406 x g で5分間遠心分離する。
    5. 上清を除去し、細胞を60～80 µLのHSOF培地で再懸濁し、使用まで4 °Cで保持する。
  3. 卵母細胞の脱核。
    1. マイクロピペットプラーで薄壁ガラスキャピラリーを引き、マイクロフォージで成形して、内径30 µm、外径100 µmのホールディングピペットを作製する。
      注：両方のピペットは市販のサプライヤーから購入することも可能である。
    2. マイクロピペットプラーで薄壁ガラスキャピラリーを引き、マイクログラインダーで45°の角度にベベル加工し、マイクロフォージで成形して内径20～25 µmの注入ピペットを作製する。マイクロピペットプラー、マイクロフォージ、およびマイクログラインダーのパラメータは、以前の報告41に記載されている。
    3. 極体が見られる第二減数分裂中期（MII）期の卵母細胞を、脱核培地の液滴に移動させる。極体が4～5時の位置にある状態で、ホールディングピペットを用いて卵母細胞を固定する。
      ​注：マイクロマニピュレーションの標準操作手順については、以前の報告41を参照されたい。
    4. (重要) 先端が鋭いベベル状の注入ピペットを用いて透明帯を貫通し、極体およびその直下の細胞質の10%～20%を吸引する。
    5. 除去した細胞質を液滴内に押し出し、ホールディングピペットから卵母細胞を離す。
    6. すべての卵母細胞が脱核されるまで、ステップ7.3.2～7.3.4を繰り返す。脱核後の卵母細胞をIVM培地に戻し、38.5 °C、5% CO2で30分間インキュベートする。
  4. 脱核卵母細胞へのドナー細胞の注入。
    1. 調製した細胞懸濁液を注入培地液滴の底部に加え、脱核卵母細胞を同じ液滴に移動させる。
    2. 円形で健康な細胞を1～10個選び、注入ピペットで吸引する。
    3. ホールディングピペットで卵母細胞を固定し、注入ピペットで透明帯を貫通させ、透明帯と卵細胞質（ooplasm）の間に細胞を1個配置する。
    4. すべての脱核卵母細胞に対してステップ7.4.2～7.4.3を繰り返し、細胞融合の前に35 mmディッシュ内の2～3 mLのHSOF培地に移動させる。
  5. 脱核卵母細胞とドナー細胞の融合。
    1. 電気融合パルスジェネレーターのケーブルをマイクロスライドチャンバー（0.5 mm）の電極線に接続し、チャンバーを顕微鏡ステージ上に配置する。
    2. チャンバーに600 µLの融合培地を加える。
    3. (重要/関連設定) ドナー細胞が6時または12時の位置にくるように、チャンバーの2本の電極線の間に4～6組の細胞質-細胞ペアを整列させる。2.0 kV/cmのDC電気融合パルスを40 µsで2回印加する。
    4. 細胞質-細胞ペアを融合チャンバーから取り出し、2～3 mLのHSOF培地を含む新しい35 mmディッシュに保持する。
    5. (条件) すべての注入卵母細胞が融合プロセスを完了するまで、ステップ7.5.3～7.5.4を繰り返す。融合後のディッシュでカップレットを洗浄し、38.5 °C、5% CO2、5% O2、90% N2で30分間インキュベートする。チャンバー内の融合培地は15～20分ごとに交換する。
  6. 胚の活性化および培養。
    1. (条件) 融合の30分後、すべての融合胚をまずCB培地中で38.5 °C、5% CO2、5% O2、90% N2で45分間インキュベートする。
    2. その後、HSOFで希釈した5 µM ionomycin中でカップレットを5分間活性化し、続いて活性化培地で4時間インキュベートする。
      注：Ionomycin培地は使用直前に調製すること。正期産までの発生を改善するため、成熟後24～26時間に活性化を行うことが推奨される。
    3. (条件) 活性化後、再構成胚を洗浄し、IVC培地中で、40 µLの液滴あたり最大40個の胚を、38.5 °C、5% CO2、5% O2、90% N2で一晩または胚移植まで培養する。

結果

プロトコルの主要な手順は、以下にまとめられています。 図1我々はCRISPR-Cas9と体細胞核移植（SCNT）を用い、非相同末端結合（NHEJ）によるノックアウト（KO）インデル変異、または相同組換え修復（HDR）によるF508del変異のいずれかを有する嚢性線維症（CF）の羊モデルを作製した。これらの結果の一部は、既報である。42,43私たちは、Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)のエキソン11を標的とするため、両方の戦略に向けたgRNAおよびPCRプライマーを設計しました。CFTR（囊胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子）羊のGenBank配列（NC_019461.2.0）に基づいた遺伝子。また、ヒト患者における嚢胞性線維症（CF）の原因となる最も一般的な変異である3塩基欠損のF508del変異をノックイン（KI）するためのssODNも設計した。 図2A のエクソン11を示す CFTR（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子） および、gRNA、PCRプライマー、変異の相対的な位置を含む、KOおよびKI両方のターゲティング戦略。SFFは、まずオスおよびメスの国内産ロムニー種の羊から単離された（O. アリエス妊娠45日目の胎児。KO（ノックアウト）を目的としたgRNA 1によるトランスフェクション。 嚢胞性線維症膜貫通調節因子 その後、既報の手法に従い、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9プラスミド（Addgeneプラスミド 42230）をエレクトロポレーションすることで実施した。43CRISPR-Cas9 RNPのトランスフェクション：F508del変異のノックイン（KI）のため、gRNA 2およびssODN 1を含むgRNA複合体のエレクトロポレーションを行った。TIDE解析の結果、プール内の細胞の46.9%に3ヌクレオチド（nt）の欠損が含まれていることが判明し、R2 0.96であり。インデルスペクトラムおよび推定効率を以下に示す。 図2B限界希釈法を用いて、計170個の単一細胞由来コロニーを単離し、PCRおよびサンガーシーケンシングによるスクリーニングを行った。ssODNを用いないトランスフェクションから単離されたコロニーは114個であり、そのうち22個（19.3%）にKO変異が認められた。F508del変異を持つssODNをトランスフェクションして作製されたコロニーは56個であり、そのうち4個（7.1%）がF508delのホモ接合体であった。KO変異を持つ2つのコロニーが選出され、〜を作製するためのドナー細胞として使用された。 囊胞性線維症膜貫通調節因子（CFTR）-/- SCNTにより胚を作製した。KO変異はそれぞれ2塩基および7塩基の欠失であった。これらのコロニーから得られたサンガーシーケンシングの結果を以下に示す。 図2CF508del変異を持つ2つのコロニーを選択し、作製した。 嚢胞性線維症膜透過性調節因子（CFTR）F508del/F508del 胚、およびそれらのサンガーシーケンシングの結果を以下に示す。 図2D計370個の胚が得られ、そのうち233個はKO変異を、137個はF508del変異を含んでいた（表2）。～のために in vitro 発生過程において、羊のSCNT胚の胚盤胞形成率は約10%～15%であった。このプロトコルは、～を編集するために正常に導入された。 CFTR（嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子） SFFにおける遺伝子を導入し、羊のCFモデル作製のための胚を産生する。

figure-results-1
図2の作製 嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子 -/- およびCFTRF508del/F508del SFF細胞 (A) [名称] のエクソン11の概略図 嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子 NHEJを用いてKO変異を導入するための遺伝子およびCRISPR-Cas9ターゲット部位（左）、およびHDRを用いてKI F508del変異を導入するためのターゲット部位（右）。矢印は、エクソン11を増幅するために使用したフォワードおよびリバースプライマー1（青）ならびにフォワードおよびリバースプライマー2（ピンク）を示す。B) Cas9: gRNA 2およびF508del変異導入用のssODN1をトランスフェクトしたプール細胞のサンガーシーケンシングデータに基づいた、インデルスペクトラムと推定される全般的な編集効率を示すグラフ。これらの細胞における3 nt欠損率は46.9%であり、これはF508del変異に相当し、R2 0.96の（CランダムなバイアレリックKO変異を含む細胞コロニーCF19FおよびCF49のサンガーシーケンス結果。両コロニーともに短い欠失（CF19Fは-2 nt、CF49は-7 nt）を有している。D) 「CTT」が欠損したF508del変異を持つ細胞コロニーのサンガーシーケンシング結果。BioRenderにて作成。Perisse, I. (2026) https://BioRender.com/v74agcd. こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

名称突然変異シーケンス
フォワードプライマー1ノックアウトGCATAGCAGCATACCCAA
リバースプライマー1ノックアウトGTAACCAAACCAGCCCAC
gRNA 1ノックアウトGGGAGAATTGGAACCTTCAG
フォワードプライマー2F508delTGAACTCAGCACCCCATCTCTG
リバースプライマー2F508delTGCAGGCTTCTTATAGCAGGGG
gRNA 2F508delATTAAAGATAACATCATCTT
ssODN 1F508delT*G*CTCTCAGTATTCCTGGATCATG
CCTGGAACCATTAAAGATAACATCA
TTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGA
TATAGGAGTGTCATCAAAGCATG*C*C

表1：設計したオリゴヌクレオチドの配列。Benchlingで設計し、KO変異またはF508del変異を含む羊嚢胞性線維症モデルの作製に使用したPCRプライマー、CRISPR-Cas9 gRNA、およびテンプレートssODNの配列。「*」はホスホロチオエート修飾を示す。

コロニー遺伝子型胚数
CF19F-/-134
CF49-/-99
Fd78F508del/F508del110
Fd92F508del/F508del27
合計370

表2：ドナー細胞として使用したコロニーおよび作製した胚の概要 合計4つのコロニーを用いて、〜に突然変異を持つ370個の胚を作製した。 CFTR（嚢胞性線維症膜貫通調節因子） 遺伝子。2つのコロニーにはKO変異が含まれており、別の2つのコロニーにはF508del KI変異が含まれていた。CF19Fは女性細胞株由来であるが、それ以外のすべてのコロニーは男性細胞由来である。

補足ファイル 1：羊胎児線維芽細胞の単離およびオフターゲット解析のプロトコル。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本手順において、効果的なプライマー、gRNA、およびssODNの設計は、遺伝子編集を成功させるために極めて重要です。これらの分子の結合が不十分な場合、遺伝子編集や目的のコロニーの同定が妨げられ、SCNTへの移行が困難になります。単一細胞コロニーの分離に進む前に、テストと最適化のために各配列の複数のバリエーションを購入することを推奨します。線維芽細胞におけるKOのためのCas9プラスミドのトランスフェクションは、通常、編集効率が不十分となるため、より高い効率（70%–90%）を得るにはCas9 RNPの使用が推奨されます44,45,46。限界希釈が適切に行われれば、KOを持つコロニーの割合は同様になるはずです。KIの期待編集効率は、導入される編集の種類に大きく依存します。我々の経験では、欠失は通常、挿入や置換よりも効率的です。したがって、限界希釈後のKI変異を持つコロニーの割合も変動します。我々の結果では、F508del変異を含むコロニーの割合（7.1%）は推定編集率（46.9%）よりも大幅に低く、これは理想的ではありません。単一細胞由来のコロニーにおける正解の編集率が低くても、多くの胚を産生することは可能です。しかし、有用なコロニーの割合が高いほど、時間とリソースを少なくて済むため、最適化が重要になります。遺伝子編集効率が低い場合のトラブルシューティングとしては、エレクトロポレーション中にキュベット内に気泡がないことを確認し、タイトレーションによってCas9:gRNA比を最適化し、代替のgRNAまたはssODNをテストしてください。さらに、プラスミドの導入は編集効率が低くなることが結果で示されているため、編集効率を高めるにはCas9 RNPの使用が重要です43。限界希釈中の生存率やコロニーの増殖が不良な場合は、培地中の血清濃度の向上、成長因子サプリメントの添加、または播種密度の調整を検討してください。播種前に正確な細胞計数を行い、細胞懸濁液を十分に混ぜ合わせてください。

動物モデルを作製するための有用なツールであるSCNT技術には、発生結果に影響を及ぼし得るいくつかの重要なステップが含まれています。まず、ほとんどの羊の品種は季節繁殖動物であるため、卵母細胞の品質は通常、ドナーの年齢や季節の影響を受けます。しかし、私たちの以前の結果では、屠殺場由来の思春期前の羊から卵巣/卵母細胞を回収した場合、季節はin vitroでの胚発生に影響を与えないことが示されました47。さらに、成体の卵母細胞を使用した場合、in vivoでの発生は思春期前の卵母細胞で観察されたものと同等でした35。羊のSCNT胚における活性化時間は、満期発生にとって極めて重要です。成熟後24～26時間という早いタイミングでの活性化は、早期妊娠損失を減少させ、満期発生率を向上させることが示されています35。これは、早期活性化に伴う成熟促進因子（MPF）が高濃度の環境が、体細胞核の早前染色体凝縮（PCC）の割合を高め、それがリプログラミングに有益であると考えられていることに関連している可能性があります48。

CRISPR-Cas9は、その汎用性、プログラム可能性、および簡便さにより、他の遺伝子編集技術に対して多くの利点があります17。強力である一方で、制限も存在します。CRISPR-Cas9の編集効率とオフターゲット活性は、種、細胞型、ゲノム領域、gRNAの設計、および目的とする編集内容によって異なり、効率は多くの場合、げっ歯類またはヒト細胞向けに最適化されています18,49。さらに、SpCas9の伝統的なNGG PAMを用いては、すべての編集部位を標的にできるわけではありません。これらの制限を克服するために、gRNA設計の最適化やCas9のRNP導入など、多くの戦略が存在します50。また、これらの制限に対処するため、より高い編集活性、より優れた忠実度、およびより広い標的範囲を持つ多数のCasヌクレアーゼ変異体が発見または作製されています。さらに、塩基編集装置（base editors）、プライム編集装置（prime editors）、およびリコンビナーゼベースの編集装置を含む、いくつかの代替ゲノム編集システムが開発されており、その多くはCRISPR誘導タンパク質に依存しています50。リコンビナーゼ編集は、特に大きな挿入物を導入する場合に有用です。本プロトコルにおいて編集結果を向上させるために、これらの戦略のいずれかを採用できる可能性があります。

接合子へのマイクロインジェクションと比較して、SCNTでは胚作製前にドナー細胞をin vitroでスクリーニングして、クローナリティならびにオンターゲットおよびオフターゲット変異を確認できるため、胚の遺伝学的制御をより高度に行うことが可能です。これにより、目的とする遺伝子改変が確認され、得られる胚におけるモザイク現象のリスクを排除できます24,25,26。特に、高MPF条件下では、G0/G1期のドナー核はより正常なDNA複製を伴うPCCを起こしますが、S期およびG2期のドナー核はDNA損傷や染色体異常を起こしやすいことが知られています51,52。したがって、リプログラミングを成功させるには、ドナー細胞と受容細胞の細胞周期期の同調が不可欠です。加えて、IVMおよびIVC培地がSCNT胚の発達に影響を及ぼす可能性があります。牛や羊のin vitro受精胚およびSCNT胚では、しばしば大型子症候群（LOS）が発生します。寄与因子の一つとして、卵母細胞成熟培地および胚培養培地に含まれる血清の存在が考えられます。そのため、無血清培地を使用することで、羊のSCNT動物作製におけるLOSの発生率を低下させ、SCNTの全体的な効率を向上させられる可能性があります。エピジェネティックなリプログラミングを調節することでクローニング効率を改善するいくつかの戦略が開発されていますが53、SCNTは依然として、低い効率、高コスト、特殊な設備、胚操作における技術的専門知識、および多数の受容動物が必要であるという点に制約されています。これらの戦略には、エピゲノム修飾薬や、DNAメチル化、ヒストン修飾、またはX染色体不活性化を制御するエピジェネティック調節因子のノックダウンが含まれます。これらの結果をマウスから家畜種へ応用できた例は限られていますが、いくつかの手法はブタやヤギにおけるクローニング効率の向上に利用されています54,55,56,57}

それにもかかわらず、CRISPR-Cas9とSCNTは、遺伝子改変胚を作製するための効果的な手法の組み合わせである。CRISPR-Cas9はZFNやTALENよりも簡便でプログラミングが容易であるため、遺伝子編集の分野で主流となっている。SCNTは、核移植前に遺伝学的スクリーニングを可能にし、モザイク現象のリスクを排除することで、胚作製の精度を高める。動物疾患モデル以外にも、この手法は農業や生物医学において幅広い応用が可能である。家畜においては、抗病性、耐候性、および生産形質の向上に利用できる25,58。さらに、ヒトへの異種移植に向けた免疫工学的臓器を動物に成長させたり、医療用または工業用の有用な抗体、酵素、治療用タンパク質を産生するバイオリアクターとして活用したりする可能性もある33,59。要約すると、CRISPR-Cas9とSCNTは、正確で多目的なゲノム編集と胚の遺伝学的な厳密な制御を組み合わせることで、ヒト疾患の大動物モデルを作製することを可能にする強力なアプローチである。

開示事項

著者は、科学出版社によって認められている利用方法に基づき、原稿の言語および読みやすさを向上させるためにGrammarly (Grammarly Inc.) および ChatGPT (OpenAI) を使用しました。これらのツールは、本提案における独自のテキスト、研究コンセプト、データ、画像、または図の生成には使用されていません。これらのツールを使用した後、著者は必要に応じて内容をレビューおよび編集し、本内容について全責任を負います。

謝辞

本研究は、ユタ農業試験場（UTAO1328）および嚢胞性線維症財団（助成金 POLEJA23PO）から一部支援を受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 kb DNAラダーThermo Fisher ScientificSM0313DNAサイズマーカー
15 mL遠心チューブThermo Fisher Scientific12-565-269
1.5 mLマイクロ遠心チューブThermo Fisher Scientific05-408-129
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D-Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
4ウェルディッシュNunc144444
50 mL遠心チューブThermo Fisher Scientific12-565-270
6-DMAPSigma-AldrichD2629
24ウェルプレートCorning3524細胞増殖
96ウェルプレートCorning3596単一細胞コロニー分離
アガロースThermo Fisher ScientificBP160-100アガロースゲル電気泳動
ビーカー (250 mL)Kimble14000-250
BenchlingソフトウェアBenchlinghttps://www.benchling.com/academic配列アライメントおよび解析
IVC培地IVF Bioscience71005
IVM培地IVF Bioscience71001
BSAGold BioA-421-250
BTX ECMBTXECM-200装置（製造中止）
BTXマイクロスライドチャンバーBTX450103
Cas9タンパク質Integrated DNA TechnologiesCustomCRISPR-Cas9ゲノム編集
グルコン酸クロルヘキシジン (2%)Aspen Vet11584915
CHXSigma-AldrichC7698
CRISPORソフトウェアCRISPORhttps://crispor.gi.ucsc.edu/オフターゲット予測ソフトウェア
クライオバイアルThermo Fisher Scientific12-565-163N
サイトカラシン BSigma-AldrichC6762
ジメチルスルホキシドFisher ScientificBP231-100凍結保存試薬
DMEM 高グルコースCytivaSH30022線維芽細胞培養培地
DNA精製キットThermo Fisher ScientificK0781全血ゲノムDNA精製
DPBS (Ca/Mg不含)CytivaSH30256細胞および組織の洗浄に使用
エタノールPharco111000200CSGL
胎児牛血清CytivaSH30396細胞培養サプリメント
ピンセットSkylar66-6112
ゲノムDNA精製キットQiagen69504ゲノムDNA抽出
ゲンタマイシン溶液Gibco15750-060リンス液に使用
ガイドRNAIntegrated DNA TechnologiesCustomCRISPRガイドRNA
HDRエンハンサーIntegrated DNA Technologies10007921相同組換え修復を促進
血球計数器Hausser Scientific02-671-10細胞数計測
止血鉗子Roboz SurgicalRS-7884
ヘパリンナトリウム塩Sigma-AldrichH3149
ホットスタートDNAポリメラーゼPromegaM5123PCR増幅
ヒアルロニダーゼSigma-AldrichH3506
イオノマイシンSigma-AldrichI0634
M199培地CytivaSH30253.01
メッシュスクリーン (40メッシュ)Sigma-AldrichS-0770開口径 380 μm
マイクロフォージNarishigeMF-9
マイクログラインダーNarishigeEG-4
マイクロピペットプラーSutter Instrument CoP-87
ミネラルオイルKitazato/Dibimed96014
口ピペットThermo Fisher Scientific13-678-20D使い捨てパステゥールピペット
Mr. Frosty 凍結容器Thermo Fisher Scientific15-350-50徐冷容器
ヌクレオキュベットLonzaV4XP-3032エレクトロポレーションキュベット
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit LLonzaV4XP-3024ヌクレオフェクション溶液、サプリメント溶液、ヌクレオキュベット、転送ピペットを含む
PCR精製キットQiagen28006PCR産物精製
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15070-063抗生物質サプリメント
シャーレ (100 mm)Nunc172958
シャーレ (35 mm)Nunc150460
試薬リザーバーCELLTREAT3054-1003
メスMedBladesMB 2-22
はさみRoboz SurgicalRS-6802
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナーテンプレートIntegrated DNA TechnologiesCustomHDRドナーテンプレート
塩化ナトリウムThermo Fisher ScientificBP358-212生理食塩水の調製用
スクロースSigma-AldrichS1888
手術用トレイApproved Vendor74262
SYBR Safe DNAゲル染色剤Thermo Fisher ScientificS33102DNAゲル染色剤
T-25 フラスコThermo Fisher Scientific156367細胞培養フラスコ
T-75 フラスコCorning430641U細胞培養フラスコ
薄壁ガラスキャピラリーWorld Precision InstrumentsTW100-6
TIDE/TIDERソフトウェアTIDE/TIDERhttps://tide.nki.nl/ゲノム編集解析ソフトウェア
トリパンブルーCytivaSV30084
TrypLE ExpressGibco12605-010トリプシン様解離酵素

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