本プロトコルでは、ガスクロマトグラフィータンデム質量分析法による農耕土壌中の有機リン系農薬の多成分決定に向けた、ケイ酸マグネシウム吸着剤ベースの分散固相抽出クリーンアップを伴う改良Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS)法について解説します。これにより、共抽出物の除去効率を高め、マトリックス由来の分析干渉を最小限に抑え、信頼性の高いトレースレベルの定量分析が可能となります。
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この記事について
サマリー
要約
ガスクロマトグラフィー・タンデム質量分析法（GC-MS/MS）による農耕土壌中の有機リン系農薬（OPP）残留物の正確な定量は、共抽出された有機物、腐植物質、および鉱物由来の干渉物質によって引き起こされるマトリックス誘起信号効果によって妨げられることが多い。従来のQuick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe（QuEChERS）クリーンアップ戦略では、複雑な土壌抽出物からマトリックス成分を十分に除去できず、分析性能を損なう可能性がある。本研究では、混合吸着剤分散固相抽出（dSPE）クリーンアップに吸着剤を組み込んだ改良QuEChERSプロトコルを提示し、GC-MS/MSを用いて農耕土壌中の12種類のOPPを同時定量した。土壌特性が異なる6種類の農耕土壌を用いて、7種類のdSPE吸着剤の組み合わせを評価した。共抽出物の除去量は重量法により定量し、一次・二次アミン、オクタデシルシラン、およびケイ酸マグネシウム吸着剤（各50 mg、無水硫酸マグネシウム150 mgと共に使用）の組み合わせが、最高の平均共抽出物除去率（88%）を達成した。マトリックス効果を最小限に抑えるため、エチルグリセロール、L-グルコン酸γ-ラクトン、D-ソルビトール、およびシキミ酸からなる分析物保護剤を最終抽出液に添加し、土壌固有の信号変動はマトリックスマッチド校正によって補正した。手順内部標準および注入内部標準として、それぞれクロルピリホスメチル-d10およびトリフェニルリン酸を用いた。マトリックスマッチド校正曲線（5–600 µg/kg）は優れた直線性を示し、ほとんどの分析物と土壌の組み合わせにおいて決定係数は0.9933以上であった。直線性の評価には検出限界（5 µg/kg）を用い、バリデートされた最低レベルとしてメソッド定量限界を50 µg/kgに設定した。3つの回収レベル（50、200、および400 µg/kg、各レベル n = 5）で評価した正確さと精密度では、ほとんどの分析物と土壌の組み合わせで回収率70%から120%の間、相対標準偏差20%以下となり、SANTE/2020/12830 (Rev.2) の性能基準を満たした。回収率の低下が観察されたのは、特定の土壌マトリックスにおけるフェナミホス、ピリミホスエチル、およびエチオンのみであった。以上の結果は、ケイ酸マグネシウム吸着剤が共抽出物を減少させることでdSPEクリーンアップを向上させ、分析物保護剤およびマトリックスマッチド校正と組み合わせることで、複雑な土壌マトリックス中のOPPの信頼性の高い多成分残留定量がGC-MS/MSで可能であることを示している。
概要
有機リン系農薬（OPPs）は、作物保護における広範な有効性と汎用性から、世界中で最も広く使用されている農薬類の一つであり続けています1。多くのOPPsは有機塩素系農薬よりも迅速に環境中で分解されますが、これらの化合物を広範囲にわたって繰り返し散布することにより、農地土壌中に持続的に存在することになります2。土壌は農薬が投入される主要な環境区画として機能し、そこから残留物が作物、地表水、地下水、および周辺のエコシステムへと移行する一時的な貯蔵庫となる可能性があります3。OPP残留物の存在が懸念されるのは、これらの化合物がアセチルコリンエステラーゼ活性の阻害を通じてヒトに神経毒性影響を及ぼすほか、非標的生物、土壌微生物コミュニティ、およびエコシステムの機能に悪影響を与えることが関連しているためです2。したがって、農地土壌におけるOPP残留物の発生は、食物連鎖や水系経路を通じた環境曝露、生態学的不均衡、および生物多様性の喪失に寄与する可能性があります3。そのため、高品質な発生データを生成し、環境曝露評価をサポートし、異なる農業条件下でのOPPsの環境動態に関する理解を深めるには、OPP残留物の信頼性の高い定量が不可欠です。さらに、単一の土壌タイプを用いて開発・最適化された分析法は、物理化学的特性が異なる土壌に適用した場合に必ずしも同等の性能を発揮するとは限らず4,5、多様な農業環境における分析法の適用性を評価することの重要性が浮き彫りになっています。しかし、農地土壌は物理化学的な変動が大きく、それが抽出効率、マトリックス効果（MEs）、および全体的な分析性能に影響を与えるため、トレースレベルの定量は依然として困難な課題となっています6。
ガスクロマトグラフィー・タンデム質量分析法（GC-MS/MS）は、複雑なマトリックス中の微量な有機リン系農薬（OPP）の多成分同時定量における標準的な分析手法として広く認識されています7,8。しかしながら、正確な定量は装置の性能だけでなく、試料調製の有効性にも依存します。土壌抽出液には、標的分析物とともにクロマトグラフィーシステムに到達し、信号の抑制や増強を通じて分析物のレスポンスを変化させる共抽出マトリックス成分が一般的に含まれています4,5,6。これらの影響の程度は土壌によって大きく異なり、有機物含有量、粘土分率、鉱物組成、pHなどの要因に影響されます。その結果、マトリックス効果（ME）はGC-MS/MSを用いた農薬定量の主要な分析不確かさの要因の一つとなっており、分析物の回収率を維持しつつ共抽出物の負荷を低減できるクリーンアップ戦略の必要性が強調されています5,9,10。さらに、信頼性の高い残留データを得るには、分析法の正確性、研究間の比較可能性、および環境モニタリングへの適用性を確保するために、国際的に認められた分析性能基準を遵守する必要があります11。
Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe（QuEChERS）法は、その簡便さ、溶媒消費量の少なさ、および農業用マトリックスへの幅広い適用性により、多成分農薬分析において最も広く利用される試料調製手法となっています4,12,13。そのモジュール式で柔軟な設計により、多様な試料タイプや分析用途への広範な適応が可能となり、現代の多成分分析への普及や、溶媒消費の削減と試料調製の簡素化による持続可能な分析化学との頻繁な関連付けに寄与しています。また、この適応性により、特定のマトリックス特性に基づいて抽出およびクリーンアップ条件を選択し、手法を最適化することが可能です。土壌分析において、分散固相抽出（dSPE）クリーンアップステップの有効性は極めて重要です。なぜなら、共抽出されたマトリックス成分の除去が不十分であると、その後のGC-MS/MS測定の分析性能に悪影響を及ぼす可能性があるためです4,14。一次・二次アミン（PSA）およびオクタデシルシラン（C18）に基づく従来の吸着剤の組み合わせでは、極性腐植質成分の除去が限定的であることが多く、これらは農業用土壌抽出物におけるマトリックス由来の信号影響の主な要因の一つとなっています14。幅広い極性範囲の化合物への親和性を持つケイ酸マグネシウム吸着剤であるFlorisilは、食品および植物マトリックスにおいて有望なクリーンアップ性能を示しています15,16。しかし、農業用土壌に対する混合吸着剤dSPEクリーンアップ戦略におけるFlorisilの寄与については、特に多様な物理化学的特性を示す土壌において、まだ十分に特性解析されていません17,18,19,20,21。
本研究では、pH、有機物含有量、および土性などの異なる6種類の農耕地土壌を用いて、7種類のdSPE吸着剤の組み合わせを評価した改良型QuEChERSプロトコルを提示する。本研究は、混合吸着剤を用いたdSPEクリーンアップにケイ酸マグネシウム吸着剤を組み込むことで、農耕地土壌抽出物から共抽出されたマトリックス成分の除去が促進されるという仮説に基づいている。吸着剤の選定は、共抽出物の除去に関する重量分析的な評価に基づいて行われ、平均クリーンアップ効率が最も高い組み合わせについて、その後完全な分析バリデーションを実施した。最適化された手順は、内部標準法、マトリックスマッチング校正、およびGC-MS/MSを用いて、12種類の有機リン系農薬（OPP）の同時定量についてバリデーションを行った。さらに、分析物保護剤（エチルグリセロール、L-グルロン酸 γ-ラクトン、D-ソルビトール、およびシキミ酸）を、マトリックス由来の残留シグナル影響を最小限に抑えるための補完的戦略として最終プロトコルに組み込んだ。物理化学的特性が異なる土壌を用いた体系的なクリーンアップの最適化と包括的な分析バリデーションを統合することで、本プロトコルは、不均一な農耕土壌における農薬残留量決定を容易にする、堅牢で再現性の高いワークフローを提供する。
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プロトコル
dSPEクリーンアップ手順の実験的な最適化の根拠となるソースデータ、マトリックス効果のデータセット、および6種類の農地の土壌の物理化学的特性評価はZenodoに登録されており、DOI: 10.5281/zenodo.21644870にて公開されています。使用した試薬および機器の詳細は材料表に記載されています。
1. 土壌のサンプリングおよび調製
注意：個人の安全を確保するため、本プロトコルの全工程において、白衣、保護メガネ、およびニトリル手袋の着用を推奨します。
- 選定した各農地の表層（0～10 cm）から、8か所の個別のサブサンプルを採取して混合し、バルク複合土壌サンプルを採取する。 ～経由で 正方形グリッド系統サンプリング設計22.
注：8点の正方形グリッド設計は、約1000 m²の敷地に関するニューサウスウェールズ州環境保護局（NSW EPA）の推奨事項に準拠しています。2 (0.1 ha)22. - これらのサブサンプルを現場で統合して十分に混合し、1地点につき単一の代表的なバルクサンプル（500 g以上）を作成することで、手法の性能評価のための均質化されたマトリックスベースラインを構築する。
注：ここでの複合サンプリングは、メソッドの最適化およびバリデーションにおいて、マトリックス背景効果を標準化することのみを目的として利用されています。未知の汚染または実際の汚染地の評価に関する規制枠組みの下では、化学的希釈のリスクがあるため、複合サンプリングはNSW EPAによって厳格に制限されています。22実際のサイト特性評価やホットスポット検出においては、偽陰性を防ぎ、空間的な分散データを保持するために、グリッドノードからのサンプルは個別に保持し、個別に分析しなければならない。 - 土壌試料を気密性の高い遮光褐色ガラス容器に入れ、遮光状態で研究室まで運搬してください。
注：疎水性または半揮発性の有機リン農薬（OPP）のプラスチック表面への吸着損失を最小限に抑え、汚染物質の溶出やポリマーと分析物の相互作用のリスクを軽減するため、ポリエチレン製バッグよりもガラス容器が推奨されます。また、輸送中の光感受性化合物の光分解を最小限に抑えるため、遮光条件を維持してください。 - 直射日光を避け、室温で恒量に達するまで試料を風乾させる。
注：風乾は、土壌水分量を標準化し、結果を乾重量ベースで報告することを目的として行われます。これにより、天然の水分含有量が異なるサンプル間での比較可能性が向上します。加熱による有機リン系農薬（OPPs）の熱不安定性や半揮発性物質の損失、および土壌有機物の構造や吸着特性の変化を防ぐため、オーブンによる強制乾燥は避けてください。 - 土壌団粒を手動で砕き、2 mmのステンレス製メッシュで篩い分ける。均質化した土壌は、気密性のある遮光褐色ガラス容器に入れ、暗所かつ冷蔵条件下で保存する。 4 °C 抽出まで。
注：本研究で使用した6種類の土壌の理化学的特性は、以前の定期的な土壌分析の結果から得られたものである。これらのデータは、広範なpH範囲を網羅する農業用土壌（土壌：H2O, 1:2)23、有機物含有量（ウォッキー・ブラック法）24、および土性（ブヨコス法）25 手法評価のため。
2. 試薬、標準物質、および内部標準溶液の調製
注：特に指定がない限り、個々の農薬ストック溶液、混合作業標準溶液、手順用内部標準（P-IS）および注入用内部標準（I-IS）溶液、回収率溶液、ならびに検量線標準溶液は、10 mLのメスフラスコで調製し、遮光ガラスバイアルに移して、使用時まで−20 °Cで保存します。マトリックスマッチング検量線、分析物保護剤、P-IS、およびI-ISを導入したのは、それぞれが分析変動の異なる要因に対処し、それによって複雑な土壌マトリックスにおける定量分析の堅牢性を向上させるためです。
- 12種類の市販OPP標準物質（材料表を参照）を、それぞれトルエンを用いて1000 mg/Lの個別ストック溶液として調製する。
- 各個別ストック溶液を適切な量ずつ混合し、アセトニトリル（ACN）を用いて400 mg/Lの混合ワーキング標準溶液を調製する。
注：この混合ワーキング標準溶液は、その後の回収率確認溶液および検量線用溶液の調製に使用される。 - P-ISとして、クロルピリホス-メチル-d10をACNを用いて750 mg/Lで調製する。手順上のばらつきを監視および補正するため、抽出時（ステップ3.2）に添加する。
注：クロルピリホス-メチル-d10は、同位体標識OPPであり、標的分析物と同様の物理化学的挙動を示す一方で、MS/MSで容易に区別できるため、P-ISとして選定された。 - I-ISとして、トリフェニルリン酸をACNを用いて1050 mg/Lで調製する。注入量のばらつきを補正するため、機器分析の直前（ステップ4.2.4）に添加する。
- 0.05% (v/v) ギ酸を添加したACNを用いて、ストック回収率確認溶液を調製する。これは、抽出前に黒色土5 gに対して300 µL添加した際に、OPPの最終的な土壌等価濃度が50 µg/kg、200 µg/kg、および400 µg/kgとなるようにする。また、試料等価で200 µg/kgに相当する個別のP-IS溶液を調製する。
注：ギ酸による酸性化により、保存中のOPPの安定性が向上する。 - 0.05% (v/v) ギ酸を含むACNを用いて、12種類のOPPおよびクロルピリホス-メチル-d10を含む検量線用溶液を調製する。濃度は、分析物について最終土壌等価濃度が5、10、25、75、200、400、および600 µg/kgとなり、P-ISについては200 µg/kgとなるようにする。
注：これらの溶液は、その後、各土壌マトリックスに対するマトリックスマッチング検量線の作成に使用され、非加重線形回帰によりフィッティングされた。検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は、SANTE/2020/12830 (Rev.2) ガイダンスドキュメントに従って定義された。LODはマトリックス内での最低検量レベルとし、LOQは許容可能な回収率と精度が実証された最低の検証済み濃度レベルとした。 - エチルグリセロール (100 g/L)、L-グルコン酸γ-ラクトン (10 g/L)、D-ソルビトール (10 g/L)、およびシキイ酸 (5 g/L) からなる分析物保護剤混合液を、0.1% ギ酸で酸性化したACN：水 (1:1, v/v) で調製する。−20 °Cで保存し、ME（マトリックス効果）を軽減するため、機器分析の直前（ステップ4.2.4）に添加する。
3. QuEChERS抽出
- 風乾し、ふるい分けした土壌 5.00 g ± 0.01 g を 50 mL ポリプロピレン製遠心チューブに秤量して加えます。
- 回収率試験では、P-IS溶液（ステップ 2.3で調製）および適切な回収率用溶液（ステップ 2.5で調製）を加え、クロルピリホスメチル-d10 の最終濃度を 200 µg/kg、対象となる OPPs の最終濃度を 50、200、または 400 µg/kg とします（各土壌の回収率レベルにつき n = 5）。
注：回収率試験では、ステップ 3.2に記載するように、抽出前に P-IS と農薬回収率溶液の両方を加えます。土壌試料のルーチン分析では、試料調製および分析中の操作上の変動を補正するため、抽出前に P-IS のみを加えます。マトリックスマッチング校正抽出液を調製する場合、抽出時に P-IS および農薬標準物質のいずれも加えません。ブランク土壌抽出液を調製し、クリーンアップ後（ステップ 4.2.4 参照）に、分析物と P-IS の両方を含む校正標準液（ステップ 2.6で調製）を加えます。 - 30秒間ボルテックスし、添加した試料を室温で10分間静置して平衡化させます。
注：平衡化させることで、抽出前に添加した分析物と土壌マトリックスとの相互作用が促進され、回収率試験の代表性が向上します。 - 脱イオン水 10 mL を加え、手で30秒間振とうして土壌マトリックスを完全に濡らします。
注：再水和させることで、土壌粒子からの分析物の脱離が改善され、抽出時の効率的な分配が促進されます。 - 1% (v/v) 酢酸を含む ACN 10 mL を加えます。直ちにチューブに蓋をし、2分間激しく振とうします。
- 無水硫酸マグネシウム (MgSO4) 6.0 g と酢酸ナトリウム 1.5 g を加え、直ちにチューブを1分間激しく振とうします。
注：塩を添加した直後に速やかに攪拌することは、効率的な相分配を確保し、塩の凝集形成を防ぐために不可欠です。 - 1800 × g で5分間遠心分離します。
- 上層の ACN 相を、後続の dSPE クリーンアップ用の清潔なチューブに移します。
4. 分散固相抽出によるクリーンアップ
注：このセクションは2つのアプローチで構成されています。まず、6種類の農地土壌において平均的に最も高い共抽出物除去率を示すクリーンアップ組成を特定するため、7種類のdSPE吸着剤の組み合わせを評価しました。その後、選択された吸着剤の組み合わせを、欧州委員会保健・食品安全総局（DG SANTE）のガイダンスドキュメント SANTE/2020/12830 (Rev.2)11に基づいたメソッドバリデーションのための最適化されたクリーンアップ手順として適用しました。
- dSPE吸着剤組み合わせの最適化
注：共抽出物の重量法による除去率を最適化基準として選択した理由は、これが分析物によらないクリーンアップ効率の指標となるためである。評価した吸着剤量は、QuEChERSベースのdSPE手順で広く採用されている標準的な比率に対応しており、これにより提案されたプロトコルの日常的な分析試験室への導入が容易になる。- 以下の吸着剤組み合わせを含む2 mLマイクロ遠心チューブを準備する：(i) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg PSA、(ii) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg C18、(iii) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg ケイ酸マグネシウム吸着剤、(iv) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18、(v) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg ケイ酸マグネシウム吸着剤、(vi) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg C18 + 50 mg ケイ酸マグネシウム吸着剤、(vii) 150 mg 無水MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg ケイ酸マグネシウム吸着剤。
- ステップ3.8で得られた抽出液の1.0 mL分注量を、各dSPEチューブに分注する。
注：各土壌について、すべての吸着剤評価を3連（triplicate）で実施する。比較に使用する分注量は、共抽出物の除去率の差がクリーンアップ組成のみに起因することを確実にするため、同一の抽出液から採取しなければならない。 - 1分間ボルテックスし、1800 × gで5分間遠心分離する。
- 各クリーンアップ済み抽出液1.0 mLを、あらかじめ乾燥させ重量を量っておいたガラス試験管に移す。40 °Cで緩やかな窒素気流下、溶媒を乾固させる。
- 試験管をデシケーター内で室温まで冷却し、残渣の質量を測定する。溶媒蒸発後の最終重量から空の試験管の初期重量を差し引くことで、共抽出物の質量を算出する。
- dSPEクリーンアップを行っていない抽出液の同量の分注量を同一条件下で蒸発させ、抽出液中に含まれる共抽出物の量を測定する。
- 式126に従って共抽出物の除去率を算出する：
- 吸着剤の組み合わせおよび土壌ごとに、3連の測定値から共抽出物除去率の平均値を算出する。その後、各吸着剤組み合わせについて、6種類の農地土壌全体の平均除去率を算出する。
- 吸着剤の組み合わせを処理因子、土壌マトリックスをブロック因子とし、乱塊法（RCBD）による分散分析（ANOVA）を用いて吸着剤組み合わせ間の差を評価する。ANOVAの前に、シャピロ-ウィルク検定およびレベーン検定を用いて、それぞれ残差の正規性と分散の均一性を評価する。有意水準 α = 0.05で、TukeyのHSD検定を用いて多重比較を行う。
- 統計分析の結果と共抽出物除去率の全体平均を総合的に評価し、クリーンアップ組成を選択する。
注：共抽出物の負荷を低減させることで、クロマトグラフィーシステムへのマトリックス成分の導入が最小限に抑えられ、その結果、クロマトグラフィー性能の向上、GC-MS/MSシステムの汚染軽減、および装置メンテナンス要件の低減につながる。
注：PSA、C18、およびケイ酸マグネシウム吸着剤（各50 mg、無水MgSO4 150 mgを含む）の組み合わせが最高の平均共抽出物除去率を示したため、以降のすべての分析における最適化されたクリーンアップ手順として選択した。
- 最適化されたdSPEクリーンアップ手順の適用
- ステップ3.8で得られた抽出液1.0 mLを、150 mg 無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、および 50 mg ケイ酸マグネシウム吸着剤を含む2 mLマイクロ遠心チューブに移す。
- 抽出液と吸着剤を完全に相互作用させるため、1分間ボルテックスする。
- 1800 × g で5分間遠心分離する。
- クリーンアップ済み上清200 µLをオートサンプラーバイアルに移し、ステップ2.7で調製した分析物保護剤混合液 20 µLとステップ2.4で調製したトリフェニルリン酸溶液 50 µLを添加する。機器分析の前に十分に混合する。
注：マトリックスマッチング較正を行う場合は、農薬またはP-ISを添加せずに、ステップ3および4.2に記載された抽出およびクリーンアップ手順に従い、各土壌からブランク抽出液を調製する。クリーンアップ後、クリーンアップ済みブランク抽出液 200 µLを7本の別々のオートサンプラーバイアルに移し、ステップ2.6で調製した較正溶液を添加して、分析物の最終濃度を 5, 10, 25, 75, 200, 400, 600 µg/kg、P-ISの最終濃度を 200 µg/kgとする。ステップ4.2.4に記載のように、各バイアルに分析物保護剤混合液 20 µLとトリフェニルリン酸 50 µLを添加し、最終的なバイアル容量を 270 µLとする。各土壌マトリックスについて独立したマトリックスマッチング較正曲線を作成する。土壌等量濃度は、元の土壌サンプル 5 gから得られた抽出液を表すクリーンアップ済み抽出液 200 µLの分注量に基づいている。その後の分析物保護剤およびI-ISの添加により最終バイアル容量は増加するが、抽出液の分注量が表す土壌量に変更はない。溶媒ベースの較正を行う場合は、クリーンアップ済み土壌抽出液 200 µLを 200 µLのACNに置き換え、マトリックスマッチング較正で使用したものと同じ分析物濃度、P-IS濃度、I-IS濃度、および分析物保護剤混合液を用いて較正バイアルを調製する。これらの溶媒ベース較正曲線は、その後のME評価に使用される。 - GC-MS/MSシステムを用いて機器分析を行う。
5. GC-MS/MS分析およびデータ収集
注：GC-MS/MSの構成およびデータ収集手順の詳細については、Varela-Martínez et al.27をご参照ください。主要なクロマトグラフィーおよび質量分析パラメータを以下にまとめます。
- トリプル四極質量分析計、−70 eVで動作する電子イオン化（EI）源、およびオートサンプラーを備えたGC-MS/MSシステムを使用する。
- 低極性溶融シリカキャピラリーカラム（30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 µm 膜厚）を装着し、キャリアガスとしてヘリウムを1.2 mL/minの一定流量で使用する。
- 分析前に、キャリアガスの供給、真空システムの性能、シリンジの状態、およびオートサンプラー洗浄溶媒の量を含む装置の準備状態を確認する。製造元の推奨に従って装置のチューニングを行う。
注：分析シーケンスを開始する前に、動作真空度が装置製造元の推奨仕様を満たしていることを確認すること。 - GCオーブンの温度プログラムを次のように設定する：初期温度50 °Cで1 min保持し、25 °C/minで180 °Cまで昇温し、続いて5 °C/minで230 °Cまで、最後に25 °C/minで290 °Cまで昇温させる。最終温度を6 min保持する。総分析時間は24.6 minである。
- 注入ポート温度を250 °Cに設定し、スプリットレスモードで1 µL注入を行う。注入1 min後にスプリットベントを開く。
注：キャリーオーバーを最小限に抑えるため、注入間にオートサンプラーシリンジをメタノール、酢酸エチル、およびACNで順次洗浄すること。 - MSトランスファーライン温度を250 °Cに、イオン源温度を300 °Cに設定する。
- Table 1に記載されているプリカーサーイオン-プロダクトイオン遷移を用いて、多重反応モニタリング（MRM）モードでデータを取得する。
- 各土壌マトリックス用に調製したマトリックスマッチング検量線を用いて分析物を定量する。分析物のピーク面積とchlorpyrifos-methyl-d10のピーク面積の比から分析物濃度を算出する。
- 分析シーケンス全体の注入の一貫性を確認するために、triphenyl phosphateをI-ISとして使用する。
- Equation 228に従ってMEを算出する：
![マトリックス効果の式、ME(%)=[Slope_matrix/Slope_solvent-1]x100、分析化学の式。](/files/ftp_upload/72745/72745eq2.jpg "figure-protocol-2")
ここで、負の値は信号抑制を、正の値は信号増強を示す。
注：分析ワークフロー全体の概略図をFigure 1に示す。
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結果
方法の評価のために選定された6種類の農地土壌は、pH（土壌:H2O、1:2）が4.67から7.31、有機物含有量が0.18%から6.46%、粘土分率が22.9%から48.5%の範囲に及ぶなど、幅広い土壌特性を網羅していた（表2参照）。土壌のうち5種類はコロンビアの農業地域から、1種類はスペインから採取された。このような多様性を意図的に組み込んだのは、pH、有機物含有量、土性などの土壌特性が、農薬残留分析における共抽出、マトリックス効果（ME）、および分析物の回収率に影響を与えることが知られているためであり、対照的な土壌マトリックス間での提案されたクリーンアップ手順の堅牢性を評価することを目的とした。
共抽出物の除去率を重量法で測定し、7種類のdSPE吸着剤の組み合わせを評価した（図2参照）。単一の吸着剤の中では、Florisilが最高の平均共抽出物除去率（71%）を達成し、次いでPSA（58%）、C18（41%）であった。ケイ酸マグネシウム吸着剤は、S2において完全な...
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ディスカッション
土壌中の農薬残留物の定量は、土壌の物理化学的特性の変動が大きく、それに伴い共抽出物の組成が異なるため、分析上の課題が依然として多い4,5,6,14,17,18,19,20,21。QuEChERS法に基づいた手法は食品や植物マトリックスに広く適用されていますが、多様な土壌特性を持つ農耕土壌に対してdSPEクリーンアップを体系的に最適化した研究は少ないのが現状です4。本研究では、異なる土壌条件を代...
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開示事項
本研究の作成にあたり、著者は図3のグラフィカルレイアウトの設計にClaude（Anthropic）の無料版を、文法およびスペルチェックにChatGPT（GPT-5.5, OpenAI）の無料版を使用しました。これらのツールを使用した後、著者はすべての内容を慎重に確認し、必要に応じて編集を行いました。すべての科学的な内容、データ、解析、および結論は著者によって作成、検証、承認されており、出版された論文の正確性と完全性については著者が全責任を負います。
謝辞
著者らは、本研究を支援したEAN大学および同大学の研究・移転管理室に深く感謝いたします。また、本研究全体を通じて使用したGC-MS/MS装置へのアクセスを含め、本研究の遂行に必要な分析設備および技術的リソースを提供したEAN大学研究室に感謝いたします。本研究は、コロンビア、ボゴタ D.C.のUniversidad EAN研究・移転管理によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3-エトキシ-1,2-プロパンジオール（エチルグリセロール） | Sigma Aldrich | 260428-1G | |
| 酢酸 | Sigma Aldrich | 695092 | |
| アセトニトリル | Merck | 1006652500 | |
| AOAC 20i/s オートサンプラー | 島津製作所 | 221-723115-58 | |
| 天秤 | OHAUS | PA224 | |
| C18 | Sigma Aldrich | 52600-U | |
| 遠心チューブ、2 mL | Eppendorf | 4610-1815 | |
| 遠心チューブ、50 mL | ネスト | 602002 | |
| 遠心分離機 Z206A | MERMLE | 6019500118 | |
| カラム SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm | 島津製作所 | 221-75954-30 | |
| 容器、キャップ付き、遮光ガラス、1000 mL | Sigma Aldrich | Z674176 | |
| デシケーター | Simax | 415262302 | |
| ディスペンセット 5-50 mL | ブランド | 4600361 | |
| D-ソルビトール | Sigma Aldrich | 240850-5G | |
| 酢酸エチル | メルク | 1313181212 | |
| フロリシル &200メッシュ未満、微粉末 | Sigma Aldrich | 288705-50G | |
| ギ酸 | Merck | 1002641000 | |
| GCMS-TQ8040 | 島津製作所 | 211552 | |
| 注射用シリンジ | 島津製作所 | LC2213461800 | |
| L-グルロン酸 γ-ラクトン | Sigma Aldrich | 310301-5G | |
| スプリットレスライナー | 島津製作所 | 221-4887-02 | |
| 硫酸マグネシウム（無水） | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| メタノール | Panreac | 131091.12.12 | |
| Milli-Q 超純水（タイプ1） | Millipore | F4H4783518 | |
| ピペットチップ 10 µL 100 µL | Biologix | 200010 | |
| ピペットチップ 100 $\mu$L 1000 µL | ブランド | 541287 | |
| ピペットチップ 20 $\mu$L 200 µL | ブランド | 732028 | |
| パステゥールピペット | NORMAX | 5426023 | |
| ピペット Transferpette S 可変式 10 - 100 µL | ブランド | 704774 | |
| Transferpette S 可変式ピペット 100 - 1000 µL | ブランド | 704780 | |
| ピペット Transferpette S 可変式 20 - 200 µL | SCILOGEX | 712111099999 | |
| 一次・二次アミン (PSA) | Sigma Aldrich | 52738-U | |
| 冷蔵庫／冷凍庫 | Haceb | NEV ALC 404 | |
| シキミ酸 | Sigma Aldrich | S5375-1G | |
| 酢酸ナトリウム | Sigma Aldrich | 241245-1KG | |
| ソフトウェア GCMSsolution | 島津製作所 | 223-18472-92 | |
| ステンレス製2mmメッシュ | ピンセットでつかむ | PS33N10 | |
| 試験管、ガラス製、10 mL | Sigma Aldrich | BR114508 | |
| トルエン | Merck | 1083252500 | |
| トリフェニルホスフェート (I-IS) | Sigma Aldrich | 241288-50G | |
| インサート一体型バイアル、0.3 mL | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| スクリューキャップ付きバイアル、遮光ガラス、15 mL | Sigma Aldrich | 27088-U | |
| メスフラスコ、10 mL | Sigma Aldrich | DWK28017-10 | |
| ボルテックスミキサー | Scilogex | 82120004 | |
| 農薬 | |||
| クロルピリホス | Sigma Aldrich | 45395-100MG | 2921-88-2 |
| クロルピリホスメチル | Sigma Aldrich | 45396-250MG | 5598-13-0 |
| クロルピリホス・メチル-d10 (P-IS) | Sigma Aldrich | 90047-5MG | 285138-81-0 |
| エチオン | Sigma Aldrich | 45477-250MG | 563-12-2 |
| フェナミホス | Sigma Aldrich | 45483-250MG | 22224-92-6 |
| フェニトロチオン | Sigma Aldrich | 45487-250MG | 122-14-5 |
| フェンチオン | Sigma Aldrich | 36552-250MG | 55-38-9 |
| マラチオン | Sigma Aldrich | 36143-100MG | 121-75-5 |
| メチダチオン | Sigma Aldrich | 36158-100MG | 950-37-8 |
| パラチオンメチル | Sigma Aldrich | 36187-100MG | 298-00-0 |
| ピリミホスエチル | Sigma Aldrich | 45628-250MG | 23505-41-1 |
| ピリミホスメチル | Sigma Aldrich | 32058-250MG | 29232-93-7 |
| トルクロホス・メチル | Sigma Aldrich | 31209-250MG | 5701804-9 |
参考文献
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