方法論記事

高生存率の単一細胞懸濁液を作成するためのマウス乳腺および腫瘍組織の解離

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DOI:

10.3791/72844

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2026年8月21日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Oncology, Wayne State University

この記事について

サマリー

本プロトコールでは、フローサイトメトリーやシングルセルRNAシーケンシングなどの後続解析に向けて細胞表面エピトープを保持しつつ、マウス乳腺および乳癌組織から生存率の高い単一細胞懸濁液を調製するための再現可能な手法を確立します。

要約

分析のために組織を単一細胞懸濁液に解離させることは、腫瘍微小環境において細胞レベルで何が起きているかを理解するのに役立ちます。長年の課題となっているのは、 初代細胞の回収と利用においては、単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-Seq）やフローサイトメトリーによる免疫表現型解析などのダウンストリーム処理に向けて、細胞特性を維持した高品質な細胞懸濁液を調製することが重要である。通常、組織は物理的破砕、酵素消化、およびろ過を組み合わせて解離させるが、各工程における複数の要因が最終産物にばらつきをもたらす。したがって、特定の組織タイプに最適な手法を特定するための最適化ステップが必要となる。例えば、乳腺脂肪体組織は脂肪細胞が豊富であるため、不純物のない細胞懸濁液を得ることや、生存細胞を適切に維持することがより困難である。その結果、乳腺脂肪体組織と上皮様腫瘍から同等の細胞懸濁液を調製することは困難である。本プロトコールでは、今後の解析に向けて細胞表面エピトープを維持しつつ、生存率の高い単一細胞懸濁液をマウスの乳腺および腫瘍組織から調製するための、再現性があり費用対効果の高い手法を確立する。本手順は、高品質なscRNA-Seqライブラリの作成、およびマルチパラメーターフローサイトメトリーを用いた免疫表現型解析に活用されている。

概要

組織解離により、単一細胞懸濁液の取得および組織内における細胞型の特性解析が可能になります。これは、浸潤免疫細胞が組織特異的な免疫応答の根底にあるメカニズムの解明に寄与するため、免疫療法への反応を分析する際に特に重要です。HER2/neuオンコジーンをコードするデオキシリボ核酸（DNA）ワクチンを接種すると、マウスモデルにおいて自発的なHER2/neu駆動性乳腺腫瘍に対する保護能が高まります1。さらに、DNAワクチンは、抗体産生およびインターフェロン-γ（IFN-γ）分泌T細胞を特徴とする全身性反応を誘導することが示されています1,2,3。このため、私たちは局所免疫の計数を可能にするため、乳腺腫瘍および脂肪豊富な乳腺組織を解離させるプロトコールの開発に重点を置きました。組織を単一細胞へと解離させるには、酵素的、機械的、またはその両方を併用する方法が必要です。酵素的解離に伴う課題の一つは、これらの方法では長時間、多くの場合一晩にわたる酵素への曝露が必要となることです4。過剰な曝露は個々の細胞や表面マーカーの分解を招き、特に免疫細胞への悪影響が顕著です5,6。機械的消化は、リンパ球やマクロファージなどの免疫細胞を遊離させるための有効な選択肢となり得ますが、ストロマを効果的に分解できないため、上皮細胞やストロマ細胞の代表的なサンプルを得ることは困難です。最近では、組織解離のためのマイクロ流体技術が研究されており、溶液中の細胞凝集体を分解するために初めて採用されました7。ある研究グループは、デバイス内のせん断力を用いて、細切した組織をさらに分解するマイクロ流体アプローチを実装しました8。最適化された60分間の解離後、この方法は乳腺組織において、従来の酵素的消化プロトコルと比較して上皮細胞が2倍、内皮細胞が4倍増加しました。しかし、肝細胞の収率を測定したところ、肝細胞のサイズと脆弱性のために、時間の経過とともに収率が低下するという課題が生じました。したがって、細胞の完全性と表面エピトープを維持しながら、複数の細胞型のクリーンで代表的なサンプルを得られる中間的な手法を見つけることが極めて重要です。

消化ミックスに使用される酵素には、通常、汎用的なコラゲナーゼ9,10、トリプシン（Solid Tissue Dissociationのガイド）4,10,11、ヒアルロニダーゼ9,10,11、またはディスパーゼ4,9,10のいずれかの組み合わせが含まれ、効果的な消化にはそれぞれ異なる時間を要します。本プロトコルでは、消化の主酵素として2種類の特定のコラゲナーゼ（コラゲナーゼ type II およびコラゲナーゼ D）を使用し、補助的にエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を使用して、キレート作用により細胞間結合をさらに弱めます。コラゲナーゼ type II は Clostridium histolyticum 由来の主要な解離酵素であり、細胞外マトリックス中の小さなコラーゲン断片の消化を促進します。コラゲナーゼ D も C. histolyticum 由来であり、肺、心臓、筋肉、骨、神経、内皮組織など、さまざまな組織の解離に広く使用されてきました。このコラゲナーゼは、細胞表面タンパク質の機能性と完全性の維持に役立ち、これはフローサイトメトリーによる下流の免疫表現型解析において重要な因子となります。コラゲナーゼに加えて、遊離DNAを分解して得られる細胞懸濁液から除去するために、デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I) の存在下で組織を消化します。

乳腺の分散における特有の課題として、サンプル中に脂肪細胞が存在することが挙げられます。マウスが加齢するにつれ、乳腺脂肪パッドには相当数の脂肪細胞が蓄積します。これらの細胞はより脆弱で、後続の処理中に破裂しやすく、その結果、RNAや細胞内デブリが細胞懸濁液中に放出され、周囲のRNAが増加してscRNA-Seqライブラリ調製を妨げ、サンプルの品質を低下させる可能性があります。また、細胞外DNAは細胞凝集を引き起こす可能性があるため、初期の酵素的分散後に残存する脂肪細胞は、サンプルの完全性を維持するために除去する必要があります。幸いなことに、脂肪細胞の浮力という特性を利用して、遠心分離時に残りの細胞から分離させることが可能です。遠心分離プロトコルを用いることで、脂肪細胞は上澄みの表面に留まります。これにより、主要な細胞ペレットへの混入を避けつつ、上澄みと共に脂肪細胞を廃棄することができます。必須ではありませんが、緩やかな減速を加えることでチューブ内のコリオリ力を低減でき、特に脂肪細胞が非常に豊富な乳腺組織を扱う場合や、脂肪細胞の除去自体を研究の主眼とする場合に、脂肪細胞を上部の独立した層に維持するのに役立ちます12,13.

これらの組織特異的な考慮事項を踏まえ、我々は、コスト効率が高く、特殊な装置を必要とせず、親組織から一貫して高品質で再現性の高い代表的な細胞サンプルを得ることができるプロトコルの確立を目指しました。

プロトコル

本プロトコルのすべての手順は、米国公衆衛生局の実験動物使用に関する指針に従い、ミシガン州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を得て実施されました。

1. マウス腫瘍組織および乳腺組織からの単一細胞懸濁液の調製：

組織の消化

  1. 余剰または未使用のマウス組織はすべて生物学的廃棄物として廃棄してください。マウスの組織や細胞で汚染されたプラスチック類は、生物学的廃棄物に入れて廃棄してください。細胞を含む溶液は生物学的液体廃棄物容器に回収し、廃棄前に10%漂白剤で処理してください。
  2. 新鮮な組織消化カクテルは、組織消化の直前に調製してください。サンプル1つにつき10 mLの消化カクテル（10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI)、60 U DNase I、25 mg Collagenase D、50 mg Collagenase type II）が必要です。使用時まで室温（RT）で保存してください。
  3. 頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。補助的な安楽死方法として、放血の有無にかかわらず両側気胸を用います。
  4. マウスを仰臥位に置き、脚を外側に広げてピンで固定します。
  5. 抜け毛によるサンプルの汚染を防ぐため、マウス全体に70%エタノールをスプレーしてください。 
  6. 鼠径部脂肪パッドから頸部まで、腹膜を穿刺しないように注意しながら、マウスの中央線を一本切開し、続いて各脚を切り下げて逆Y字型の切開線を作ります。
  7. 鈍的剥離法を用いて皮膚と下層の腹膜を分離し、皮膚を広げて解剖ボードに平らにピンで固定します。 
  8. 中サイズの腫瘍または乳腺/脂肪パッドを取り出し、10%胎児牛血清（FBS）を含む5 mLのR10細胞洗浄培地（R10はRPMI）を入れた50 mLコニカルチューブに入れます。
    1. 可能な限り、壊死した腫瘍や血液で充満した腫瘍（外見が非常に暗く、柔らかいもの）の使用は避けてください。
    2. 生物安全キャビネット内で、乳腺脂肪パッドと腫瘍のみを清潔なペトリ皿に移します。2枚の外科用メス刃を用いて、組織がペースト状の濃度になるまで細かく刻み、清潔な50 mLチューブに入れます。このステップはRTで実施してください。
  9. サンプルあたり10 mLの消化カクテルを加えます。
  10. 37 °Cの振盪インキュベーターにて、250 revolutions per min (rpm)で30分間インキュベートします。
  11. 最終濃度が10 mMになるように0.5 M EDTAを加えます（10 mLの消化緩衝液に対し200 µL EDTA）。
  12. 37 °C、250 rpmの振盪インキュベーターに戻し、さらに5分間インキュベートします。
  13. 反応を停止させるため、40 mLのR10細胞洗浄培地を加えます。
  14. 消化した細胞を70 µmフィルターでろ過し、塊を取り除いて清潔な50 mLチューブに回収します。
  15. 加速設定9、減速設定6にて、4 °Cで10分間、500 x gで遠心分離して細胞をペレット化します（リンパ球のみを目的とする場合は、遠心力を300 x gで5分間に下げることができます）14。これは脂肪細胞が豊富な乳腺組織の解離を伴うため、制動を緩めるプロトコルを用いることで、遠心分離中に脂肪細胞の浮遊性によって形成される勾配を維持しやすくなります13。
  16. 上清を生物学的廃棄物として廃棄し、ペレットを再分散させ、40 mLの細胞洗浄培地を加えて、上記（ステップ1.15）と同様に遠心分離します。以降のステップでは、制動を最大減速に戻しても構いません。戻さなかったとしても、サンプルに悪影響はありません。
  17. 40 mLのR10細胞洗浄培地で洗浄し、ステップ1.15と同様に遠心分離を計3回行います。
  18. ペレットを再分散させ、2 mLの冷えた1 × PBSに細胞を懸濁させます。
  19. 2倍量の1× RBC溶解バッファーを加えます。10 × 溶解バッファー濃縮液を水で1 ×に希釈して使用します（例：2 x = 2 mL 1 × PBS + 4 mL 溶解バッファー）。このステップはRTで実施してください。
  20. チューブを時々穏やかに転倒混和しながら、室温で5分間インキュベートします。
  21. 等量のR10細胞洗浄培地を加えて、RBC溶解バッファーを中和します。
  22. 細胞溶液を30 µmフィルターでろ過し、15 mLチューブに回収して細胞残渣を除去します。
  23. R10細胞洗浄培地を用いて、液量を15 mLに調整します。
  24. 4 °Cで10分間、500 x gで遠心分離します。
  25. 上清を完全に除き、細胞計数および生存率評価のため、細胞洗浄培地で最終容量を最大5 mLまで再懸濁させます。目的の希釈倍率に再懸濁してください。その後、フローサイトメトリー用の染色またはscRNA-seqの調製に進みます。 
  26. 特に指定がない限り、ステップ間では細胞を氷上に保持してください。

2. フローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液の染色

  1. 目的の細胞を5 mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移し、氷上で保持する。
  2. フロー用PBS（490 mL 1x PBS、10 mL FBS、0.5gアジ化ナトリウム）を用いて、蛍光タグ結合させた目的のモノクローナル抗体（mAb）を含む細胞染色液を、全量(n + 1) × 100 µLで調製する。染色液を(n+1) × 100 µL調製する。ここでn = サンプル数である（例：5サンプルの場合は 6 × 100 µL = 600 µL）。
    注：アジ化ナトリウムは粉末状では発がん性がある。適切な個人用保護具を着用し、化学廃棄物容器に廃棄する前に、すべての器具を洗浄してアジ化物が溶液状態にあることを確認すること。
  3. 染色する各サンプルを、4 °C、500 x gで5分間遠心分離する。100 µLの染色液に再懸濁する。未染色のコントロールは1000 µLのフロー用PBSに再懸濁する。
  4. 遮光するためチューブを覆い、4 °Cで15分間インキュベートする。
    ​注：蛍光標識抗体は光に長時間さらされると分解される可能性があるため、インキュベーション中およびその後のサンプル保存中は覆ったままにすること。
  5. 染色した各チューブに1 mLのフロー用PBSを加え、500 x g, 4 °Cで5分間遠心分離して洗浄する。
  6. 上清を捨て、ペレットを分散させ、1 mLのフロー用PBSに細胞を再懸濁する。前と同様に遠心分離を行う（ステップ2.5）。
  7. ステップ2.6を繰り返し、計3回洗浄する。上清を捨て、ペレットを分散させる。
  8. その後の染色要件に応じて、固定液またはフロー用PBSに細胞を再懸濁する。
  9. 細胞を固定する場合、または細胞内染色を行う場合は以下を行う。それ以外の場合は、ステップ2.10に進む：
    1. 核内染色を可能にするため、各サンプルに200 µLの透過化/固定液を加える 。
    2. 細胞をアルミホイルで覆い、4 °Cで少なくとも20分間インキュベートする。別の日にサンプルを処理する場合は、このステップで4 °Cで覆ったまま一晩保存できる。
    3. 固定後、サンプルを500 x gで5分間遠心分離し、1 × 透過化バッファー（水で希釈）に再懸濁する。
    4. 二次染色または細胞内染色を準備する場合は、1x透過化バッファー中で目的の希釈倍率でサンプルを染色する。覆ったチューブを4 °Cのインキュベーターに15～20分間置く。
    5. 染色した各チューブに1 mLの1x透過化バッファーを加え、500 x gで5分間遠心分離して洗浄する。
    6. 上清を捨て、ペレットを分散させ、1 mLの1x透過化バッファーに細胞を再懸濁する。前と同様に遠心分離を行う（ステップ9.5）。
    7. ステップ2.9.6を繰り返し、計3回洗浄する。上清を捨て、ペレットを分散させる。
    8. 細胞を200 µLの1x透過化バッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで解析するまで氷上で保持する。
  10. 細胞を固定しない場合は、200 µLのフロー用PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで解析するまで氷上で保持する。
  11. scRNA-Seq解析を行う場合は、デブリおよび死細胞の除去、RNA品質の評価、およびライブラリ作製に関するプロトコルに従う。

3. scRNA-Seqライブラリ品質の評価

  1. 細胞に確実にマッピングされたリードの割合が高いことを確認してください。理想的には、この数値は90%以上となります.
  2. ユニーク分子識別子（UMI）カウントをバーコードと比較します。高品質なサンプルでは、約10,000個のバーコードでUMIカウントが急激に減少します（バーコードランクプロットにおける「ニーベンド」）。
  3. 一様多様体近似および投影（UMAP）を確認します。乳腺や自然発生的な乳癌などの複雑な組織から得られた高品質なサンプルでは、明確に分離した細胞クラスターが観察されます。
  4. 発現しているミトコンドリア（mt-）遺伝子の数を確認します。ミトコンドリア遺伝子の数が多いクラスターは、細胞が死滅しているか、死にかけていることを示しています。

結果

HER2は、女性に侵襲性の乳腺腫瘍を誘発する腫瘍オンコジーンであり、HER2標的モノクローナル抗体療法を受けた女性の最大70%が、治療に反応しないか、あるいはHER2標的療法に対する耐性を獲得します15,16,17,18。最終的な目標は、HER2/neuに対する免疫応答を活性化させ、HER2免疫を改善し、生存率を高めることです。HER2/neu免疫を研究するため、HER2/neuによって自発的な乳腺腫瘍を発症する免疫能を有するマウスモデルが使用されます2,19。HER2はヒトのErbb2によって、neuはラットのErbb2によってコードされています。BALB NeuTマウスは、MMTVプロモーターによって駆動される、形質転換能を持つラットneu (NeuT) トランスジェネーションを保有しています19。NeuはBALB背景の思春期雌マウスの乳腺で発現し、その結果、すべてのトランスジェニック雌において、いずれかまたはすべての乳腺に管管状癌を発症させます（Figure 1A、挿入図）。neuの持続的な発現により、生後14週から19週の間に触知可能な腫瘍が生じ、それは進行性に増大します1。自己のneuと異種HER2の両方をコードするプラスミドDNA（pNeuE2TMと命名）を用いたトランスジェニックマウスへのワクチン接種は、neuに対する免疫寛容を打破し、全身的なneu標的ポリクローナル抗体およびIFN-γ分泌脾臓T細胞の増加をもたらします1。この免疫応答により、neu発現TUBO腫瘍細胞の拒絶が誘導されました。全身的な応答は有益な情報となりますが、腫瘍部位における作用機序を理解することはできません。そこで我々は、細胞表面マーカーを保持しつつ、高い生存率で単一細胞を得るための、乳腺および乳腺腫瘍組織の解離プロトコルを開発することとしました。Figure 1にワークフローの概要を示します。簡潔に述べると、採取後、組織をメスで細かく刻み（Figure 1B）、コラゲナーゼtype II 2部とコラゲナーゼD 1部の混合物およびDNase Iを含むRPMIベースの組織消化バッファーに入れ、シェイキングインキュベーター内で30分間処理し（Figure 1C–D）、続いて0.5 M EDTAでさらに5分間処理します（Figure 1E）。FBS含有洗浄バッファーを添加して消化を停止させ、混合物をろ過して組織残渣を除去します（Figure 1F）。洗浄工程と赤血球溶解（Figure 1G–H）の後、細胞を30 µmストレーナーでろ過し、カウントします（Figure 1I–Kおよび Figure 2）。この時点で、細胞をフローサイトメトリーやscRNA-Seqなどのダウンストリームワークフローに割り当てることができます。

直接比較するため、市販のキットを用いて並行して解離を行いました。「Tough」腫瘍に対しては既報のプロトコルに従い、酵素の中和後、サンプルを同一の方法（すなわち、RBC溶血など）で処理しました。市販のキットでは、1.3 × 106 cells/mLが76%の生存率で回収されましたが、本プロトコルでは、4.5 × 106 cells/mLが89%の生存率で回収されました（Figure 2A,B）。RBC溶血後、2つのプロトコルの間のデブリ量は同程度でした。死細胞を除去するため、各プロトコルの1 × 107 cellsを死細胞除去パイプラインで処理しました。市販のキットでは、96%の生存率で1.3 × 106 cells/mLが回収されたのに対し、本報告のプロトコルでは、98%の生存率で1.94 × 106 cells/mLが回収されました（Figure 2C,D）。したがって、本報告のプロトコルは、特殊な装置を必要とせずに、下流解析に向けたより高収量の生存細胞を得ることができました。

本プロトコルで得られた細胞懸濁液の品質および再現性を具体的に評価するため、16～18週齢の未処置の雌性BALBマウスおよびBALB NeuTマウスから乳腺サンプルを採取した。BALB NeuT組織には、乳腺組織と腫瘍組織の両方が含まれていた。鼠径乳腺脂肪体（第4および第9乳腺）から組織を採取し（BALB NeuTでは腫瘍組織を含む）、後続の解析のために均一な溶液へと分散させた。なお、乳腺の採取前にセンチネルリンパ節を除去したことに留意されたい。

処理後、細胞表面マーカーの保持と細胞生存率を確認するためにフローサイトメトリーによる評価を行い（図3）、ライブラリ作成に向けた細胞調製物の品質を検証するためにscRNA-Seqによる解析を行った（図4）。死細胞除去前の乳腺または腫瘍由来の単一細胞の生存率は、平均して85%以上であった。scRNA-Seq用に生存率の高い開始細胞調製物を生成するために、市販の死細胞およびデブリ除去キットを使用することができる。これらのプロトコルに従った結果、単一細胞調製物の生存率は94%から98%の範囲であった（図2C,F）。本プロトコルで得られた細胞を固定し、市販のサーモリシンを用いた「商用固定優先解離プロトコル」と呼ばれるscRNA-Seq推奨の固定法と比較した（図2E,F）。商用固定優先解離プロトコルでは、1.5 × 107 cells/mLが得られたが、解離前に組織を固定するため生存率は測定されなかった。一方、本プロトコルでは、開始時の生存率が94%の場合に 8.6 × 106 cells/mLが得られた。したがって、商用固定優先解離プロトコル法は、本報告のプロトコルと同等か、わずかに多い細胞数を回収した。

細胞を染色し、フローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーを評価した。上皮細胞（図 3A）および線維芽細胞（図3B)は、それぞれEpCAMおよびPdgfrb/CD140a mAbによる染色によって同定された。BALB NeuTマウスへのHER2/neu DNAの3回ワクチン接種により、腫瘍発症の有意な遅延と全身性免疫が誘導されたため、乳腺および腫瘍における免疫細胞を評価することが特に重要であった。CD45+ 免疫系細胞が細胞懸濁液の約50%を占めていた（図3C）。B細胞およびT細胞の存在は、B20/CD45RおよびCD3を用いて評価した（図3D）、およびCD3+T細胞はさらに、CD4およびCD8に細分された（図 3E）。希少な細胞集団を保持する能力を評価するため、サンプルを制御性T細胞で染色した。そのために、細胞サンプルを固定し、Treg特異的な転写因子であるFoxp3を染色した。制御性T細胞は通常、体内の全免疫細胞集団の中でわずかな割合しか占めていないが、免疫系の調節におけるその役割は、がん研究および自己免疫疾患の分野で大きな関心を集めている。したがって、組織解離プロトコルを検討する際、制御性T細胞のような、数は少ないが重要な免疫細胞集団を確実に回収することは極めて重要である。Foxp3+ CD3でサブゲートした後、制御性T細胞を同定した。+CD4+ CD25（高親和性IL-2受容体）およびFoxp3を発現する細胞。このゲーティング戦略を用いることで、CD4+細胞の約5%が+ 細胞は両方のマーカーに対して陽性であったが、約25%はFoxp3陽性でありながらCD25が低発現または陰性であった（図3F）。CD64が確実に発現していることを確認するため、別の腫瘍サンプルを用いてCD64の評価を行った。+ この解離法を用いることで、マクロファージを正常に単離することができました（図 3G）。より広範な骨髄系細胞群を特定するため、F4/80+マクロファージおよび樹状細胞として同定されるF4/80- CD11c+細胞を（図3H）。樹状細胞は全細胞の約3%を占め、一方でCD1b+Ly6G+ 好中球が約5%を占めていた（図 3H私は）。したがって、CD45における表面エピトープの信頼性の高い回収と保存が達成された。+ 上記プロトコルを用いて乳腺組織および腫瘍組織の両方を解離させた後の細胞。

scRNA-Seqライブラリ作成のために提出する前に、サンプルのRNA完全性を評価することができる。市販のプロトコルまたは本報告のプロトコルを用いて調製した新鮮なサンプルでは、A260/230比がそれぞれ1.9および2.2であった。固定サンプルの評価は、200ヌクレオチド（nt）を超えるリードの割合を決定することで行う。本報告のプロトコルに従い、直ちに固定して–で保存したところ、80 °C、その結果、サンプルの83%にリードが含まれていた。 > 20 nt

サンプルの品質

scRNA-Seqライブラリの調製およびシーケンシング後、サンプルの品質を評価した（図4）。scRNA-Seqサンプルライブラリは、まずセルコーリングとマッピング品質の指標、バーコードランクプロット、シーケンシング飽和度、およびUMAPプロジェクションを用いて評価される。ここで述べた解離プロトコルを用いてBALB乳腺組織を解離させたところ、16,182個の細胞が得られ、リードの97%が細胞に割り当てられた。細胞外RNAに割り当てられたリードが少なかったことから、サンプルが健全であることが示された。細胞外に記録されたリードの割合が高いことは、死細胞または死にゆく細胞からのアンビエントmRNA汚染レベルの上昇を意味する。マッピング品質とは、プローブセットにマッピングされたプローブの割合であり、本件では9.1%であった。シーケンシング飽和度はプラトーに達しており、これはユニークな遺伝子ではなく、すでに特定された遺伝子の重複読み取りが起きていることを示している。バーコードランクプロットはUMIカウント対バーコードを示しており、高品質なサンプルでは、~10K UMI付近で明確な急落、すなわち「ニーベンド（knee bend）」が見られる（図4A). 最後に、UMAPプロジェクションにより、いくつかの明確なクラスターが示された（図4A）。これらの指標はすべて、scRNA-Seqライブラリが高品質であることを示している。

本プロトコルの質を、Flex化学向けに推奨されている市販の固定後解離プロトコルと比較するため、市販の固定後解離プロトコルを本プロトコルと並行して実施し、得られたライブラリの質を評価しました。BALB乳腺サンプルの市販固定後解離プロトコルでは、720個の細胞が回収され、リードの68%が細胞内にあり、マッピングクオリティは89.3%でした。同様に、飽和度はプラトーに達し始めていましたが、遺伝子/細胞数は生細胞解離と比較して明らかに低い値となりました（生細胞解離では4,50 genes/cellであったのに対し、市販固定後解離プロトコルでは1,0 genes/cell）。バーコードランクプロットにはニーベンド（屈曲点）が見られず（Figure 4B）、明確なクラスターは存在するものの、その数はより少なくなっていました（Figure 4B）。

BALB NeuT腫瘍を含む乳腺組織ライブラリについても品質評価を行った（Figure 4C,D）。本手法で述べた生細胞解離を用いたところ、18,07個の細胞がシーケンスされ、リードの97%が細胞内にあり、99.1%がプローブセットにマッピングされた。ニーベンド（knee bend）が認められ（Figure 4C）、クラスター間の明確な分離も見られた（Figure 4C）。市販の固定優先解離プロトコルは、腫瘍が存在する場合に高い性能を示し、7,19個の細胞がシーケンスされ、リードの91%が細胞内にあり、98.6%がプローブセットにマッピングされた。バーコードランクプロットではより良好なニーベンドが見られたが（Figure 4D）、シーケンス飽和状態であったにもかかわらず、UMAP投影における明確なクラスターは少なかった（Figure 4D）。

追加の品質指標として、細胞クラスターによって発現しているミトコンドリア遺伝子の数を決定することが含まれます。良好な細胞分離はサンプルの品質を示す指標となり、「reads in cell」の割合が高いことはサンプルの健全性を示しています。ミトコンドリア遺伝子（「mt-」で表記）の数が多い細胞は、オープンソースまたはベンダー提供のクラスター分析ツールを用いて特定し、除去することができます。サンプルの直接比較は、Cell Rangerアプリケーションでサンプルを集約してバイオインフォマティクスによる直接比較を行うか、あるいはオープンソースやベンダー提供のクラスター分析ツールの「integration」スクリプトを使用して行うことができます。細胞クラスターは、既知の細胞系譜マーカー（例：免疫細胞の場合はCD45/Ptprc、上皮細胞の場合はEpCAM、線維芽細胞の場合はFapまたはPdgfra）をクエリすることで特定されます。既知の系譜マーカーで細胞クラスターを定義できない場合は、発現量の高い上位10〜15個の遺伝子を遺伝子セット濃縮解析ツールで分析し、考えられる細胞タイプに関する知見を得ることができます。あるいは、高発現遺伝子をリファレンス細胞アトラスツールを用いてクエリし、既知の細胞タイプでの発現を確認することも可能です。


ミトコンドリア遺伝子数が高い細胞を各サンプルから除外した結果、BALB乳腺では16,14個の細胞（ミトコンドリア遺伝子量が高い細胞の0.5%）が、BALB NeuTでは18,024個の細胞（0.3%）が残りました。市販の固定優先解離プロトコルを用いたサンプルでは、BALB乳腺で627個（ミトコンドリア遺伝子量が高い細胞の13%）、BALB NeuTで6,181個（14%）の細胞が保持されました。

本稿で詳述する生細胞解離プロトコルのため、BALBおよびBALB NeuTの乳腺の統合が行われ、Figure 4E,Fに示されています。サンプルの比較により、ライブラリ間で同様の細胞集団が存在することが示されました（Figure 4E, F、および Table 1）。既知の細胞系譜マーカーを用いて細胞クラスターをラベル化し、サンプル間の比較を行いました。免疫細胞集団にはT細胞、B細胞、マクロファージクラスターが含まれ、非免疫細胞集団には上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞が含まれていました。当然ながら、BALB NeuTサンプルには腫瘍細胞の集団が追加で認められました（Figure 4F）。特定の細胞集団に着目すると、腫瘍を保有するBALB NeuTサンプルではマクロファージが多く、T細胞および非腫瘍性上皮細胞は少なくなっていました。scRNA-Seq解析により、BALB乳腺由来の上皮細胞と同程度の集団と、NeuT側の対照群における有意な上皮細胞/腫瘍細胞の集団が示されました。次元削減プロットでは、正常な乳腺常在性上皮細胞集団と、BALB NeuTサンプルに特異的な上皮腫瘍細胞との明確な区別が示されています（Figure 4E,F）。

上皮細胞群を確定した後、BALBおよびBALB NeuTサンプル間でストローマ細胞の評価を行いました。線維芽細胞で発現する血小板由来成長因子受容体α（Pdgfrα）遺伝子の解析により、BALBおよびBALB NeuTサンプルの両方において、明確な線維芽細胞集団が同定されました。BALBのscRNA-Seqサンプルでは、Pdgfrαを発現する線維芽細胞が細胞全体の15%を占めており、これはフローサイトメトリーによる解析で得られた線維芽細胞の割合である29%（Figure 3B）よりもやや低い値でした。生存率およびシングルセルのゲーティング後、PDGFRα (CD140a)マーカーを用いてフローサイトメトリーにより線維芽細胞を同定しました。後続の解析方法にかかわらず、各サンプルで観察された結果は、この解離プロトコルが時間の経過や複数回の試行においても一貫していることを裏付けています。

CD45タンパク質は、以下の遺伝子によってコードされています。 Ptprc 遺伝子およびRNAシーケンシングにより、Ptprc発現細胞の解析を行ったところ、サンプル内に高度に同定可能なリンパ球クラスターが認められた（図 4E）。リンパ球集団をさらに評価するため、以下の手法を用いてB細胞およびT細胞集団の評価を行った。 Cd3e+ または Cd79a+ (図 4E,F）。単一細胞シーケンスデータの評価により、これらの集団は明確に区別されましたが、scRNA-Seqによってさらにいくつかのサブクラスターが特定されました。 Cd3を発現するT細胞。シーケンス解析による追加の免疫細胞数測定では、BALB NeuTサンプルにおいてマクロファージの増加が示されており、これは以下の発現によって示されている。 ItgamおよびAdgre1 (F4/80) (図4F）。scRNA-Seqにおける希少細胞集団の同定能力を評価するため、Foxp3の発現により制御性T細胞を同定した（図4F調節性T細胞はscRNA-Seqライブラリ中に存在していましたが、独立したクラスターとして識別されるほど十分な数ではありませんでした。そのため、これらはT細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞と共にクラスターを形成しました。

最後に、scRNA-Seqライブラリ内で好中球（PMN）を同定できる能力は、これまで困難な課題であり、他の市販の乳腺解離プロトコールでは達成されていませんでした20。フローサイトメトリーを用いた解析では、免疫細胞の約5%がLy6GおよびCD1bを発現する好中球として同定されました（図 3H）。scRNA-Seqライブラリ内で好中球を同定するための推奨事項は、ベンダーのパイプラインを使用して再クラスター化し、標準的なニーベンド（knee bend）以下の細胞を抽出することです。この手法をBALBおよびBALB NeuTの乳腺ライブラリの両方に適用しました。マクロファージに通常関連する遺伝子（Ptprc, Adgre1, Mrc1）のドットプロットを、好中球で発現する遺伝子（S10a8, Trem1, Clec4）と比較しました。その結果、BALBおよびBALB NeuTのいずれのライブラリにも、有意な数の好中球は含まれていませんでした（図 5A,B）。しかし、これはモデルの背景に依存していると考えられ、BALB x PWK背景のF1 NeuTマウスでは、好中球マーカーを発現する細胞クラスターが認められました（図 5C）。

このように、この解離プロトコルにより、BALBマウスおよび自発性乳腺腫瘍を発症したBALB NeuTマウスの乳腺内における細胞型の解明が可能となりました。これらの細胞は生存率が非常に高いため、本手法を用いて、単離した免疫細胞集団の抗腫瘍免疫および抗HER2/neu機能を評価することができます。

scRNA-Seqのための組織処理フローチャート：インキュベーション、遠心分離、細胞ストレーニング、死細胞除去。
図1: 組織解離プロトコルのワークフロー (A乳腺または腫瘍を摘出した。 (B,C）、細かく刻み（D）、そして以下の条件で消化した。 37 °C、コラゲナーゼII型、コラゲナーゼD、およびDNase Iの混合液中で振盪し（E). EDTAを添加し、さらに5分間消化を続けた。 (F) 10% FBSを含むRPMI（R10洗浄培地）を加えて40 mLまで希釈し、消化を停止させた後、懸濁液をフィルターでろ過した。 70 µm フィルター（G）細胞懸濁液を〜で遠心分離した。 4 °C および50倍 g 10分間静置した後、RPMI洗浄用培地で3回洗浄した。H塩化アンモニウムベースの10倍濃縮赤血球溶解液を用いて、赤血球（RBC）を溶解させた。I溶解を停止させるためにR10洗浄バッファーを使用し、細胞懸濁液をフィルターでろ過した。 30 µm フィルター（J,K赤血球溶血後、細胞濃度および生存率を評価する前に、細胞をさらに3回洗浄します。LscRNA-Seqライブラリ作製に細胞を使用する場合は、市販のキットを用い、そのプロトコルに従って死細胞およびデブリを除去する。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞生存率の結果；解離、Chop Fix法；顕微鏡画像；細胞数、生存率。
図2解離の比較本研究で報告する解離プロトコルを、市販のMiltenyiプロトコルおよびscRNA-Seqで推奨される市販の固定後解離プロトコルと比較した細胞数および生存率のデータ。解離後の細胞数は、アクリジンオレンジ/プロピジウムイオダイド（AO/PI）死細胞染色を用いた自動細胞計数装置を使用して算出した。死細胞を除去した後に細胞数を計測し、生存率を記録した。 (A–B) 死細胞除去直前の細胞数および生存率。 (C–D) 死細胞除去後の細胞数および生存率、ならびにscRNA-Seqパイプラインに導入されるサンプルの代表的な指標について。 (E–F) 本プロトコルと市販の固定後解離プロトコルを比較した際の細胞数および生存率。Liberaseを含むプロトコルを用いた解離後の生存率については、解離前に組織サンプルを固定していたため、評価できなかった。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

フローサイトメトリー解析グラフ；CD45、EPCAM、PDGFRa、リンパ球、骨髄系細胞の染色結果。
図3分散組織のフローサイトメトリー解析。 免疫細胞の存在と生存能を確認するため、代表的なBALBおよびBALB NeuTサンプルを解析した。まず細胞の生存能でゲートをかけ、次にサブグループの同定を行う前にシングレットを特定した。上皮系およびストローマ系細胞が回収されているかを確認するため、それらをまず評価した。上皮由来細胞の同定にはEpCAMを用いた（A), およびPDGFRa 線維芽細胞を同定するために使用された（B) 免疫細胞集団を評価したところ、乳腺における全細胞の51%がCD45陽性であった（C) B細胞 (B20+) および T 細胞 (CD3+) 個体群は、解離させたマウス乳腺組織から得られた（D）、およびCD8+ およびCD4+ 腫瘍組織からサブゲートし、各細胞集団を抽出した（E) このプロトコルで希少な細胞集団を効果的に単離できるかを確認するために、（F) 腫瘍組織中のTregはFoxp3を用いて評価した。+ 発現。これは、まずCD3でゲーティングを行うことで実施した。+ およびCD4+ 集団、およびその集団内でFoxp3陽性である細胞を特定すること+ およびCD25+ （約6%）。(G) 腫瘍組織由来CD64+マクロファージの評価 (H) CD1b+ 細胞をさらに解析し、F4/80およびCD1cの発現を調べた。F4/80については、− CD1c+ 樹状細胞として同定された細胞。I) 好中球は、CD45を発現している細胞として同定した。+, Ly6G+、およびCD11b+であるが、F4/80陽性であった−. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マウスの乳腺および腫瘍における細胞解離効率のグラフと細胞クラスター図。
図4scRNA-Seqライブラリの評価 固定試料を用いてscRNA-Seqライブラリを作成しました。ここでは、本稿で報告されている固定処理に先立って本手順に記載の生細胞解離プロトコルを用いるか、または推奨されている市販の固定優先解離プロトコルのいずれかを採用しました。A) 生細胞解離BALB乳腺scRNA-Seqライブラリの品質管理。16,182個の細胞をシーケンシングし、リードの97.1%が細胞内に確実にマッピングされ、98.8%がフィルタリング済みプローブセットに確実にマッピングされた。上部にニーベントプロット、下部にUMAPプロジェクションを示す。急峻なニーベントおよび明確な細胞クラスターは、ライブラリが高品質であることを示している。B) 商用の固定優先解離プロトコルを用いたBALB乳腺のscRNA-Seqライブラリの品質評価において、ニーベンド（knee bend）の欠如と細胞数の少なさ（n = 720）が認められた。CBALB NeuT乳腺scRNA-Seqライブラリを、ここに記載したプロトコルに従って作成した。18,077個の細胞をシーケンスし、リードの97%が細胞にマッピングされ、98.9%がフィルタリング後のプローブセットにマッピングされた。急峻なニー bend（knee bend）および明確なクラスターの形成は、良好な品質であることを示している。一方、市販の固定優先解離プロトコルを用いたBALB NeuTライブラリ（D) 7,19個のシーケンス済み細胞全体において、弱いニーベンド（knee bend）は見られるものの、明確な細胞クラスターは認められません。ライブラリ作成後、Cell Rangerを用いてBALBおよびBALB NeuT乳腺ライブラリを統合し、次いでLoupe Cell BrowserでのK-means法によるクラスタリングを行い、直接比較しました。T-SNEプロット（に示されるように、BALB/c乳腺を構成する細胞は10個の固有のクラスターによって定義されます。E,F）。NeuTトランスジェニック（F) 乳腺において、腫瘍細胞の集団がさらに認められた。リンパ球のクラスター内では、 Cd4- および CD8a-発現細胞が全体に分布している。 Cd4 発現はインセットに示されている。Foxp3の発現によって定義される制御性T細胞は、独立したクラスターを形成するほど十分な数ではなかったが、ハイライトされたフィーチャープロットに示されるように、T細胞と共にクラスターを形成していた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

乳腺および腫瘍サンプルの発現量と割合を詳細に示す遺伝子発現解析図。
図5好中球（PMN）の同定。 PMNは、RNA転写レベルが低く、品質も低いため、scRNA-Seqライブラリにおいて同定することが非常に困難であることで知られている。 Ly6g 発現。scRNA-Seqライブラリ中のPMNは、Cell Rangerの「count」コマンドを使用し、コマンドラインに「force cell = 80」オプションを含めることで特定できる。この解析は、BALB（A) およびBALB NeuT（B）乳腺ライブラリにおいて、PMN特異的遺伝子を発現していた細胞はわずかであった。BALBおよびBALB NeuTのすべての骨髄系細胞クラスターにおいても、同様に発現が認められた。 Adgre1 (F4/80)および Mrc1 (CD206)。骨髄系細胞集団において、PMN特異的遺伝子を発現している細胞はごくわずかである。 S10a8, Trem1、および Clec4eしかし、この結果はモデルのBALB背景によるものであり、本法で述べられている、(BALBxPWK)F1 NeuT雌マウスから解離技術を用いて調製したscRNA-Seqライブラリでは（C）、force cellコマンドを使用しなかった場合、PMN特異的遺伝子を発現しているが、[以下欠損]を発現していない細胞クラスターが存在することが観察されました。 Adgre1これは、本解離プロトコルによって、他の骨髄系細胞集団に加えてPMNを実際に回収できることを示しています。赤い長方形の枠は、～を発現しているクラスターを強調しています。 Adgre1. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

BALB NeuT腫瘍フローサイトメトリー単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-Seq）
CD3 / リンパ球全細胞の6%
（CD45+細胞の12%）		全細胞の7%
CD4 / Cd4全細胞の3.9%
（CD45+CD3+細胞の65%）		全細胞の4%
CD8 / Cd8a 全細胞の1%
(CD45+CD3+細胞の17%)		全細胞の0.9%
Foxp3 / Foxp3総売上の0.8%
（CD3+CD4+細胞の3%）		全細胞の0.7%
F4/80 / Adgre1全細胞の20% 全細胞の16%
CD64 / Fcgr1非翻訳全細胞の14%
PMN/好中球全細胞の2%（CD45+細胞の5%）全細胞の0.05%
PDGFRa (CD140a)
/ ストロマ		全細胞の29%全細胞の10%
EpCAM / 上皮系全細胞の32%全細胞の54%
NT（未試験）

表 1：シングルセルRNAシーケンシングおよびフローサイトメトリーを含むダウンストリーム手法を用いて、本解離プロトコルから得られた細胞割合の比較。

ディスカッション

この解離プロトコルにより、親組織を代表する細胞集団で構成される単一細胞懸濁液を一貫して作製することが可能です。乳腺組織から、より大きな線維芽細胞や脂肪細胞幹細胞を含む代表的な細胞型を単離するために、500 x gの遠心力が用いられました14,21,22。免疫細胞、上皮細胞、および間質細胞集団を含む複数の細胞型において、生存率と細胞表面エピトープが確実に維持されます。この解離プロトコルの利便性の一つは、特殊な装置を必要とせず、初期の組織採取からさらなる処理が可能なクリーンな細胞懸濁液に至るまでの所要時間が比較的短いことです。全体として、このワークフローは開始から完了まで約3時間で完了し、サンプルを一晩酵素に曝露させる必要がある同様の酵素的解離プロトコルよりも優れています。本プロトコルは2023年以降、提供された形式で当研究室および他の研究室で開発・使用されてきました。直近の6ヶ月間だけで、当研究室ではこのプロトコルを37回実施し、同様の結果を得ており、あらゆるレベルのトレーニング受講者が正常に完了しています。フローサイトメトリーやscRNA-Seqライブラリの作製に加えて、本プロトコルはex vivo機能解析のための腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および腫瘍関連マクロファージ（TAM）の単離にも利用されています。本結果は、この解離プロトコルで主要な細胞集団を同定できることを示していますが、フローサイトメトリーとscRNA-Seqは根本的に異なることに留意することが重要です。フローサイトメトリーは、単一細胞レベルで複数のマーカーの発現を研究するように設計されており、ゲートおよびサブゲートを利用してこの目的を達成します。一方、scRNA-Seqは、ゲートやサブゲートを用いることなく、細胞クラスター全体の遺伝子発現の変化を同定するように設計されています。

プロトコルのトラブルシューティングは以下の通りです：1) 不完全な消化：組織サンプルの消化は、物理的な解離に大きく影響されます。組織をペースト状になるまで細かく刻み、広げて組織片のサイズを確認してください。この工程は、想定よりも時間がかかることが多いです。解離が不完全な場合、免疫細胞と比較してストローマ細胞および上皮細胞の数が減少します。2) 低い生存率：細胞の生存率は、消化時間およびコラゲナーゼ type II とコラゲナーゼ D の 2:1 の比率を維持しているかどうかに影響されます。コラゲナーゼ type II が不足すると、細胞生存率が著しく低下します。さらに、サンプルの生存率が 70–85% の間である場合、市販の死細胞除去システムが生存率の向上に有効であり、scRNA-Seq ライブラリ作製にサンプルを提出する前に使用することが推奨されます。3) 高い細胞残骸量：細胞残骸は、多くの場合、物理的解離および消化の副作用として生じます。残骸は、密度勾配培地または密度を大幅に下げた市販の残骸除去溶液を使用することで最も効果的に除去できます。4) ペレット回収率の低さ：サンプルの回収率の低さは、主に開始時の組織量に影響されます。本プロトコルは、2 つの乳腺または 10 から 20 mg の中規模腫瘍に合わせて最適化されています。開始時のサンプルサイズが乳腺 1 つ分未満であるか、腫瘍が ~200 mm3 より小さい場合、細胞収量は低くなります。組織サイズが小さい場合は、液量を 50% 削減できます。同様に、大きな腫瘍または複数の乳腺（4 つ以上の乳腺、または ~25 mg より大きな腫瘍）がある場合は、液量を 1.5 × に増量できます。~25 mg より大きいサンプルは、分割して処理してください。5) scRNA-Seq 品質の低下：scRNA-Seq ライブラリの品質は、ほぼ完全に元のサンプルの品質に依存します。腫瘍組織を扱う場合、初期の gel-bead in emulsion (GEM) および cDNA 生成のタイミングが不可欠です。そのため、プローブベースの固定RNA単一細胞化学システムなど、即座に RNA 固定へ移行できるプロトコルを採用することで、サンプル品質に影響を与える変数としての時間を排除できます。とはいえ、scRNA-Seq パイプラインに入る前に RNA 品質を評価することで、得られるライブラリが有益な情報を持つことが保証されます。6) 期待より少ない細胞クラスター：scRNA-Seq の結果において、少数のユニークなクラスターで遺伝子発現レベルが低い場合は、ライブラリを再シーケンシングしてリード数（シーケンス深度）を増やすことができます。また、免疫細胞のみを対象とする研究の場合、ライブラリ作製の前に CD45+ 分画を精製することで、シーケンシング感度を高めることができます。

上述の市販の固定・解離プロトコルは、脂肪組織の処理において課題がありました。主に、固定された脂肪組織は浮上しやすく、その後の解離および効果的なろ過が困難でした。そのため、本研究で用いた市販の固定・解離プロトコルへの脂肪組織の使用は推奨されません。単細胞懸濁液への解離前に組織を固定すると、固定後の生存率測定や解離といった品質管理ステップが省略されてしまいます。これにより、後続のscRNA-seqに供する前のサンプル品質の推定が困難になりますが、これは組織解離プロセスにおいて不可欠なステップです。後続のscRNA-seqに向けた組織固定は、RNAを分解させる可能性があります。RNAの品質は、固定細胞サンプルのヌクレオチド（nt）リード長を調べることで評価できます。サンプルのうち、以下の割合が高いほど >200 ntのリードがあり、品質が高いほど望ましい。RNA整合性スコア（RNA integrity score）を持つサンプルは、 >リードを含むサンプルの30% >200 ntであり、これにより高い信頼性でscRNA-Seqライブラリを生成することが可能になります。本報告におけるBALB乳腺およびBALB NeuT腫瘍組織の固定サンプルでは、リードの83%および82%が >それぞれ200 nt。

乳腺などの脂肪含量が高い組織は、脂肪細胞が高品質な細胞調製の妨げとなるため、問題となります。ほとんどの脂肪細胞は円錐チューブの上部に留まるため、吸引または上清の廃棄によって除去できます。New Zealand Obese (NZO) 背景の雌個体などの極めて脂肪質の多い乳腺では、脂肪細胞の除去を容易にするために、清潔な低発塵のラボワイプでチューブの上部を拭き取るという追加手順が必要であり、その後、脂肪を完全に除去するために追加の洗浄工程が必要であることがわかりました。また、乳腺組織は収量が低くなる傾向があります。この問題を軽減するため、可能な限りサンプルをプールして細胞収量を高めます。非常に硬い腫瘍の場合、適切な微切化（mincing）が不可欠です。これにより、生存率の高い単一細胞を調製するために必要な時間内で、コラゲナーゼが分解すべき表面積が適切に確保されるためです。

しかしながら、本プロトコルには限界もあります。不均一な細胞混合物を得る際、上皮細胞を完全に消化して単一懸濁液にすることは困難です。BALB NeuT乳腺腫瘍は一般に硬く、腫瘍カプセルと強固な間質成分を有しています。対照的に、浸潤免疫細胞の回収には酵素への曝露時間がほとんど必要ではなく、過剰な曝露はそれらの表現型状態を変化させる可能性があります。したがって、浸潤好中球を含むこれら多様な細胞型の品質を維持しつつ腫瘍細胞および間質細胞を回収するためには、妥協点を見出す必要があります。そのため、本プロトコルで得られる上皮細胞および間質細胞の割合は、親組織に実際に存在する割合よりも低くなる可能性があります。本プロトコルは、生存率が高く、かつ高品質で不均一な細胞サンプルを回収するための最善の手法を決定するため、コラゲナーゼ酵素の比率と解離時間を評価する多くの試行を通じて最適化されました。本プロトコルを用いることで、今後の方向性として、乳腺腫瘍の発症および進行過程における浸潤免疫細胞の ex vivo 機能解析を行い、治療の好機を特定することが挙げられます。 

開示事項

著者に開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究で提示されたデータの一部は、ミシガン州立大学の研究・イノベーション局（Office of Research & Innovation）の支援を受け、ゲノミクス・コア（Genomics Core）（RRID: SCR_012406）の装置を用いて取得されました。 

本研究はCA278818の助成を受けて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMIGibco11875-093
DNAseInvitrogen18047019
コラゲナーゼDシグマ11088866001
コラゲナーゼIIWorthington BiochemicalLS004177
ウシ胎児血清VWR97068-085
10倍PBSGibco70011-044
アジ化ナトリウムVWR0639-250G
MACS Smart Strainer, 70 µmMiltenyi Biotec130-110-916
MACS Smart Strainer, 30μm µmMiltenyi Biotec130-110-915
EDTAMillipore324506-100ML
10倍赤血球溶血バッファーeBioscience/Invitrogen00-4300-54
Foxp3/転写因子固定・透過化キットeBioscience/Invitrogen00-5523-00
Brilliant染色バッファーInvitrogen00-4409-42
Mojosort 死細胞除去キットBiolegend580157
Mojosortバッファー (5x)BioLegend480017
Quick-RNA Miniprep Plus KitZymo ResearchR1057
腫瘍解離キット、マウス用Miltenyi Biotec130-096-730
血小板由来成長因子受容体α PerCP-eFluor710Invitrogen46-1401-80
Epcam eF450Invitrogen48-5791-82
CD11c APCBiolegend117310
CD11b AF700Invitrogen56-0112-82
Fixable Viability Dye eF780Invitrogen65-0865-14
B220/CD45R AF488Biolegend103225
CD3 PE-Cy7Invitrogen25-0031-82
CD49b PerCP-eFluor710Invitrogen46-5971-82
CD8a BV480Invitrogen414-0081-80
CD4 SB600Invitrogen63-0041-82
CD45 BV711Invitrogen407-0451-80
FOXP3 抗原提示細胞（APC）Invitrogen17-5773-82
Ly6G APCInvitrogen17-5931-82
Ly6C PECy7Invitrogen25-5932-82
CD64 PerCP-eFluor71046-0641-80
TruStainBiolegend101320
10x Genomics GEM-X Flex 遺伝子発現試薬キット10x Genomics(https://www.10xgenomics.com/blog/answering-your-questions-about-single-cell-analysis-in607 clinical-ffpe-samples);1000781
Attune NxT フローサイトメーターThermo Fisher Scientific赤色、青色、および紫色レーザーチャネルを用いたフローサイトメトリーデータの収集に使用される。
FCS Expressデノボ・ソフトウェアフローサイトメトリーデータの解析に使用。
Miltenyi社製腫瘍組織解離キット市販の腫瘍解離キット
Miltenyiキット / Miltenyiプロトコール市販のキット" または "リファレンスキット
Liberase酵素市販のサーモリシン/コラゲナーゼ混合物
チョップフィックス市販の固定後解離プロトコル 
フレックスケミストリー / フレックスケミストリーシステムプローブベースの固定RNA単一細胞化学解析法
Seurat(https://satijalab.org/seurat/)オープンソースおよびベンダー提供のクラスタリングツール
Cell Rangerオープンソースおよびベンダー提供のクラスタリングツール
 Loupe Cell Browser オープンソースおよびベンダー提供のクラスタリングツール
EnrichRhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/) 遺伝子セット濃縮解析およびリファレンス細胞アトラスツール
マウス・アトラスhttps://tabula400 muris.sf.czbiohub.org/visualizations遺伝子セット濃縮解析およびリファレンス細胞アトラスツール
タブラ・サピエンスhttps://tabula-sapiens.sf.czbiohub.org/遺伝子セット濃縮解析および参照細胞アトラスツール
Cellometer K2" 装置および "アクリジンオレンジ/プロピジウムヨード (AOPI)" アクリジンオレンジ/プロピジウムヨード（AO/PI）生存率染色機能を備えた自動細胞計数装置
キムワイプ低リントラボ用ワイプ
STEMCELL Technologies密度勾配媒体（例：FicollまたはPercollタイプ媒体）
Ficoll/Percoll10番メス刃
10番メスナイフ2本
Cellometer K2 + AOPI試薬アクリジンオレンジ/プロピジウムヨード（AO/PI）生存率染色機能を備えた自動細胞計数装置
STEMCELL Technologies幹細胞
Technologies, www.stemcell.com, 2018
Ficoll/Percoll密度勾配媒体 
#10メス 10本外科用メス刃
Foxp3/転写因子固定・透過化キット核内染色が可能な市販の溶液

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