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研究記事

活性炭とベントナイトを用いた高感度ループ増幅法による水産物中のVibrio属菌の検出

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DOI:

10.3791/72887

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2026年9月8日

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1Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 2Departamento de Biotecnología, División de Ciencias Biológicas y de la Salud

この記事について

サマリー

本研究では、海産物中の病原性Vibrio属菌を検出するために、活性炭とベントナイトを用いたループ介在等温増幅法（LAMP）アッセイの最適化を行いました。この前処理により反応阻害物質が効果的に除去され、従来の手法と比較して、大幅に迅速で感度が高く、費用対効果に優れた診断が可能になります。

要約

The ビブリオ属 この属には100種以上の種が存在し、そのうち12種がヒトに対する病原性を持つと考えられている。食品から最も頻繁に分離される種は *V. cholerae* *V. parahaemolyticus*, *V. vulnificus* および *V. alginolyticus*従来の微生物学的手法を用いてこれらを同定する場合の主な問題は、コストが高く、診断に長期間を要することである。そこで、同定のためにループ介在等温増幅法（LAMP法）を用いた。 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, および V. alginolyticusベントナイト含有活性炭（ACB）を用いて阻害物質を除去し、検査の感度を向上させた。pH 6、7、および9の条件に加え、試料とACBの異なる接触時間を検討した。エビ、魚、および牡蠣の試料において、活性炭とベントナイトを用いて反応阻害物質を除去したことで、LAMP法の感度が向上した。テストしたすべての試料において、LAMP法の感度、陰性的中率、陽性的中率、および特異度は90%以上であった。このLAMP法は、～を同定するための代替手法となり得る。 V. cholerae, V. parahaemolyticus, *V. vulnificus* および *V. alginolyticus* 標準法よりも適用時間が短く、感度が高く、コストを低く抑えられるため、水産製品において有用である。

概要

Vibrio属の種は海洋環境に広く分布しており、魚類、軟体動物、または甲殻類と、病原性または共生的な形態で関連している場合があります。12種がヒトに対して病原性を持ち得ることが報告されており、特に水産物からはVibrio cholerae、V. parahaemolyticus、V. vulnificus、およびV. alginolyticusが高頻度で分離されることが明らかになっています。米国では、保健当局の推定により、Vibrio spp.によって年間80,000件以上の感染症が引き起こされています1,2,3,4,5。Vibrio spp.の分離は、前増菌、選択培地での培養、および生化学的・血清学的試験による確認を含む従来の方法によって行われます6,7。これらの従来法は、病原体の分離に長時間を要すること（最大5日間）や、分解能が不足していることに制限があり、表現型および生化学的プロファイルが類似しているため、Vibrio属内の近縁種を正確に識別できないことが多々あります6,7,8。

あるいは、病原体の同定に向けた迅速かつ正確で安価な分子生物学的手法として、ループ介在等温増幅法（LAMP法）が報告されています9,10。この手法は、サーマルサイクラーのような高度な設備を必要としないため、従来のPCRよりも非常に費用対効果が高く、迅速です9。LAMP法では、LAMP法の使用温度である65 °Cにおいて安定な反応生成物であるピロリン酸マグネシウムが沈殿し、反応チューブ内に濁度が生じるため、これを観察することで標的遺伝子を一段階で検出することが可能です。この濁度の増加は合成されたDNA量と相関するため、アガロースゲルやトランスイルミネーターの使用を回避できます11,12,13,14,15.

これらの病原体の検出感度は、Bstポリメラーゼを阻害したり、標的DNAに結合して増幅を妨げたりするプロテアーゼ、カルシウムイオン、グリコーゲン、脂質などの反応阻害剤を除去することで向上させることができます13,16,17,18,19,20。活性炭とベントナイトの組み合わせ（ACB）は増幅阻害剤の除去効率が高く、これにより牡蠣サンプル中のEscherichia coli検出の感度が向上し、さらにACBは市販のキットよりも安価であるためコストを削減できることが報告されています21。

本研究では、水産製品からV. cholerae、V. parahaemolyticus、V. vulnificus、およびV. alginolyticusを直接同定する際の感度を向上させるため、活性炭とベントナイトを用いてLAMP法を最適化することを提案します。この最適化された手法は、時間のかかる前増菌工程を回避し、病原体の迅速な診断に非常に有用であるため、食品業界における日常的なモニタリングおよび品質管理のための実用的な指針となります。期待される性能に関して、本手法は魚類やエビなどのマトリックスにおいて優れた感度（98%超）と特異性（100%）を示します。ただし、考慮すべき主要な制限として、牡蠣などの由来的に汚染度の高い試料では、ACBシステムですべての干渉有機物を完全に除去できない場合があり、これによりアッセイの感度がわずかに低下（94%～98%）する可能性があります。

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プロトコル

本研究ではヒトまたは脊椎動物を対象としていないため、機関の倫理承認は不要でした。使用した試薬および機器は材料表に記載されています。

1. 使用した細菌株およびDNAの抽出

Vibrio cholerae non-O1 CECT 55、V. parahaemolyticus ATCC 17802、V. vulnificus ATCC 29037、およびV. alginolyticus ATCC 17749株を、2% NaClを含むブレインハートインフュージョン（BHI）ブイヨン中で37 °Cで24時間培養した。Escherichia coli ATCC 25922、Cronobacter sakazakii ATCC 12868、Listeria monocytogenes ATCC 49594、およびSalmonella Typhimurium ATCC 14028株は、テストの陰性対照として使用するため、塩化ナトリウムを含まないBHIブイヨン中で37 °Cで24時間培養した。DNA抽出のため、一晩培養した物を遠心分離機を用いて25 °Cで16,000 x gで6分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に捨て、ペレットを500 μLのTAE緩衝液（Tris-酢酸-EDTA、pH 8）中でピペッティングにより完全に再懸濁した。この懸濁液を6分間沸騰させて細胞を溶解させ、直ちに氷上で5分間冷却した。最後に遠心分離を行って細胞残渣を沈殿させ、抽出されたDNAを含む透明な上清を得た。この上清を、LAMP法22,23による増幅のテンプレートとして使用した。

2. LAMPの手順

LAMPで使用したプライマー（Table 1）を用いて、V. cholerae、V. parahaemolyticus、V. vulnificus、およびV. alginolyticusの同定における特異性を検証した。LAMPを用いた各Vibrio種の同定は、各プライマー 1.6 μM、dNTP混合液 1.4 mM、MgSO4 6 mM、ベタイン 800 mM、Bst DNAポリメラーゼ 8 U、およびテンプレートDNA 5 μLを含む、最終容量 25 μLの混合液を反応チューブに調製して行った。反応液を穏やかに混合し、65 °Cのウォーターバスで60分間インキュベートした。インキュベーション後、増幅産物を1.5%アガロースゲルで分離した。その後、1:100に希釈した蛍光DNA染料 1 μLを用いて増幅産物を染色し、ブルーライト透過照明装置で可視化した。病原体同定の陽性判定を行う別の手法として、反応チューブにヒドロキシナフトールブルー（HNB, 125 μM） 4 μLを添加し、肉眼で色の変化を観察した。青色に変化した場合は陽性、紫色に変化した場合は陰性と判定した24。LAMP法の陰性コントロールとして、Escherichia coli ATCC 25922、Cronobacter sakazakii ATCC 12868、Listeria monocytogenes ATCC 49594、およびSalmonella Typhimurium ATCC 14028を用いた。LAMPで得られた増幅産物をアガロースゲルで分離し、透過照明装置を用いて観察した。得られた画像は、MS 1D Analysis Softwareを用いて取得およびデジタル化した。

3. サンプル中に天然に存在するVibrio spp.を除去するためのカキ、エビ、および魚のサンプルの処理

カキ10検体、エビ10検体、および魚類10検体（それぞれ重量約200 g）を入手した。天然に存在するVibrio細胞を除去するため、既報の手法21に従った。各検体から50 gを量り取り、パドルブレンダーを用いて260 rpmで1分間機械的にホモジナイズして均一な組織懸濁液を作成し、その後-70 °Cで72時間保存した。続いて、40 °Cの恒温水槽を用いて検体を完全に融解させ、300 mLのリン酸塩緩衝生理食塩水（0.85% NaCl, pH 9）で洗浄した。前述の手順で検体中のVibrioが正常に除去されたことを確認するため、米国食品医薬品局（FDA）のBacteriological Analytical Manual第9章に記載されている前増菌法7を実施した。検体を含む生理食塩水を450 mLのアルカリペプトン水（APW, pH 9）に置換した。その後、APWを用いて10⁻3希釈まで注意深く段階希釈を行い、24時間培養した。最終的に、各チューブから分注した液をチオ硫酸塩・クエン酸塩・胆汁酸塩・スクロース（TCBS）選択寒天培地に画線し、37 °Cで24時間培養して、特徴的なVibrioコロニーが存在しないことを視覚的に確認した。すべての試験は3連（triplicate）で実施した。

4. ベンナイト配合活性炭（ACB）の調製および細胞回収率の評価

水産物サンプルに含まれる阻害物質を最大限に吸収しつつ、標的細胞の吸収を最小限に抑えるACBの最適条件を決定するため、既報の手法21に従い、ACBと食品サンプルの間の最適pHおよび接触時間を設定した。活性炭を蒸留水で十分に洗浄し、55 °Cで乾燥させた。続いて、32.6 gの活性炭を3.04 gのベントナイトと混合し、均一に分散させるため150 rpmで24時間連続的に攪拌し、55 °Cで乾燥させ滅菌することで、微細で均質な乾燥ACB粉末を調製した。Vibrio細胞を活性炭-ベントナイト（ACB）混合物と混合した後の細胞回収率を評価するため、各菌株を2% NaCl含有BHIブロス中で細胞密度が1.5 x 104 CFU/mLに達するまで個別に培養した。次に、各Vibrio菌株の1 mLを、リン酸緩衝液（PBS, 0.85% NaCl, pH 4、6、および9に調整）100 mLに個別に接種した。この細菌懸濁液を、あらかじめ調製した4.6 gのACBと混合し、接触を促進させるため150 rpmで15分、30分、および60分間攪拌した。各指定接触時間の後、0.1 mLの分注液を注意深く分離し、TCBS寒天培地に塗抹し、37 °Cで24時間培養した後、コロニー数を算出した。

5. 活性炭およびベントナイトで処理した牡蠣、エビ、および魚のサンプルにおけるV. cholerae、V. parahaemolyticus、V. vulnificus、およびV. alginolyticusの検出限界の評価

本研究で使用した各Vibrio属種はBHIブロスで培養し、分光光度計を用いて細胞密度を1.5 x 104, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102, および 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) に精密に調整した。続いて、あらかじめVibrio属の存在を排除する処理を施した各サンプル（牡蠣、魚、エビ）50 gに対し、各Vibrio培養液1 mLを接種した。接種したサンプルをパドルブレンダーで360 rpmで30 s間ホモジナイズし、450 mLのAPW (pH 6) で希釈した。その後、混合液を4 °Cで260 x g、5 min間遠心分離し、大きな残渣を分離した。得られた上清を23 gのACBを含むフラスコに移し、150 rpmで15 min間撹拌して阻害物質を吸着させた後、ろ紙でろ過し、大きな粒子を含まない透明な溶出液を得た。この溶出液を4 °Cで16,000 x g、10 min間遠心分離し、チューブ底面に可視的な細胞ペレットを形成させ、これをDNA抽出に使用した。各Vibrio属種はLAMP法により同定した。陰性対照には、Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, および Salmonella Typhimurium ATCC 14028の菌株を接種したサンプルを用いた。反応混合液をウォーターバスを用い65 °Cで60 min間インキュベートした。インキュベーション後、増幅産物を1.5%アガロースゲルで分離し、蛍光DNA染色剤で染色した。ゲルはブルーライトトランスイルミネーターで可視化した。最後に、目視検出のために各チューブに4 μLのヒドロキシナフトールブルー (125 μM) を添加した24。

6. LAMP法の陽性的中率、陰性的中率、特異度および感度の決定

LAMP法の感度、特異度、および予測値は、30個のサンプル（エビ10個、カキ10個、魚10個）を用いて決定されました。各サンプルには、Vibrioの各菌種に対して設定された最小検出濃度を接種しました。感度と特異度の割合、ならびに陰性的中率（NPV）および陽性的中率25を決定するため、分割表を用いて、実験で得られた真陽性（TP）、真陰性（TN）、偽陽性（FP）、および偽陰性（FN）をまとめました（表 2）。これらのデータに基づき、以下の計算式を適用しました：

感度と特異度の計算式、統計解析、診断テストの評価。

陽性予測値の公式；TP/(TP+FP)；統計解析；ヘルスケアデータの評価

陰性予測値の公式：TN/(TN+FN)、統計解析手法。

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結果

使用した細菌株およびDNAの抽出
後続のLAMPアッセイのテンプレートとして使用するため、すべての病原性株および陰性コントロール株からDNAを抽出した。

LAMPの手順
本研究で使用したプライマーは、各Vibrio種の分子標的に特異的な増幅を行うためのものである。Vibrio株を用いてLAMP法により得られた増幅産物から、各プライマーがそれぞれのVibrio種の標的遺伝子増幅において特異的であることが示された（図1）。

サンプル中に自然に存在するVibrio spp.を除去するための牡蠣、エビ、および魚類のサンプルの処理
サンプルに自然に存在するVibrio spp.を除去するための処理は適切であり、Vibrio spp.を100%減少さ...

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ディスカッション

本研究では、汚染された海産物サンプル中のV. cholerae、V. parahaemolyticus、V. alginolyticusおよびV. vulnificusを検出するためのループ介在等温増幅法（LAMP）の感度を高める最適条件を確立しました。従来の前増菌工程を省くことで、診断時間を大幅に短縮し、水産物から病原体を直接同定するための極めて効率的かつ迅速なアプローチを提供します。

本研究における主要な手法上の改善点は、阻害剤除去ステップの最適化である。従来の手法では、増幅前にpH 4が用いられていたが21、Vibrio種は酸性環境に非常に敏感であるため26、結果としてビブリオ属菌の回収率がゼロとなった。これに対処するため、細胞の回収率向上と天然の反応阻害剤の除去を同時に達成できるよう、条件を系統的に変更した。その結果、ベントナイト含有活性炭（ACB）をpH 6の緩衝液で再懸濁し、サンプルとと...

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開示事項

著者らは、競合する利益がないことを宣言します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
活性炭Sigma-AldrichC2764
ベントナイトSigma-Aldrich682659
ベタインSigma-AldrichB0300
Bio-Image systems トランスイルミネーターBio-Image systemsMBE-CP-01
Bst DNA ポリメラーゼNew England BiolabsM0374
遠心分離機 (モデル J2-HS)Beckman Coulterhttps://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri
Cronobacter sakazakiiATCC12868
dNTP ミキシチャーThermo Fisher ScientificR0241
Escherichia coliATCC25922
ヒドロキシナフトールブルーSigma-Aldrich219916
Listeria monocytogenesATCC49594
Midori Green AdvancedNippon GeneticsMG01
MS 1D 解析ソフトウェアMajor ScienceMBE-IMG-SW
Salmonella TyphimuriumATCC14028
分光光度計 (モデル 6300)Jenway630531
ストマッカー・サーキュレーター (モデル 400)Seward0400/000/AJ
Vibrio alginolyticusATCC17749
Vibrio cholerae no O1CECT55
Vibrio parahaemolyticusATCC17802
Vibrio vulnificusATCC29037
Whatman ろ紙Whatman1001-055

参考文献

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