このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

3D細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

121 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

2026年8月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

この記事について

サマリー

三次元（3D）環境における腫瘍と免疫系の相互作用をモデル化するための、マイクロ流体プラットフォームを用いたプロトコルを提示します。我々の結果から、ナチュラルキラー（NK）細胞は機械的な圧縮下においても抗腫瘍活性を維持することが明らかになりました。

要約

細胞ベースの免疫療法において、機械的な力は免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷能力に大きな影響を及ぼします。腫瘍細胞を殺傷するためには、免疫細胞が標的細胞に力を加え、免疫シナプスを形成して、granzyme Bを含む細胞毒性分子を放出させる必要があります。その重要性にもかかわらず、免疫介在性の殺傷能力を高めるために機械的な刺激をどのように活用できるかは、まだ十分に解明されていません。この知見の不足は、生理学的に現実的な環境において、細胞培養に適切に制御された機械的ストレスを負荷できるツールの欠如が一因となっています。本稿では、細胞外マトリックス（ECM）に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに静的または動的な圧縮を加えつつ、光学顕微鏡を用いて腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできるマイクロ流体圧縮デバイスについて説明します。

このマイクロ流体プラットフォームは、12個のコンパートメント（コントロール群6個、機能群6個）で構成されています。各コンパートメントには、圧力制御ユニットの直下に配置されたセルチャンバーが含まれています。ECMに埋め込まれたスフェロイドがこのセルチャンバー内に配置されます。本プラットフォームを用いて、規定の機械的圧縮下における、乳がん腫瘍スフェロイド（MCF-7）に対するナチュラルキラー（NK）細胞の殺傷効率を調査しました。その結果、1.5 mg/mLのコラーゲン中では、機械的圧縮の有無にかかわらず、NK細胞が腫瘍スフェロイド死の主要な要因であり続けることが示されました。 したがって、NK細胞は圧縮ストレス下においても抗腫瘍活性を維持できることが示唆されます。これらの知見は、腫瘍と免疫細胞の相互作用における機械的な力の役割を調査する上での、本プラットフォームの有用性を実証するものです。現在、免疫細胞が圧縮ストレスに適応することを可能にする分子メカニズムの特定に向けた研究が進められています。これらの研究から得られる知見は、有望な治療法の提示につながる可能性があります。

概要

細胞ベースのがん免疫療法は、免疫細胞を利用してがん細胞を標的とする治療アプローチである1。この戦略は、血液がんの治療において顕著な成功を収めている2,3,4。しかし、血液がんで見られた成功レベルは、固形がんの治療にはまだ十分に転用されていない5,6,7。この制限の大きな理由の一つに、固形がんに特有の免疫抑制的な腫瘍微小環境（TME）がある。

腫瘍微小環境（TME）は、細胞の挙動を制御し得る特有の機械的な手がかりによって特徴づけられます。免疫細胞が腫瘍細胞を効果的に殺傷するには、標的細胞に力を及ぼし、細胞傷害性分子を放出するための免疫シナプスを形成する必要があります8。したがって、機械的な力が免疫細胞の機能にどのように影響するかを理解することは、固形腫瘍に対する細胞ベースの免疫療法の有効性を向上させるための、新たな治療戦略を見出すことにつながる可能性があります。

固形腫瘍の腫瘍微小環境（TME）における決定的な機械的特徴は、成長する腫瘍に対してTMEが及ぼす圧縮ストレスである9,10。これまで、圧縮に関する研究の多くは、腫瘍細胞の挙動への影響に焦点を当ててきた10,11。圧縮がTME内の免疫細胞にどのように影響するかという理解へと関心が移ったのは、ごく最近のことである12。その結果、圧縮ストレスがナチュラルキラー（NK）細胞の遊走、免疫シナプスの形成、および細胞傷害活性に影響を及ぼすメカニズムは、依然として十分に解明されておらず、定量化も不十分である。この空白は、TME内の機械的手がかりをどのように利用して固形腫瘍への免疫標的化を強化できるかという理解において、重大な制限となっている。

この問題を解決する上での大きな障壁となっているのは、生理学的に適切な3D微小環境内で制御可能かつ定量的な圧縮を加えながら、同時に腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームが不足していることです。圧縮ストレスを研究するための初期の実験的アプローチでは、スフェロイドをアガロースゲルに埋め込む方法が用いられていました13。この方法は物理的な拘束を効果的に再現できましたが、天然の細胞外マトリックス（ECM）と細胞の相互作用が排除されていました。Dolegaらは、浸透圧をかけて圧縮ストレスを誘導しましたが、スフェロイドは培養液中に懸濁されていたため、ECMとの相互作用がないままでした9。Pandeyらは、トランスウェルインサートと重りを用いてコラーゲンに埋め込まれたスフェロイドを圧縮させ、これによりECMと細胞の相互作用は維持されましたが、免疫細胞の運動能や細胞毒性活性を定量化するために必要な高解像度イメージングが制限されました14。これらの限界により、腫瘍微小環境（TME）内での圧縮に対する細胞の形態的応答をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームの必要性が浮き彫りになっています。

本稿では、生理学的に重要なECM-細胞間相互作用を維持しつつ、圧縮ストレスの制御された印加を可能にし、免疫-腫瘍ダイナミクスの高解像度ライブセルイメージングをサポートする、マイクロ流体圧縮デバイス15のプロトコルを提示します。本プロトコルは、デバイス構成要素の準備（セクション1）、デバイスの組み立て（セクション2）、および腫瘍-免疫相互作用のイメージング（セクション3）で構成されています。ここでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）標識腫瘍スフェロイドに対するNK細胞殺傷アッセイを用いて、ワークフローを実証します。本プラットフォームは、このアプリケーション以外にも、3D微小環境における幅広い細胞型および細胞間相互作用に対する機械的な力の影響を調査するために容易に適応させることが可能です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. デバイス構成部品の準備

  1. サンプルロードチャンバーの表面活性化
    1. ウェルのみが露出するように、サンプルロードチャンバー（レイヤー1、L1）にマスクを配置します。
    2. 高出力設定（45 W）を用い、マスクされた第1層を15秒間酸素プラズマに曝露する。
    3. レイヤー1をシャーレに入れ、その後、バイオセーフティキャビネット内で以下の手順を続行します。
    4. 各ウェルを〜で処理する 10 µL 1%ポリエチレンイミン（PEI）で10分間処理する。
    5. ガラス表面を傷つけないよう、各ウェルの四隅から真空吸引を行い、ウェル内のPEIを除去します。
    6. ウェルを～で洗浄する 10 µL リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、その後、側方から真空吸引によって洗浄液を除去します。
    7. ウェルに～を添加して処理する 10 µL 0.1%グルタラアルデヒドで30分間処理した後、隅から真空吸引によりグルタラアルデヒドを除去する。
    8. ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄後に隅に残った洗浄液を除去する。
    9. 第1層を含むペトリ皿をホイルで包み、バイオセーフティキャビネット内で一晩静置する。
  2. 滅菌 金属フレームの
    1. 38 mmのものを浸します。 × 88 mmのメタルフレームと12本のM2.5パンヘッドネジを、70%エタノールに一晩浸漬します。
  3. プライミング 圧力制御ユニットの
    1. 高出力設定（45 W）を用い、圧力制御ユニットを30秒間酸素プラズマに曝露させる。
    2. 圧力制御ユニットの機能面を下に向けて脱イオン（DI）水に一晩浸し、ユニット内のチャネルとチャンバーを満たします。
    3. 翌日、浸漬させていた脱イオン（DI）水から圧力制御ユニットを取り出します。
    4. マイクロ流体リザーバーに超純水（DI water）を50 mL充填します。
      注： マイクロフルイディクス用リザーバーは、2本のチューブ接続部（空気圧ライン用チューブと液体供給ライン用チューブ）を備えたカスタム蓋を取り付けた50 mLコニカルチューブで構成されています。
    5. 空気で満たしたシリンジを空気圧チューブラインに接続します。
    6. シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げてリザーバーを加圧し、チューブ内が満たされ、チューブの端から水が滴り始めるまで、脱イオン水（DI water）を流体輸送チューブに流します。
    7. あらかじめ充填され、液体が滴下している流体供給チューブをポリカーボネート製のマニホールドに接続し、次に圧力制御ユニット背面にある1.5 mmのインレットに接続します。
    8. 圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリを2時間、風乾させます。完全に乾燥したら、圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリは次のステップに進む準備が完了したことになります。

2. デバイスの組み立て

  1. 細胞埋込コラーゲンの調製
    1. 70%エタノールから金属フレームとネジを取り出し、乾燥させる。
    2. バイオセーフティキャビネット内に、3つの 600 µL 氷上のマイクロチューブ。チューブに次のようにラベルを貼る。 "N" （中和）、 "sp" （MCF-7スフェロイド）、および "sp+NK" （NK細胞を含むMCF-7スフェロイド）
    3. 10を加えて中和混合液を調製します。× 必要量のMedium 199 (M199)および水酸化ナトリウム (NaOH)を "N" チューブ
    4. M199:NaOH混合液の適切な量を、〜に分注します。 "種" および "sp+NK" 最終濃度を1にするためのチューブ× 濃度
    5. 腫瘍スフェロイドを回収し、141 [g]（またはrpm）で遠心分離する。 × g スフェロイドをチューブの底に沈降させるため、3分間静置します。
      注：腫瘍スフェロイドは約 200 µm 直径（の）～は、既報のアガロースマイクロウェルプラットフォームを用いて作製された。16簡潔に述べると、3 × 106 MCF-7細胞を36ウェルプレートに播種した。 × ウェルで構成される36個のアガロースマイクロウェルアレイ 200 µm 直径で、および 200 µm 深く植え込み、その後7日間培養して、実験に使用する腫瘍スフェロイドを作製した。
    6. 上清を注意深く除き、スフェロイドを以下の溶液で再懸濁します。 200 µL 50:50のMCF-7/NK完全培地（表1 および 表2).
    7. NK細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、141（※数値が未完）で遠心分離する。 × g 4分間放置し、細胞数を計測する。
      注意：NK細胞の生存率は～である必要があります。 >実験当日に85%とする。
    8. 得られたペレットを〜に再懸濁します。 200 µL 完全NK培地の。
    9. 各マイクロ遠心チューブに、適切な容量のコラーゲンストック溶液を加えます。
    10. 最終容量がとなるように、各チューブに適切な量の細胞懸濁液を加えます。 200 µL 1.5 mg/mLのコラーゲンを含有する。
      注： "種" 懸濁液には腫瘍スフェロイドのみが含まれているが、一方で "sp+NK" 懸濁液には腫瘍スフェロイドと1.5が含まれている × 106 NK細胞
    11. 気泡の発生を最小限に抑えつつ、細胞とコラーゲンが均一に分散するように、ピペッティングにより穏やかに混合します。
  2. デバイスの組み立てと細胞の播種
    1. 乾燥させた金属フレームの中にレイヤー1を配置します。
    2. 負荷 9 µL コラーゲン混合液を各ウェルに分注します。
    3. 顕微鏡を用いて、圧力制御ユニットおよびマニホールドアセンブリをレイヤー1上のセルチャンバーに合わせて調整してください。
    4. 乾燥させたネジをマニホールドに通して金属フレームに挿入し、マニホールドと金属フレームの間で圧力制御ユニットとレイヤー1を固定します。
    5. 組み立てた装置を、 37 °C, 5% CO2₂ コラーゲンの重合を促進するため、インキュベーターで45分間静置する。
    6. 4つの培地ポートから、MCF-7/NK完全細胞培養培地を50:50の割合で加えます。

3. 腫瘍と免疫細胞の相互作用のイメージング

  1. 組み立てたデバイスを、ライブセルイメージング用に倒立エピ蛍光顕微鏡に搭載したステージインキュベーター内に設置する。
    注：ステージインキュベーターは、イメージング期間中、温度37 °C、湿度約50%に維持した。
  2. イメージング期間中、内部環境を37 °C、湿度100%、5% CO₂に維持するため、組み立てたデバイスの上に二次ハウジングボックスを被せる。
  3. 空気圧チューブを使用して、デバイスを圧力コントローラーに接続する。
  4. 圧縮後のスフェロイドの変形を評価できるように、圧縮を加える前に腫瘍スフェロイドの明視野像およびGFP像を取得する。
  5. イメージング期間中、120 mbarの一定圧を加える。
    注：圧力コントローラーのソフトウェアにより、実験中に適用する圧力プロファイルと大きさを定義できる。Supplementary Figure 1に圧力制御システムの概略図を示す。
  6. 10 minごとに18 hの間、明視野像およびGFP像を取得し、タイムラプスイメージングを開始する。
    注：画像は、倒立エピ蛍光顕微鏡の20×対物レンズを用いて、各腫瘍スフェロイドの中心Z平面で取得した。明視野像とGFP蛍光像の露光時間は、それぞれ200.1 msおよび298.9 msとした。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

以下の実験では、生理学的に適切な3D微小環境内で腫瘍と免疫細胞の相互作用をモデル化し、同時に腫瘍スフェロイドに静的および動的な圧縮を加えることができるマイクロ流体圧縮デバイス15を使用した（図1）。デバイスの構成部品（図1A1）およびその組み立て順序（図1A2）を図1Aに示す。金属フレームがデバイスのベースとして機能し、そのフレーム内に細胞チャンバー層（L1）が配置される。L2とL3をプラズマ接合させた圧力制御ユニットをL1の上に配置し、さらにその上にマニホールドを重ねる（図1A2）。L1と圧力制御ユニットが合わせて機能的なマイクロ流体デバイスを構成し、これらは金属フレームとマニホールドの間に挟...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本手法では、微小流体圧縮デバイスを用いて、圧縮ストレスが腫瘍と免疫細胞の相互作用に及ぼす影響を調査する方法について記述します。このシステムは、3Dコラーゲンマトリックス内に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに対し、制御された機械的圧縮を加えることが可能です。細胞チャンバー（L1）の底部を形成するガラス基板により、高解像度の生細胞イメージングが可能となり、免疫細胞の運動性、浸潤、および細胞毒性活性の定量化を目的とした研究に適したプラットフォームとなっています。重要な点として、本システムは細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用を維持しつつ、機械的環境を精密に制御することを可能にします。対照的に、圧縮ストレスを研究するための既存の多くの実験的手法では、ECM介在性の細胞相互作用9,13と高解像度イメージング14との間でトレードオフが生じます。

本研究では、NK細胞とMCF-7乳がん腫瘍スフェロイドをモデルシステムとして使用しま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

本研究は、米国国立がん研究所の助成金（助成金番号 R01CA221346）、コーネル大学工学部からFMに授与されたLance R. Collins Fellowship、およびコーネル大学プロボスト研究レジリエンス基金からFMへの助成により支援されています。本研究の一部は、米国国立科学財団（助成金番号 NNCI-2025233）の支援を受ける国立ナノテクノロジー調整インフラ（NNCI）の加盟機関であるCornell NanoScale Facilityにて実施されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199培地Sigma-AldrichM0650200 µL
2-メルカプトエタノールThermoFisher313500100
エアコンプレッサーElveflowJun-Air モデル3 コンプレッサー
自動X-Y顕微鏡ステージ応用科学計測機器MS-2000
CCDカメラ浜松ホトニクスORCA-R2
ウシ胎児血清 (FBS)GeminiBioS11150
流体輸送チューブEleveflowPTFEチューブ予備ロール外径 1/16 インチ
蛍光光源Excelitas Technologies X-Cite シリーズ 120 PCユニット
葉酸シグマF7876
グルタルアルデヒド電顕科学 160190.10%
Harrick プラズマクリーナーHarrick PlasmaPDC-001-HP高出力設定（45W）
ウマ血清 (HS)ThermoFisher16050-122
倒立蛍光顕微鏡OlympusIX8120倍対物レンズ（NA = 0.25）、Olympus CellSensソフトウェアを用いて操作
マスクArtus10枚セット アルミニウム製シムストック厚さは0.0125である" (0.75 mm)
MCF-7/GFP (ピューロマイシン) 安定発現細胞株GenTarget IncSC050-G
金属製フレームカスタムメイド 特注品 
マイクロ流体リザーバーEleveflow50 mLマイクロ流体リザーバー 
顕微鏡 OlympusCKX414倍対物レンズ              (NA = 0.1)
ミオイノシトールシグマI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco 15140122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ThermoFisher 10010072
空気圧チューブエレブフローPURポリエーテル透明パイプ投入口4" 外径 mm
ポリエチレンイミン (PEI)Sigma-AldrichP31431%
圧力コントローラElveflowOB1 NK4Elveflow Smart Interfaceソフトウェアを使用して操作
ラット尾由来I型コラーゲン Corning35424931.3 µL 9.6 mg/mLのコラーゲンストック溶液から
ネジフィリップスM2.5 パンヘッドネジ12本
ステージインキュベーター高精度プラスチックカスタムメイド
シリンジBecton Dickinson3031343/32インチへのオスルアーインテグラルロックとのペアリング" Eleveflow製ODバーブ
α-MEM培地ThermoFisher12561056

参考文献

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

腫瘍免疫相互作用免疫シナプス腫瘍スフェロイドナチュラルキラー細胞リアルタイムイメージング光学顕微鏡コラーゲンマトリックス

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。