方法論記事

3D細胞外マトリックスにおける腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における機械的圧縮の役割を研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

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DOI：

10.3791/72929

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2026年8月28日

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1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

この記事について

サマリー

三次元（3D）環境における腫瘍と免疫系の相互作用をモデル化するための、マイクロ流体プラットフォームを用いたプロトコルを提示します。我々の結果から、ナチュラルキラー（NK）細胞は機械的な圧縮下においても抗腫瘍活性を維持することが明らかになりました。

要約

細胞ベースの免疫療法において、機械的な力は免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷能力に大きな影響を及ぼします。腫瘍細胞を殺傷するためには、免疫細胞が標的細胞に力を加え、免疫シナプスを形成して、granzyme Bを含む細胞毒性分子を放出させる必要があります。その重要性にもかかわらず、免疫介在性の殺傷能力を高めるために機械的な刺激をどのように活用できるかは、まだ十分に解明されていません。この知見の不足は、生理学的に現実的な環境において、細胞培養に適切に制御された機械的ストレスを負荷できるツールの欠如が一因となっています。本稿では、細胞外マトリックス（ECM）に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに静的または動的な圧縮を加えつつ、光学顕微鏡を用いて腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできるマイクロ流体圧縮デバイスについて説明します。

このマイクロ流体プラットフォームは、12個のコンパートメント（コントロール群6個、機能群6個）で構成されています。各コンパートメントには、圧力制御ユニットの直下に配置されたセルチャンバーが含まれています。ECMに埋め込まれたスフェロイドがこのセルチャンバー内に配置されます。本プラットフォームを用いて、規定の機械的圧縮下における、乳がん腫瘍スフェロイド（MCF-7）に対するナチュラルキラー（NK）細胞の殺傷効率を調査しました。その結果、1.5 mg/mLのコラーゲン中では、機械的圧縮の有無にかかわらず、NK細胞が腫瘍スフェロイド死の主要な要因であり続けることが示されました。 したがって、NK細胞は圧縮ストレス下においても抗腫瘍活性を維持できることが示唆されます。これらの知見は、腫瘍と免疫細胞の相互作用における機械的な力の役割を調査する上での、本プラットフォームの有用性を実証するものです。現在、免疫細胞が圧縮ストレスに適応することを可能にする分子メカニズムの特定に向けた研究が進められています。これらの研究から得られる知見は、有望な治療法の提示につながる可能性があります。

概要

細胞ベースのがん免疫療法は、免疫細胞を利用してがん細胞を標的とする治療アプローチである1。この戦略は、血液がんの治療において顕著な成功を収めている2,3,4。しかし、血液がんで見られた成功レベルは、固形がんの治療にはまだ十分に転用されていない5,6,7。この制限の大きな理由の一つに、固形がんに特有の免疫抑制的な腫瘍微小環境（TME）がある。

腫瘍微小環境（TME）は、細胞の挙動を制御し得る特有の機械的な手がかりによって特徴づけられます。免疫細胞が腫瘍細胞を効果的に殺傷するには、標的細胞に力を及ぼし、細胞傷害性分子を放出するための免疫シナプスを形成する必要があります8。したがって、機械的な力が免疫細胞の機能にどのように影響するかを理解することは、固形腫瘍に対する細胞ベースの免疫療法の有効性を向上させるための、新たな治療戦略を見出すことにつながる可能性があります。

固形腫瘍の腫瘍微小環境（TME）における決定的な機械的特徴は、成長する腫瘍に対してTMEが及ぼす圧縮ストレスである9,10。これまで、圧縮に関する研究の多くは、腫瘍細胞の挙動への影響に焦点を当ててきた10,11。圧縮がTME内の免疫細胞にどのように影響するかという理解へと関心が移ったのは、ごく最近のことである12。その結果、圧縮ストレスがナチュラルキラー（NK）細胞の遊走、免疫シナプスの形成、および細胞傷害活性に影響を及ぼすメカニズムは、依然として十分に解明されておらず、定量化も不十分である。この空白は、TME内の機械的手がかりをどのように利用して固形腫瘍への免疫標的化を強化できるかという理解において、重大な制限となっている。

この問題を解決する上での大きな障壁となっているのは、生理学的に適切な3D微小環境内で制御可能かつ定量的な圧縮を加えながら、同時に腫瘍と免疫細胞の相互作用をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームが不足していることです。圧縮ストレスを研究するための初期の実験的アプローチでは、スフェロイドをアガロースゲルに埋め込む方法が用いられていました13。この方法は物理的な拘束を効果的に再現できましたが、天然の細胞外マトリックス（ECM）と細胞の相互作用が排除されていました。Dolegaらは、浸透圧をかけて圧縮ストレスを誘導しましたが、スフェロイドは培養液中に懸濁されていたため、ECMとの相互作用がないままでした9。Pandeyらは、トランスウェルインサートと重りを用いてコラーゲンに埋め込まれたスフェロイドを圧縮させ、これによりECMと細胞の相互作用は維持されましたが、免疫細胞の運動能や細胞毒性活性を定量化するために必要な高解像度イメージングが制限されました14。これらの限界により、腫瘍微小環境（TME）内での圧縮に対する細胞の形態的応答をリアルタイムでイメージングできる実験プラットフォームの必要性が浮き彫りになっています。

本稿では、生理学的に重要なECM-細胞間相互作用を維持しつつ、圧縮ストレスの制御された印加を可能にし、免疫-腫瘍ダイナミクスの高解像度ライブセルイメージングをサポートする、マイクロ流体圧縮デバイス15のプロトコルを提示します。本プロトコルは、デバイス構成要素の準備（セクション1）、デバイスの組み立て（セクション2）、および腫瘍-免疫相互作用のイメージング（セクション3）で構成されています。ここでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）標識腫瘍スフェロイドに対するNK細胞殺傷アッセイを用いて、ワークフローを実証します。本プラットフォームは、このアプリケーション以外にも、3D微小環境における幅広い細胞型および細胞間相互作用に対する機械的な力の影響を調査するために容易に適応させることが可能です。

プロトコル

1. デバイス構成部品の準備

  1. サンプルロードチャンバーの表面活性化
    1. ウェルのみが露出するように、サンプルロードチャンバー（レイヤー1、L1）にマスクを配置します。
    2. 高出力設定（45 W）を用い、マスクされた第1層を15秒間酸素プラズマに曝露する。
    3. レイヤー1をシャーレに入れ、その後、バイオセーフティキャビネット内で以下の手順を続行します。
    4. 各ウェルを〜で処理する 10 µL 1%ポリエチレンイミン（PEI）で10分間処理する。
    5. ガラス表面を傷つけないよう、各ウェルの四隅から真空吸引を行い、ウェル内のPEIを除去します。
    6. ウェルを～で洗浄する 10 µL リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、その後、側方から真空吸引によって洗浄液を除去します。
    7. ウェルに～を添加して処理する 10 µL 0.1%グルタラアルデヒドで30分間処理した後、隅から真空吸引によりグルタラアルデヒドを除去する。
    8. ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄後に隅に残った洗浄液を除去する。
    9. 第1層を含むペトリ皿をホイルで包み、バイオセーフティキャビネット内で一晩静置する。
  2. 滅菌 金属フレームの
    1. 38 mmのものを浸します。 × 88 mmのメタルフレームと12本のM2.5パンヘッドネジを、70%エタノールに一晩浸漬します。
  3. プライミング 圧力制御ユニットの
    1. 高出力設定（45 W）を用い、圧力制御ユニットを30秒間酸素プラズマに曝露させる。
    2. 圧力制御ユニットの機能面を下に向けて脱イオン（DI）水に一晩浸し、ユニット内のチャネルとチャンバーを満たします。
    3. 翌日、浸漬させていた脱イオン（DI）水から圧力制御ユニットを取り出します。
    4. マイクロ流体リザーバーに超純水（DI water）を50 mL充填します。
      注： マイクロフルイディクス用リザーバーは、2本のチューブ接続部（空気圧ライン用チューブと液体供給ライン用チューブ）を備えたカスタム蓋を取り付けた50 mLコニカルチューブで構成されています。
    5. 空気で満たしたシリンジを空気圧チューブラインに接続します。
    6. シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げてリザーバーを加圧し、チューブ内が満たされ、チューブの端から水が滴り始めるまで、脱イオン水（DI water）を流体輸送チューブに流します。
    7. あらかじめ充填され、液体が滴下している流体供給チューブをポリカーボネート製のマニホールドに接続し、次に圧力制御ユニット背面にある1.5 mmのインレットに接続します。
    8. 圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリを2時間、風乾させます。完全に乾燥したら、圧力制御ユニットとマニホールドアセンブリは次のステップに進む準備が完了したことになります。

2. デバイスの組み立て

  1. 細胞埋込コラーゲンの調製
    1. 70%エタノールから金属フレームとネジを取り出し、乾燥させる。
    2. バイオセーフティキャビネット内に、3つの 600 µL 氷上のマイクロチューブ。チューブに次のようにラベルを貼る。 "N" （中和）、 "sp" （MCF-7スフェロイド）、および "sp+NK" （NK細胞を含むMCF-7スフェロイド）
    3. 10を加えて中和混合液を調製します。× 必要量のMedium 199 (M199)および水酸化ナトリウム (NaOH)を "N" チューブ
    4. M199:NaOH混合液の適切な量を、〜に分注します。 "種" および "sp+NK" 最終濃度を1にするためのチューブ× 濃度
    5. 腫瘍スフェロイドを回収し、141 [g]（またはrpm）で遠心分離する。 × g スフェロイドをチューブの底に沈降させるため、3分間静置します。
      注：腫瘍スフェロイドは約 200 µm 直径（の）～は、既報のアガロースマイクロウェルプラットフォームを用いて作製された。16簡潔に述べると、3 × 106 MCF-7細胞を36ウェルプレートに播種した。 × ウェルで構成される36個のアガロースマイクロウェルアレイ 200 µm 直径で、および 200 µm 深く植え込み、その後7日間培養して、実験に使用する腫瘍スフェロイドを作製した。
    6. 上清を注意深く除き、スフェロイドを以下の溶液で再懸濁します。 200 µL 50:50のMCF-7/NK完全培地（表1 および 表2).
    7. NK細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、141（※数値が未完）で遠心分離する。 × g 4分間放置し、細胞数を計測する。
      注意：NK細胞の生存率は～である必要があります。 >実験当日に85%とする。
    8. 得られたペレットを〜に再懸濁します。 200 µL 完全NK培地の。
    9. 各マイクロ遠心チューブに、適切な容量のコラーゲンストック溶液を加えます。
    10. 最終容量がとなるように、各チューブに適切な量の細胞懸濁液を加えます。 200 µL 1.5 mg/mLのコラーゲンを含有する。
      注： "種" 懸濁液には腫瘍スフェロイドのみが含まれているが、一方で "sp+NK" 懸濁液には腫瘍スフェロイドと1.5が含まれている × 106 NK細胞
    11. 気泡の発生を最小限に抑えつつ、細胞とコラーゲンが均一に分散するように、ピペッティングにより穏やかに混合します。
  2. デバイスの組み立てと細胞の播種
    1. 乾燥させた金属フレームの中にレイヤー1を配置します。
    2. 負荷 9 µL コラーゲン混合液を各ウェルに分注します。
    3. 顕微鏡を用いて、圧力制御ユニットおよびマニホールドアセンブリをレイヤー1上のセルチャンバーに合わせて調整してください。
    4. 乾燥させたネジをマニホールドに通して金属フレームに挿入し、マニホールドと金属フレームの間で圧力制御ユニットとレイヤー1を固定します。
    5. 組み立てた装置を、 37 °C, 5% CO2₂ コラーゲンの重合を促進するため、インキュベーターで45分間静置する。
    6. 4つの培地ポートから、MCF-7/NK完全細胞培養培地を50:50の割合で加えます。

3. 腫瘍と免疫細胞の相互作用のイメージング

  1. 組み立てたデバイスを、ライブセルイメージング用に倒立エピ蛍光顕微鏡に搭載したステージインキュベーター内に設置する。
    注：ステージインキュベーターは、イメージング期間中、温度37 °C、湿度約50%に維持した。
  2. イメージング期間中、内部環境を37 °C、湿度100%、5% CO₂に維持するため、組み立てたデバイスの上に二次ハウジングボックスを被せる。
  3. 空気圧チューブを使用して、デバイスを圧力コントローラーに接続する。
  4. 圧縮後のスフェロイドの変形を評価できるように、圧縮を加える前に腫瘍スフェロイドの明視野像およびGFP像を取得する。
  5. イメージング期間中、120 mbarの一定圧を加える。
    注：圧力コントローラーのソフトウェアにより、実験中に適用する圧力プロファイルと大きさを定義できる。Supplementary Figure 1に圧力制御システムの概略図を示す。
  6. 10 minごとに18 hの間、明視野像およびGFP像を取得し、タイムラプスイメージングを開始する。
    注：画像は、倒立エピ蛍光顕微鏡の20×対物レンズを用いて、各腫瘍スフェロイドの中心Z平面で取得した。明視野像とGFP蛍光像の露光時間は、それぞれ200.1 msおよび298.9 msとした。

結果

以下の実験では、生理学的に適切な3D微小環境内で腫瘍と免疫細胞の相互作用をモデル化し、同時に腫瘍スフェロイドに静的および動的な圧縮を加えることができるマイクロ流体圧縮デバイス15を使用した（図1）。デバイスの構成部品（図1A1）およびその組み立て順序（図1A2）を図1Aに示す。金属フレームがデバイスのベースとして機能し、そのフレーム内に細胞チャンバー層（L1）が配置される。L2とL3をプラズマ接合させた圧力制御ユニットをL1の上に配置し、さらにその上にマニホールドを重ねる（図1A2）。L1と圧力制御ユニットが合わせて機能的なマイクロ流体デバイスを構成し、これらは金属フレームとマニホールドの間に挟まれ、ネジで固定される。マニホールドには、デバイスに圧力を供給するための流体チューブ用入口ポートと、長期の生細胞イメージング実験を可能にする培地リザーバーが備わっている。

マイクロ流体デバイスの構成部品と図面、セルチャンバーの圧縮、GFP細胞の実験結果。
Figure 1: 機械的圧縮下における免疫細胞と腫瘍スフェロイド間の相互作用を研究するためのマイクロ流体圧縮デバイス。(A1>) デバイス組み立てに必要な構成部品の写真。左から順に、マニホールド、圧力制御ユニット(L2 + L3)、セルチャンバー層(L1)、およびメタルフレームを示すところである。(A2>) デバイス構成部品の3D概略図。上から順に、マニホールド、圧力制御ユニット(L2 + L3)、セルチャンバー層(L1)、およびメタルフレームを示す。PDMS層のL2とL3をプラズマ接合して圧力制御ユニットを形成し、これをセルチャンバーの上に配置する。マニホールドとメタルフレームで組み立てられたデバイスを固定する。(B1>) 圧縮前後の圧縮ユニットの断面概略図。ECMに埋め込まれた腫瘍スフェロイドとNK細胞がセルチャンバー内に配置されている。圧縮前のL1底面とL2底面との初期距離をhとする。圧力制御ユニットに圧力を加えるとL2が下方へたわみ、PDMSピストンが腫瘍スフェロイドを圧縮する。圧縮後のL2の下方変位をΔhとする。(B2>) 圧縮前（左）および圧縮後（右）のNK細胞を伴うMCF-7腫瘍スフェロイドの明視野像とGFP像の合成画像。MCF-7細胞はGFP標識されており、NK細胞は未標識である。代表的なNK細胞を青色の円で囲み、腫瘍スフェロイドの外縁を黄色の線で示している。スケールバー = 50 µm。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

組み立てが完了したマイクロ流体圧縮デバイスは、図1Bに示すように、腫瘍スフェロイドを圧縮するために使用できます。ここでは、NK細胞を含むコラーゲン埋込腫瘍スフェロイドを細胞チャンバー（L1）に導入します。圧力チャンバー（L3）に圧力を加えると、変形可能な膜層（L2）が下方にたわみ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ピストンを介してスフェロイドに圧縮力が伝達されます。圧力チャンバーは外部圧力源によって制御されます。マイクロ流体圧縮デバイスの設計、作製および特性評価に関する詳細は、別の研究で既に報告されています15。

セルチャンバーの底面（L1）と変形可能なメンブレンの底面（L2）の間の距離をhと定義します（Figure 1B1、左パネル）。圧縮前、この距離は 200 µm です。圧力制御ユニットに流体圧を印加すると、変形可能なメンブレンが下方へたわみ、距離 h が Δh 分だけ減少することで（Δh； Figure 1B1、右パネル）、コラーゲン埋込腫瘍スフェロイドが圧縮されます。本システムにおいて、圧縮歪みは Δh/h と定義されます。ここで、h は圧縮前の L1 と L2 の初期距離であり、Δh は圧縮後の L2 の下方変位量です。メンブレンの変位は、L2 の底面に付着させた蛍光ビーズを可視化することで、あらかじめ校正されています。校正手順および圧縮歪みの計算に関する詳細な説明は、先行研究17を参照してください。校正曲線の例は Supplementary Figure 2 に示されています。

図1B2は、1.5 mg/mLのコラーゲンにNK細胞と共に封入されたMCF-7スフェロイドの、圧縮前（左パネル）および圧縮後（右パネル）における明視野像とGFP像の代表的なマージ画像を示している。腫瘍スフェロイドの境界を黄色で囲んでいる。圧縮後、スフェロイドの投影面積が増加しており、機械的負荷が正常に印加されたことに応じた変形が認められた。本論文に提示したすべての実験において、圧縮歪みはΔh/h = 50% とした。なお、スフェロイドの直径は140 µmから200 µmの範囲である。つまり、スフェロイドに実際に加わった圧縮歪みは50%よりもわずかに小さいことになる。付随ビデオ1および付随ビデオ2は、1.5 mg/mLのコラーゲンに封入されたMCF-7スフェロイドを、50%の圧縮歪みを印加する前および後に、それぞれGFP蛍光チャネルで取得した代表的なX-Y z-stack画像である。

マイクロ流体圧縮デバイスを用いて、NK細胞、圧縮、およびそれらの組み合わせが腫瘍スフェロイドの死滅に及ぼす影響を調査した（図2）。これは、12個の培養ウェルを備えたデバイスの設計によって可能となった。これらのウェルのうち、6個は圧縮をかけることができ、残りの6個は非圧縮コントロールとして機能する。この構成により、4つの実験条件（図2A）を設定できる。すなわち、圧縮なしのスフェロイド単独（sp）、圧縮なしでNK細胞を加えたスフェロイド（+NK）、圧縮をかけたスフェロイド（+comp）、および圧縮とNK細胞の両方を作用させたスフェロイド（+comp+NK）である。

GFP強度のタイムラプス顕微鏡観察。グラフは、正規化されたGFPデータ解析の散布図。
図 2: 機械的圧縮が腫瘍スフェロイドに対するNK細胞介在性殺傷を調節する。 (A) 1.5 mg/mL コラーゲンに埋め込まれたMCF-7スフェロイドの、4つの条件下（スフェロイドのみのコントロール (sp)、NK細胞添加 (+NK)、圧縮添加 (+comp)、および圧縮とNK細胞の両方添加 (+comp+NK)）におけるタイムラプス蛍光画像。GFP蛍光により生存しているMCF-7腫瘍細胞がラベル付けされている。黄色の外枠は、18時間後の画像を用いて定義され、蛍光定量のためにすべてのタイムポイントに適用された関心領域 (ROI) を示す。ROI内の総GFP蛍光強度を測定し、その後の解析に使用した。スケールバー = 50 µm。 (B) 4つの条件下における、1つのスフェロイドの総GFP蛍光強度の経時変化。各色の線は、t = 0 における初期強度で正規化した単一スフェロイドの総蛍光強度を表す。黒線は、コントロール条件下で培養された7つのスフェロイドからプールした蛍光強度データの2次多項式近似であり、(C)における腫瘍細胞消失の算出の基準として使用した。 (C) +comp、+NK、および +comp+NK 条件における正規化GFP消失量は、各スフェロイドの t = 18 h におけるGFP強度を、スフェロイドのみの基準線 (sp) から差し引いて算出した。したがって、各データポイントは単一スフェロイドの正規化GFP消失量を表す。エラーバーはSEMを示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

NK細胞、圧縮、およびそれらの組み合わせが腫瘍スフェロイドに及ぼす影響は、1.5 mg/mL コラーゲン中の MCF-7 スフェロイドの代表的な画像で視覚化できます（図 2A）。腫瘍スフェロイドの作製に使用した MCF-7 細胞は GFP 標識されていたため、GFP 蛍光の変化を通じて腫瘍の生存率をモニタリングすることができました。倒立エピ蛍光顕微鏡を用い、18 時間にわたって 10 分ごとに GFP 画像および明視野画像を取得しました。特筆すべき点として、圧縮を加えたスフェロイドは、圧縮していないスフェロイドよりも投影面積が大きく、変形可能なメンブレンから腫瘍スフェロイドへ機械的負荷が正常に伝達されたことが確認されました。時間の経過とともに、+NK および +comp+NK 条件において GFP 蛍光の漸次的な消失が観察され（図 2A）、NK 細胞による腫瘍細胞の殺傷が示されました。

腫瘍細胞死の指標として、GFP蛍光の消失を利用します。本研究で使用したGFP標識MCF-7細胞は、レンチウイルス導入によって作製されました。簡潔に述べると、elongation factor-1α (EF1α) プロモーターにより駆動される強化緑色蛍光タンパク質 (eGFP) 発現カセットと、Rous sarcoma virus (RSV) プロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を導入するために、レンチウイルスベクターを使用しました。感染後、レンチウイルス発現カセットがMCF-7細胞のゲノムDNAに組み込まれ、安定したGFP発現が得られました。その後、ピューロマイシンによる選択を行い、非導入細胞を除去しました。MCF-7細胞をGFP標識することで、GFP蛍光強度の経時的な変化をモニタリングし、腫瘍細胞の生存率を定量化することが可能になりました (Figure 2B)。GFP蛍光の消失と、生死判定マーカーであるプロピジウムアイオダイド (PI) やアポトーシスマーカーであるannexin-Vなどの確立された細胞死マーカーとの間に強い相関があることが以前に証明されており18、GFP蛍光の消失が腫瘍細胞死の代替指標として妥当であることが確認されています。

4つの実験条件が腫瘍の生存率に及ぼす影響を定量化するため、各腫瘍スフェロイドの総GFP蛍光強度を各時点で測定し、バックグラウンドを差し引いた後、初期値で正規化した（図2B）。全スフェロイド蛍光は、あらかじめ定義された関心領域（ROI）内で算出された。このROIは、18時間後の画像において腫瘍スフェロイドの境界を手動で囲むことで設定した（18時間後パネルの黄色い外郭線、 図 2A自作のMATLABスクリプトを用いてROI（関心領域）を設定した。このROI内の全蛍光強度を各時間点について算出し、画像内の別の場所に設定したROIから測定した平均背景蛍光を差し引くことで補正を行った。得られた背景補正後の蛍光値を、その後、スフェロイドの初期蛍光強度で正規化した。 

各色の曲線は、Figure 2Bにおける特定の実験条件下での個々のスフェロイドの正規化されたGFP強度を表しています。この曲線は、実験データに2次多項式近似を行うことで得られています。紫色の曲線は圧縮のみを施したスフェロイド（+comp, Figure 2B）、赤色の曲線はNK細胞を添加したスフェロイド（+NK, Figure 2B）、そして青色の曲線は圧縮とNK細胞の両方を施したスフェロイド（+comp+NK, Figure 2B）を表しています。対照的に、黒色の曲線は、コントロールとしてスフェロイドのみで培養した7つのスフェロイドのデータ（sp, Figure 2B）に対する2次多項式近似です。Figure 2Bでは、視認性を高めるため、実験データポイントではなく多項式近似データのみを提示しています。注目すべき点として、スフェロイドのみ（sp）およびスフェロイド＋圧縮（+comp）条件におけるGFP蛍光強度は、時間の経過とともに全体的に上昇傾向にあり（Figure 2B）、これは腫瘍の継続的な増殖または生存能の維持と一致しています。対照的に、+NKおよび+comp+NK条件ではGFP蛍光強度の漸次的な低下が認められ（Figure 2B）、腫瘍細胞の死滅が示されました。

累積腫瘍細胞喪失量は、特定の条件下（+comp、+NK、または+comp+NK）における各スフェロイドのフィッティング済み正規化GFP蛍光強度を、18h時点のコントロール条件から差し引くことで定量化した（Figure 2C）。その結果、各データポイントは、スフェロイドのみのコントロールに対する個々のスフェロイドの正規化GFP喪失量を表している（Figure 2C）。したがって、+comp条件は圧縮のみによるGFP喪失を反映し（紫色、Figure 2C）、+NK条件はNK細胞のみによるGFP喪失を反映し（赤色、Figure 2C）、+comp+NK条件は圧縮とNK細胞の複合的な影響によるGFP喪失を反映している（青色、Figure 2C）。+comp条件ではGFP喪失度が最も低く（Figure 2C）、圧縮のみではスフェロイドの生存能への影響が最小限であることが示唆された。対照的に、+NKおよび+comp+NKの両条件では、+comp条件よりも有意に大きなGFP喪失が認められ（Figure 2C）、NK細胞が腫瘍細胞死の主要な要因であることが示された。+comp+NK条件は+NK条件よりも平均GFP喪失量が高かったが、この差は統計的有意性に達しなかった（Figure 2C）。これらの結果は、圧縮がNK細胞による腫瘍細胞の殺傷能を損なわないことを示唆している。総合すると、これらの知見は、マイクロ流体圧縮デバイスを用いて、生理的に適切な3D環境における腫瘍スフェロイドの生存能に対する圧縮とNK細胞の単独および複合的な影響を正常に定量できることを実証している。

対照的に、(1) スフェロイドがピストンの境界外にある場合、(2) スフェロイドがピストンの境界に近すぎる場合、および (3) 複数のスフェロイドが互いの直径1個分以内の距離に位置している場合、不十分な結果となる可能性があります(図 3)。これらのケースでは、該当する視野を解析から除外する必要があります。

細胞圧縮効果；BF、GFP蛍光；前後；18時間のタイムラプス顕微鏡観察結果。
Figure 3: 解析から除外されたスフェロイドの一連の画像の代表例。1.5 mg/mLコラーゲン中にあるNK細胞を含むMCF-7スフェロイドの、圧縮前（左列）および圧縮後（右2列）のタイムラプス明視野（BF）、GFP蛍光、およびマージ画像を示す。圧縮前の画像は、加圧の20分前およびタイムラプスイメージング開始の10分前に取得された。その後、10分ごとに18時間にわたって画像を収集し、0 hは圧縮直後に取得された最初の画像に、18 hは実験終了時に対応する。青色の矢印はPDMSピストン（L2）の端を示す。この観察視野は、圧縮領域内に2つのスフェロイドが存在し、かつピストン境界に近すぎたため、解析から除外された。その結果、圧縮中のスフェロイドの変形およびGFP蛍光強度の信頼性の高い定量化ができなかった。スケールバー = 50 µm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(1) ピストン境界の外側にあるスフェロイドは、圧力がピストン領域内のみに適用されるため、圧縮されません。したがって、これらのスフェロイドは圧縮条件および対照条件の両方から除外する必要があります。(2) ピストン境界上またはその付近に位置するスフェロイド（図3、上方のスフェロイド）は、不均一な機械的負荷がかかるため、除外する必要があります。(3) 隣接するスフェロイドからスフェロイド1個分の直径以内に位置するスフェロイドは、除外してください（図3）。スフェロイド同士が近接していると、最終タイムポイントを用いて関心領域（ROI）を定義するため、GFP蛍光強度の定量化が困難になります。時間の経過とともにスフェロイドの境界が判別できなくなり、単一のスフェロイドのみを正確に囲むROIを画定することが難しくなるためです。これらの問題は、デバイスへのロード時にスフェロイドを圧縮領域の中心に配置することで最小限に抑えることができます。均一な圧縮を実現し、信頼性と再現性のある実験結果を得るためには、スフェロイドの分布、配置、およびデバイスのセットアップに細心の注意を払うことが不可欠です。

構成要素濃度
α-MEM培地
ウシ胎児血清 (FBS)10%
ペニシリン/ストレプトマイシン1%

表1：MCF-7完全培地。

構成要素濃度
α-MEM培地
ミオイノシトール0.2 mM
2-メルカプトエタノール0.1 mM
ウシ胎児血清 (FBS)12.50%
葉酸0.02 mM
馬血清 (HS)12.50%
ペニシリン/ストレプトマイシン1%

表2：NK細胞完全培地。

補足図1：圧力制御システムの概略図。エアコンプレッサーが圧力コントローラーに圧縮空気（最大 20 psi）を供給します。圧力コントローラーは、ユーザー定義の設定に基づいて、圧力リザーバーに送られる空気圧を調節します。このコントローラーは、最大動作圧力 200 mbar、圧力安定度 フルスケール (FS) の 0.005%、圧力分解能 0.003% FS、応答時間 9 ms を備えており、正確で再現性のある圧力制御が可能です。コントローラーはユニバーサル シリアル バス (USB) 経由でコンピューターに接続されており、付属のソフトウェアを使用して、印加圧力の大きさとプロファイルをプログラムできます。このソフトウェアは、一定、正弦波、三角波、および周期的な圧縮を含む複数の圧縮波形をサポートしています。この概略図では、圧力は 120 mbar に設定されており、この圧力の圧縮空気がニューマチックチューブを通じて加圧リザーバーに送られます。加圧リザーバーには 50 mL の脱イオン (DI) 水が含まれており、空気圧を流体圧に変換する役割を果たします。加圧されると、リザーバーは流体供給チューブを通じて流体をマイクロ流体圧縮デバイスの圧力制御ユニット（デバイスの詳細は図1を参照）へと送り、そこで流体圧が腫瘍スフェロイドへの圧縮に利用されます。なお、PDMSデバイス内での気泡の発生を防ぐために流体圧が使用されています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図2：ピストンの変位（, µm）と圧力制御チャンバーに印加された圧力（KPa）の関係を示すマイクロ流体圧縮装置の検量線。実験測定値は点で、実線はCOMSOLシミュレーションに対応している。エラーバーは8回の独立した実験測定による平均標準誤差（SEM）を示すが、小さすぎるため視認できない。この図は、Royal Society of Chemistryの許可を得て、Suhら15から転載したものである。 こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ビデオ 1： 圧縮前のGFP標識MCF-7スフェロイドのX-Y z-スタック。スフェロイドをマイクロ流体圧縮デバイス内の1.5 mg/mLコラーゲンに包埋し、z-ステップサイズ1 µmでGFP蛍光チャンネルを用いて撮像した。その後、ImageJを用いてコントラストを調整した。スケールバー = 50 µm。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ビデオ 2： 1.5 mg/mLのコラーゲンに埋入したGFP標識MCF-7スフェロイドに、50%の圧縮ひずみ（Δh/h = 50%）を加えた。圧縮後、1 µmのステップサイズでGFP蛍光チャンネルのX-Y z-stackを取得し、ImageJを用いてコントラストを調整した。スケールバー = 50 µm。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本手法では、微小流体圧縮デバイスを用いて、圧縮ストレスが腫瘍と免疫細胞の相互作用に及ぼす影響を調査する方法について記述します。このシステムは、3Dコラーゲンマトリックス内に埋め込まれた腫瘍スフェロイドに対し、制御された機械的圧縮を加えることが可能です。細胞チャンバー（L1）の底部を形成するガラス基板により、高解像度の生細胞イメージングが可能となり、免疫細胞の運動性、浸潤、および細胞毒性活性の定量化を目的とした研究に適したプラットフォームとなっています。重要な点として、本システムは細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用を維持しつつ、機械的環境を精密に制御することを可能にします。対照的に、圧縮ストレスを研究するための既存の多くの実験的手法では、ECM介在性の細胞相互作用9,13と高解像度イメージング14との間でトレードオフが生じます。

本研究では、NK細胞とMCF-7乳がん腫瘍スフェロイドをモデルシステムとして使用しました。しかし、このマイクロ流体圧縮デバイスは、これらの細胞型に限定されるものではありません。現在までに、本プラットフォームはMDA-MB-231乳がん腫瘍スフェロイドやMCF-10A乳腺スフェロイドを含む、複数の乳腺細胞モデルに正常に適用されています15,17。本プラットフォームは、脳腫瘍や肺腫瘍のスフェロイドを含む、その他の多様な腫瘍モデルにおける腫瘍・免疫相互作用の調査に容易に適応させることが可能です。同様に、本プラットフォームはNK細胞以外の広範な免疫細胞集団とも互換性があり、機械的圧縮下における多様な腫瘍・免疫相互作用の研究を可能にします。さらに、本デバイスはスフェロイドベースの研究に限定されず、単一細胞実験にも適応させることができます。これらの特性により、本プラットフォームは、広範な生物学的および疾患的な背景において機械的な力がどのように細胞挙動を制御するかを検討するための汎用性の高いツールとなります。

このシステムのもう一つの利点は、サンプルに加える圧縮の強度とパターンを精密に制御できることです。本研究では、実験期間中、50%の静的圧縮歪みを適用しました。しかし、歪みのレベルは実験目的に応じて容易に変更可能です。さらに、外部圧力制御システムを用いることで、矩形波や正弦波などのさまざまな波形の動的圧縮をスフェロイドに適用できます。矩形波圧縮は、圧縮と解放の時間を交互に繰り返すものであり17、正弦波圧縮は、時間の経過とともに圧縮を緩やかに増減させるものです15。これらの機能に定量的なイメージングと予測モデリングを組み合わせることで、動的圧縮が免疫殺傷効率に及ぼす影響を研究することが可能です。

この圧縮デバイスは、もともと腫瘍の力学的特性を評価するために開発されたものであることに留意されたい17。腫瘍スフェロイドの下に、in situ力センサーとポリアクリルアミド（PAA）ゲル層を組み込むことで、剛性や粘弾性といったスフェロイドの力学的特性を定量的に評価することが可能となる15,17。この改良により、本プラットフォームの有用性は圧縮ストレスのモデリングに留まらず、腫瘍の力学的挙動の直接測定まで拡大される。

全体として、このマイクロ流体圧縮デバイスは、スフェロイドの機械的特性の測定から、機械的な変調環境下における腫瘍と免疫細胞の相互作用の調査まで、幅広い用途に適用可能です。ただし、デバイスを正常に動作させるには、いくつかの重要な手順が必要です。均一な圧縮を確実にするため、腫瘍スフェロイドは各ウェルの中心付近に配置する必要があります。また、圧力を正確に伝達させるため、圧力制御ユニットを細胞チャンバー層（L1）に正しく合わせなければなりません。圧力制御ユニットをL1の上に配置する際に気泡が混入することがあり、これがイメージングの品質や実験結果に悪影響を及ぼす可能性があります。この問題を防止するため、コラーゲン混合物を充填する際に気泡が入らないよう注意し、圧力制御ユニットを配置する前に、各ウェルに8 µLのコラーゲン混合物を加えてチャンバーをわずかにオーバーフローさせてください。これにより、層間の完全な接触が確保され、空気が閉じ込められる可能性を低減できます。

結論として、本デバイスは、腫瘍と免疫細胞の相互作用を支持する、生理学的に適切な3Dコラーゲンマトリックス内での圧縮ストレスの制御されたモデリングを可能にします。このプラットフォームは、静的および動的な機械的力が、腫瘍微小環境における免疫介在性の殺傷および腫瘍の挙動をどのように調節するかを調査するためのツールを提供します。現在、我々は腫瘍細胞の免疫殺傷の機械的調節の根底にある分子メカニズムを特定しています。これらの研究は、潜在的な新しい治療薬の標的につながる可能性があります。

開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

本研究は、米国国立がん研究所の助成金（助成金番号 R01CA221346）、コーネル大学工学部からFMに授与されたLance R. Collins Fellowship、およびコーネル大学プロボスト研究レジリエンス基金からFMへの助成により支援されています。本研究の一部は、米国国立科学財団（助成金番号 NNCI-2025233）の支援を受ける国立ナノテクノロジー調整インフラ（NNCI）の加盟機関であるCornell NanoScale Facilityにて実施されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199培地Sigma-AldrichM0650200 µL
2-メルカプトエタノールThermoFisher313500100
エアコンプレッサーElveflowJun-Air モデル3 コンプレッサー
自動X-Y顕微鏡ステージ応用科学計測機器MS-2000
CCDカメラ浜松ホトニクスORCA-R2
ウシ胎児血清 (FBS)GeminiBioS11150
流体輸送チューブEleveflowPTFEチューブ予備ロール外径 1/16 インチ
蛍光光源Excelitas Technologies X-Cite シリーズ 120 PCユニット
葉酸シグマF7876
グルタルアルデヒド電顕科学 160190.10%
Harrick プラズマクリーナーHarrick PlasmaPDC-001-HP高出力設定（45W）
ウマ血清 (HS)ThermoFisher16050-122
倒立蛍光顕微鏡OlympusIX8120倍対物レンズ（NA = 0.25）、Olympus CellSensソフトウェアを用いて操作
マスクArtus10枚セット アルミニウム製シムストック厚さは0.0125である" (0.75 mm)
MCF-7/GFP (ピューロマイシン) 安定発現細胞株GenTarget IncSC050-G
金属製フレームカスタムメイド 特注品 
マイクロ流体リザーバーEleveflow50 mLマイクロ流体リザーバー 
顕微鏡 OlympusCKX414倍対物レンズ              (NA = 0.1)
ミオイノシトールシグマI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco 15140122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ThermoFisher 10010072
空気圧チューブエレブフローPURポリエーテル透明パイプ投入口4" 外径 mm
ポリエチレンイミン (PEI)Sigma-AldrichP31431%
圧力コントローラElveflowOB1 NK4Elveflow Smart Interfaceソフトウェアを使用して操作
ラット尾由来I型コラーゲン Corning35424931.3 µL 9.6 mg/mLのコラーゲンストック溶液から
ネジフィリップスM2.5 パンヘッドネジ12本
ステージインキュベーター高精度プラスチックカスタムメイド
シリンジBecton Dickinson3031343/32インチへのオスルアーインテグラルロックとのペアリング" Eleveflow製ODバーブ
α-MEM培地ThermoFisher12561056

参考文献

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