マウスの第一下顎大臼歯を抜歯するための改良法について述べ、その手技の効率性と再現性を評価するために従来法と比較します。この改良法により、手技の一貫性が向上し、マウスの下顎歯槽癒合モデルを構築する際の技術的な課題が軽減されます。
この記事について
サマリー
要約
歯槽窩治癒モデル（TSHM）は、骨再生の根底にある分子メカニズムを調査するために広く利用されている動物モデルである。マウス下顎TSHMは、下顎特有の病理学的過程を研究する上で有用であるが、下顎大臼歯領域の解剖学的および生物力学的特性のため、このモデルの構築は技術的に困難である。本プロトコールでは、マウスの下顎第一大臼歯抜歯のための改良アプローチについて記述し、手技の効率性と再現性を向上させるために、従来法とその性能を比較する。制御された実験条件下において、改良アプローチは平均抜歯時間を29分から10分へと大幅に短縮した。さらに、改良群では歯根や歯槽骨の骨折を含む抜歯に関連する合併症が少なく、手技の一貫性が向上したことが示された。マイクロコンピューター断層撮影（μCT）分析により、初期治癒過程における抜歯窩構造の保存性が向上していることがさらに実証された。これらの知見は、改良された抜歯アプローチが、マウス下顎抜歯に伴う技術的課題を軽減しつつ、手技の効率性と再現性を向上させることを示している。本プロトコールは、特に顕微外科的な経験が少ない研究者において、マウス下顎歯槽窩治癒モデルのより一貫した構築を促進することが期待される。
概要
抜歯窩治癒モデル（TSHM）は、骨再生を研究するための古典的なモデルである1。このモデルは、歯槽骨内に困難ながらも亜臨界的な損傷を作り出し、追加の介入なしに好ましい自然治癒を可能にする1。マウスは、その遺伝的背景、ヒトに近い骨代謝、比較的低い繁殖コスト、および飼育の容易さから、モデル生物として広く利用されている2。ここ数十年の遺伝子編集技術の急速な進歩により、骨再生の根底にある分子メカニズムを調査する上でマウスは不可欠な存在となった3。その結果、骨再生の調節メカニズムを調査するためのTSHMを構築するために、トランスジェニックマウスの臼歯抜去が広く用いられている4,5,6。
下顎骨は上顎骨よりも機械的な剛性が高く、柔軟性に欠けるため7、抜歯の技術的難易度が高くなります。そのため、多くの先行研究では上顎骨を用いたマウスTSHMを確立してきました4,5,6。加えて、上顎臼歯の抜歯における術野は比較的アクセスしやすく、また上顎骨は下顎骨よりも固定が容易であるため、手技的な負担が少なくなります。これらの課題がある一方で、マウスの下顎第一大臼歯は根尖部の形態が湾曲し拡大しているため、周囲の歯槽骨内での機械的な保持力が高まり8,9、抜歯をさらに困難にします（Figure 1）。それにもかかわらず、骨髄炎、薬剤関連顎骨壊死、インプラントのオッセオインテグレーション、およびバイオマテリアルを用いた骨再生など、下顎骨特有の病理学的プロセスの研究において、下顎抜歯モデルは不可欠です10,11,12。したがって、下顎骨特有の歯槽窩治癒モデルを必要とする研究にとって、マウスの下顎臼歯を抜歯するための再現性と信頼性の高い手法を確立することは重要です。
図 1. ヒトとマウスにおける歯の形態の概略比較。
(A) 成人ヒトの歯の概略図。(B) 若年マウスの下顎第一大臼歯の概略図。(C) 成熟マウスの下顎第一大臼歯の概略図。これらの図は、成熟マウスの下顎第一大臼歯が歯槽骨内でより高い機械的保持力を持つ要因となる、根の形態およびセメント質の分布の違いを強調している。エナメル質、象牙質、およびセメント質は、凡例に示される対応する色で示されている。解剖学的特徴は、既報の記載8,9,15に基づいている。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
当研究グループが以前に開発した抜歯技術では、シリンジを歯科用エレベーターに改造して利用しています13。この手法によりマウスの右下第一大臼歯の抜歯を成功させることができますが、高度な技術的精度が必要であり、習得には多大な練習を要します。経験のない操作者が行うと、隣接する解剖学的構造に不注意に損傷を与える可能性があります。さらに、左下第一大臼歯の抜歯において手技に習熟するためには、別途「鏡像的」なトレーニングが必要です。これらの課題により、抜歯窩の完全性が損なわれ、個体間での治癒結果の一貫性が低下し、マイクロサージェリーの経験が少ない研究者にとって本モデルの利用可能性が制限される可能性があります。
本プロトコルでは、処置のアクセス性と再現性を向上させるため、マウスの下顎第一大臼歯を抜髄するための改良法について解説します。このプロトコルは、下顎第一大臼歯のTSHMを確立するため、8週齢の雄性C57BL/6マウスを用いて検証されました。改良法を従来の手法と系統的に比較し、処置の効率性、抜歯の成功率、および処置に関連する合併症について評価しました。さらに、手法の習得中に遭遇した一般的な技術的失敗例を分析し、マウスの下顎TSHMを確立する研究者に実用的なガイダンスを提供します。
プロトコル
すべての手順は、四川大学華西口腔医学院の倫理委員会（WCHSIRB-D-2025-188）によって承認され、機関の動物愛護ガイドラインに従って実施されました。
注：体重 22–29 g の 8 週齢 C57BL/6 オスマウスを使用する。動物は、標準的な飼育条件下（21°C–24°C、湿度 40%–60%、12 時間明暗サイクル）で、標準飼料を給餌し、水を自由飲用として与えて維持する。材料表に記載されている材料および器具を使用する。比較評価および失敗例の提示には 24 匹のマウスを使用する。比較実験の前に、術者トレーニング用に別途マウスを用意する。
1. 手術前準備
- 器具の準備
- エレベーターとして使用する25 Gの注射針を準備する（任意）。各針の斜面のある先端を、約20°–40°に曲げる13。
- 歯科鉗子として使用する有鉤眼科用ピンセットを準備する。拡大鏡下で有鉤先端を点検し、歯が適切に揃っており、変形がないことを確認する。
- ゴムバンド1本と25 Gの注射針4本を用いて開口器を組み立てる。操作台としてフォームボードまたは段ボール、マウスの肢を固定するためのテープ、および術野を照らすためのヘッドランプを準備する。
- 術後の回復用として加熱パッドを準備し、手術前に約38°Cに予熱する。止血用の脱脂綿と、口腔内洗浄用の十分な量の生理食塩水を準備する。
- 抜歯の手順中に術者を保護するため、親指を覆う指サックを準備する。
- 無菌状態を維持するため、操作面と加熱パッドの上に滅菌不織布を敷く。
- 麻酔の準備
- ポビドンヨード消毒液に浸した脱脂綿を用いて、マウスの腹部を消毒する。1%ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）を腹腔内投与する14。足指をつねるテストで麻酔深度を確認し、必要に応じて追加麻酔を行う。
注：足指の反射が戻った場合、または処置が予想される麻酔持続時間に達した場合は、処置を中断し、承認された施設内の獣医学的プロトコルに従って追加麻酔を行うこと。 - 角膜の乾燥を防ぐため、麻酔直後に両目に動物用眼軟膏を塗布する。
- ポビドンヨード消毒液に浸した脱脂綿を用いて、マウスの腹部を消毒する。1%ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）を腹腔内投与する14。足指をつねるテストで麻酔深度を確認し、必要に応じて追加麻酔を行う。
- 消毒および滅菌の準備
- 操作台、加熱パッド、テープ、指サック、および周囲の作業エリアを75%エタノールで消毒する。マウス1匹ごとに、新しい滅菌綿棒、不織布、ゴムバンド、および針を使用する。有鉤ピンセットと生理食塩水は、使用前に施設標準の高圧蒸気滅菌プロトコルを用いて滅菌する。
注意：75%エタノールは可燃性である。熱、火花、裸火、その他の点火源から離れた、換気の良い場所で使用すること。適切な個人用保護具を着用すること。エタノールで処理した器具および表面は、処置を開始する前に完全に乾燥させること。 - 処置を開始する前に手指衛生を行う。清潔な手術用スクラブ、滅菌手術帽、サージカルマスク、および滅菌グローブを着用する。
- 操作台、加熱パッド、テープ、指サック、および周囲の作業エリアを75%エタノールで消毒する。マウス1匹ごとに、新しい滅菌綿棒、不織布、ゴムバンド、および針を使用する。有鉤ピンセットと生理食塩水は、使用前に施設標準の高圧蒸気滅菌プロトコルを用いて滅菌する。
2. 手術工程
- マウスの固定と清掃
- マウスを固定プレート上に仰臥位で配置し、四肢をテープで固定する。眼窩・耳平面の高さに25 G針を2本、さらに下顎骨の下に25 G針を2本、フォームボードに挿入する。
- 針の上にゴムバンドをかけ、切歯をまたいで口を開いたまま固定する。舌を優しく後退させ、手術部位と反対側に配置して術野の妨げにならないようにする。本プロトコルでは、右下顎第一大臼歯を代表例として使用する。
- 生理食塩水で湿らせた小さな綿球を用い、口腔内の食物残渣やその他の異物を除去する。
注：綿球を十分に絞って余分な生理食塩水を取り除き、液体が口腔内に入って窒息することを防ぐ。
- 遠心および近心側の抵抗の除去（任意）
- 左手のピンセットで口の右端を牽引し、右下顎第一大臼歯および周囲の頬側および舌側の軟組織を完全に露出させる。
- 右手にピンセットを持つ。次に、左手で25 G針を持ち、遠心根に隣接する頬側歯根膜に慎重に針を挿入し、歯根膜腔を作成する。
- 針を大臼歯に向かって近心側および舌側へ回転させながら、根尖領域に向かってゆっくりと進め、歯槽窩から根を緩める。
- 頬側から根分叉に25 G針を挿入し、左手で咬合面方向へ持ち上げる。右手に2本の目の25 G針を持ち、近心根に隣接する舌側歯根膜に挿入して歯根膜腔を作成し、その後、針を遠心側および頬側へ回転させる。
- 歯根膜の事前緩緩が完了した後、両方の針を術野から取り出す。
注：歯根膜の事前緩緩は、鉗子による最初の揺動後、歯の動揺が最小限で著しい抵抗がある場合にのみ行う。
- 揺動および抜歯
- 左手の索引指と中指でマウスの頭部を安定させる。指サックを装着した親指を下顎切歯に当てて支持し、同時に右手でピンセットを持つ。
- ピンセットの先端を咬合平面に対して垂直、かつ歯の長軸に対して平行に保持する。安定した牽引を得るために、鋸歯状の先端を根分叉内に配置する。
注：根折れの原因となるため、ピンセットで歯根を直接把持しないこと。 - ピンセットで歯冠を把持し、緩やかな頬舌方向の揺動を加える。頬側への揺動角を30°、舌側への揺動角を50°に制限する。1–1.5 sに1回の割合で揺動を行う。
- 左親指の腹で下顎切歯に対して安定した対抗支持を行い、下顎を安定させながら、根尖から歯冠に向かって大臼歯の長軸に沿った牽引を維持する。
注：切歯や隣接する軟組織への過度な圧迫や変位を避けながら、持続的で安定した対抗支持を維持する。 - 歯が徐々に動揺し、咬合面が隣接する大臼歯よりも明らかに上昇するまで揺動を続ける。手順全体を通じてピンセットの先端を歯の長軸と平行に保ち、十分な動揺が得られたところで抜歯する。
注：最終的な抜歯力を加える前に、歯冠を頬舌方向に優しく揺らして歯の動揺性を評価する。歯冠が最小限の抵抗で変位し、頬舌方向の移動振幅が歯冠幅の約半分に達した場合にのみ、抜歯を進める。完全な抜歯の直前に麻酔の深さを再評価し、必要に応じて追加麻酔を投与する (図 2)。
図2従来のマウス下顎第一大臼歯抜歯法と修正法の比較。
(A) 従来の抜歯法の概略図。曲げた25 G針を歯周靭帯に挿入し、レバーとして使用して歯を脱臼させる。(B) 改良抜歯法の概略図。有鉤眼科用ピンセットで歯冠を把持し、歯の長軸に平行に牽引を加える。(C) エレベーターとして使用した25 G針の曲げた先端の代表像。(D) マイクロ抜歯鉗子として使用した有鉤眼科用ピンセットの代表像。(E) 下顎第一大臼歯抜去直後の抜歯窩を示す代表的な術中像。点線で囲まれた部分は抜歯窩を示す。(F) 抜去に成功した下顎第一大臼歯の頬側像。(G) 同一の抜去下顎第一大臼歯の舌側像。スケールバー = 2 mm (C, D) および 400 µm (E–G)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. 抜去歯および抜歯窩の検査
- 抜歯した歯を検査し、完全に除去されていることおよび構造的な完全性を確認する。根の形態が保持されており、近心根が長く、遠心根が短く、根尖部が拡大していることを確認する15。抜歯した歯に歯槽骨の断片が付着していないことを検証する。
- 抜歯窩を検査し、清潔であり、根の残存断片がないことを確認する（図 2）。
注：抜歯中に根の残存または破折が疑われる場合は、過度な操作が抜歯窩の欠損を悪化させる可能性があるため、繰り返しの操作を避ける。拡大鏡を用いて抜歯部位を検査し、根の残存断片の有無を確認する。根が残存または破折した症例は、抜歯失敗として記録し、以降のモデル評価から除外する。これらの動物は、承認済みの動物実験プロトコルに従って取り扱う。
4. 術後管理
- 乾燥した綿を当てて止血します。生理食塩水で湿らせた小さな綿球を用いて口腔内を清浄し、舌を元の位置に戻します。
注意：綿球を湿らせる際は、液滴が滴り落ちない程度に表面を湿らす最小限の滅菌生理食塩水を使用してください。 - 術後の鎮痛のため、カルプロフェン（5 mg/kg、皮下投与）を投与します。
- 動物をヒーティングパッドの上に置き、意識が回復するまで継続的にモニタリングします。
- 麻酔から回復後、ケージの床に軟化した標準飼料またはゲル状飼料を3日間提供し、水は自由飲水とします。通常の摂食行動が確認された後、標準飼料に戻します。
- あらかじめ設定した間隔で、食物摂取量、体重、活動量、グルーミング行動、顔面の腫れ、口腔内出血、および痛みや苦痛の兆候をモニタリングします。
5. オペレーターのトレーニング
- マウスの硬組織再生モデルの経験がない2名のオペレーターを、従来法群または修正抜歯法群のいずれかにランダムに割り当てる。従来法と修正抜歯法の両方の手法に習熟した同一の指導者の監督下で、オペレーターを個別にトレーニングする。
- 第1週目は、各オペレーターに割り当てられた抜歯手順をマウスの死体で練習させ、外科的ワークフローに慣れさせる。
- 第2週目は、生きたマウスを用いてトレーニングを監督し、各手技の実践的な適用を評価および改善する。適切な麻酔が行われているかを確認し、不適切な器具操作による周囲軟組織の偶発的な損傷や歯槽構造の損傷などの、意図しない外科的合併症を防ぐために各処置を監視する。オペレーターが3回連続で独立して抜歯に成功した時点で、習熟度を認定する。監督下でのトレーニング完了後、抜歯の比較実験に進む。
6. 試料調製
- 頚椎脱臼によりマウスを安楽死させます。頭部から下顎骨を摘出し、付着している軟組織を除去します。
- 下顎骨を4%パラホルムアルデヒド溶液で48時間固定します。µCTスキャンを行うまで、標本をPBS中で保存します。
7. µCTおよび解析
- µCTスキャナーを用いて下顎骨をスキャンします。スキャンパラメータは、80 kV、500 µA、10 µmのボクセル解像度、およびレイヤー別のスキャンに設定します。
- ヒドロキシアパタイトファントムを用いてµCTシステムの校正を行います。ファントムをスキャンし、DataViewerを用いて再構成画像をエクスポートします。
- CTAnを用いてファントム画像を解析します。ファントムインサートの測定CT減弱値と既知の鉱物質密度を相関させ、減弱値をBMDに変換するための校正曲線を作成します。
- すべてのサンプルに同一のスキャンおよび再構成パラメータを適用します。
- µCTシステムに関連付けられたCTAnの標準化再構成ワークフローを用いて、すべてのデータセットを再構成します。すべてのサンプルに同一の再構成設定、ROI定義、および定量解析基準を適用します。代表的な可視化のために、CTAnの定量解析で使用したROI定義に従い、Mimics Researchを用いて別途三次元再構成を行います。
- 抜去した下顎第一大臼歯の根尖領域を選択し、関心領域（ROI）を定義します。隣接する第二大臼歯のセメント・エナメル接合部から根尖方向に向けて、連続する100枚の横断切片を収集します。
- 各切片において、抜創周囲に新しく形成された歯槽骨の境界に沿ってROIを手動で囲みます。すべてのサンプルで同一の解析パラメータを用い、CTAnでその後の画像処理および定量解析を行います。
- Mimics Researchを用いて三次元再構成を行います。根破折および抜創壁欠損の発生率を、下顎骨サンプルの総数に対する各状態を呈したサンプルの割合として算出します。
- すべての統計解析およびグラフ作成はGraphPad Prism v10.1.2を用いて行います。Shapiro–Wilk検定を用いて、連続変数の正規性を評価します。
- すべての解析において、個々のマウスおよびそれに対応する抜創を実験単位として定義します。
- 抜去時間、BMD、およびBV/TVについて、非対応の二峰性Student's t 検定を用いて群間比較を行います。根破折および抜創壁欠損の発生率については、Fisherの正確確率検定を用いて比較します。
- 統計的有意性は以下のように表記します：*、p < 0.05；**、p < 0.01；***、p < 0.001。2群間に統計的に有意な差がない場合は「ns」と表記します。
結果
下顎第一大臼歯抜歯に関連する解剖学的特徴を図1に示し、従来の手法と改良した抜歯アプローチを図2A,Bに模式的に示します。準備した針と有的に歯の眼科用ピンセット、新鮮な抜歯窩、および抜去された下顎第一大臼歯の代表的な画像を図2C–Gに示します。全手順のワークフローを図3にまとめます。2つのアプローチの処置効率と一貫性を比較するため、マウスの取り扱い経験が同等の2名の術者を、従来法または改良法のいずれかを用いて下顎第一大臼歯抜歯を行う群にランダムに割り当てました。すべてのマウスは8週齢の雄性C57BL/6マウスを用いました。抜歯時間と処置に関連する合併症は抜歯直後に記録し、抜歯窩は治癒から2週間後にµCTで評価しました。抜歯時間は処置中に記録するため、盲検化して評価することはできず、抜去歯およびµCTデータセットは評価前にコード化し、評価者が抜歯方法を識別できないようにしました。
図3従来および修正されたマウス下顎第一大臼歯抜去手順のワークフロー。
ワークフローは、器具の準備、麻酔、消毒および滅菌、そしてマウスの固定から始まります。その後、プロトコルは従来の手法と改良された抜歯手法の2つのアプローチに分かれます。従来の手法では、抜歯前に遠心側および近心側の抵抗を順次除去します。一方、改良された手法では、必要に応じて歯周靭帯をあらかじめ緩めた後、有鉤眼科用ピンセットを用いて揺動させながら抜歯を行います。どちらのアプローチにおいても、最後に抜いた歯と抜歯窩の検査を行い、術後ケアをもって終了します。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
抜去直後および治癒から2週間後に得られた代表的なµCT画像をFigure 4A–Dに示す。改良法では、従来法と比較して平均抜去時間が有意に短縮された（10 min vs. 29 min, p = 0.0006; Figure 4E）。根折は改良群の2/6匹（33.3%）、従来群の4/6匹（66.7%）で発生したが、群間に統計的な有意差は認められなかった（p = 0.5455; Figure 4F）。歯槽壁の欠損は改良群の0/6匹、従来群の4/6匹（66.7%）で観察されたが、この差は統計的に有意ではなかった（p = 0.0606; Figure 4G）。2週間の治癒後、µCT解析により、改良群は従来群よりもBMDおよびBV/TVの値が有意に高いことが示された（それぞれ p = 0.0188 および p = 0.0253; Figure 4H,I）。これらの結果は、改良法によって抜去時間が短縮され、試験した実験条件下で抜去の整合性が向上することを示唆している。
図4マウスの下顎第一大臼歯抜去およびその後の歯槽窩治癒における、従来の手法と修正手法の比較。
(A–D) 代表的なマイクロコンピューター断層撮影（µCT抜歯直後（A,B）および抜歯2週間後（C,D）における、従来法（A,C）または改良法（B,D）を用いた抜歯窩の画像。(1)～(3)のパネルはそれぞれ矢状面、冠状面、横断 Since 面を示し、パネル(4)は対応する3次元再構成像を示す。赤色の破線は元の歯根の輪郭を示している。白色の破線と赤色の矢印は、抜歯窩壁の欠損を示している。A1, B1, C1, D1のオレンジ色の実線は、対応する断面図の位置を示す。C1, C2, D1, D2の青色の破線は、抜歯窩内に新しく形成された骨の範囲を示している。3次元再構成像（C4,D4）では、新しく形成された骨が赤色で強調されている。(E–I) 抜歯時間（E）、歯根破折発生率（F）、抜歯窩壁欠損発生率（G）、骨密度（BMD; H）、および骨体積比（BV/TV; I）を含む、抜歯性能と初期の抜歯窩治癒の定量的比較。処置結果（E–G）について、 n = 1群あたりマウス6匹；（以下、） µCT 抜歯窩治癒の解析 (H,I)、 n ＝各群3匹のマウス。個々のマウスおよび対応する抜歯窩を実験単位とした。E、H、およびIにおける連続的なアウトカムは平均値±標準偏差（SD）で示し、非ペアの両側Studentのt検定を用いて比較した。 t FおよびGにおけるカテゴリー的な結果は、実数およびパーセンテージとして提示し、フィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。歯根破折は、従来群で4/6匹（66.7%）、改良群で2/6匹（33.3%）に認められた。歯槽壁欠損は、従来群で4/6匹（66.7%）、改良群では0/6匹に認められた。統計学的有意性：* p < 0.05; ***, p < 0.001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
抜歯の成功は、図 4A–Dに示すように、その後の治癒評価のために歯槽窩の構造を維持しつつ、残根を残さずに下顎第一大臼歯を完全に除去したことと定義した。不完全な抜歯、または処置に関連する損傷によってその後の歯槽窩治癒の評価が困難となった場合は、抜歯は不成功とみなした。不成功の代表的な結果を図 5A–Fに示す。図 5Aに歯冠破折を、図 5Bに遠心根破折を、図 5Cに近心根欠損を示す。残根および根尖破折を、それぞれ図 5D,Eに示す。下歯槽神経管領域近傍の構造的損傷を図 5Fに示す。これらの不成功の結果は、針の刺入角度や深さの不適切な制御、不適切な抜歯経路、過度な力の加搬、または過度な操作に関連していた。成功した結果と最適ではない結果の両方を含めることで、プロトコルの実施中に起こり得る結果の範囲を示し、抜歯の成功と失敗を解釈するための基準を提供する。
図5マウス下顎第一大臼歯抜歯に失敗した代表的な例。
(A–F) 代表例 µCT 一般的によく見られる抜歯関連の合併症を示す画像および三次元再構成図。(A) 歯冠折損。(B) 遠心根折損。(C) 近心根欠損。(D) 残根。(E) 根尖折損。(F) 周囲の解剖学的構造への損傷。赤色の点線は元の根管の輪郭を示す。白色の点線は骨欠損または隣接する解剖学的構造を示す。赤色の矢印は損傷部位または残存根片を示す。パネルA、B、D、Eに示す三次元再構成図では、折損した根および隣接歯が赤色で強調されている。パネルCおよびFには、三次元再構成図の代表的な断面図が含まれている。すべての検体は抜歯の2週間後に採取された。スケールバー = 200 µm略語： µCT, マイクロコンピューター断層撮影。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
TSHMを正常に構築するには、周囲の歯槽骨構造を維持しながら歯を完全に抜去することが必要であり、抜歯に伴う損傷は、その後の骨再生を妨げる可能性がある16。したがって、抜歯手順の再現性は、モデルの信頼性を決定する重要な要因となる17。本研究では、標準化されたトレーニング条件下において、改良された鉗子ベースの下顎第一大臼歯抜去法と、従来のレバーベースの手法を系統的に比較した。改良法では、抜歯時間の有意な短縮と抜歯に伴う合併症の減少に表れているように、処置の効率性と再現性が向上することが示された。具体的には、同様の2週間のトレーニング期間後、平均抜歯時間は従来法の29 minから改良法では10 minに短縮された。さらに、従来法群では合併症が頻繁に発生したのに対し、改良法群では歯槽窩壁の欠損は見られなかった。根折の発生率に群間での有意な差は認められなかったが、改良法で観察された頻度の低さは、本実験条件下における処置の一貫性の向上を示唆している。加えて、抜歯窩構造の保持が改善されたことで、2週間後の初期骨治癒が促進された。総合すると、これらの知見は、改良法がモデル構築時における術者依存的なばらつきを低減できる可能性を示している。
抜去した歯と抜歯窩の直接観察により、明らかな歯根骨折や重大な抜歯窩欠損を日常的に識別することは十分可能です。本比較研究では、残留した歯根断片や微細な抜歯窩壁の欠損を特定し、初期の抜歯窩治癒結果を定量化するための客観的な検証ツールとしてµCTを使用しました。改良法による性能向上は、抜歯に用いられた機械的な戦略の違いに起因すると考えられます。マウス下顎TSHMにおける従来の抜歯法は、一般的に脱臼操作13,18に依存しており、臼歯の周囲に挿入した器具を介して機械的な力を加え、徐々に歯を動かします。しかし、マウスの下顎第一大臼歯は根尖部の形態が大きく、外科的なアプローチが困難であるため9、このような操作は挿入部位や周囲の歯槽構造に局所的な機械的ストレスを生じさせる可能性があります。対照的に、改良法では主要な加圧点を歯根領域からより安定した歯冠へと移行させています。下顎を同時に固定しながら、歯の長軸と平行に制御された牽引力を加えることで、この戦略は抜歯窩の漸進的な拡大を促進し、制御不能なストレス集中を軽減できる可能性があります。重要なことに、この変更によって抜歯中の主要な力制御ステップが簡素化され、微小外科の経験が少ない研究者にとっての技術的ハードルを下げられる可能性があります。
これらの利点があるものの、本プロトコルの結果は術者の手技に依存するため、適切に実施するにはいくつかの技術的な考慮事項が重要です。第一に、クラウンの把持力を高め、軸外への力適用に伴う不要な応力集中や歯根破折を最小限に抑えるため、加える力の方向を歯の長軸と平行に維持してください。第二に、抜歯窩の完全性を損なう可能性があるため、歯用ピンセットの挿入深さを深くしすぎることや、過度な操作は避けてください。第三に、オプションである歯根膜の事前緩緩ステップでは、著者らの以前の報告13に基づき、周囲の歯槽骨への損傷を最小限に抑えるため、針を歯根の長軸と平行に挿入してください。したがって、改良されたアプローチによって手技のアクセス性は向上しましたが、一貫した結果を得るためには、適切なトレーニングと標準化された操作が不可欠です。
これらの結果を解釈する際には、いくつかの制限を考慮する必要があります。第一に、µCT評価のサンプルサイズが比較的限定的であったことです。したがって、初期の骨治癒に見られた差は、治癒の促進を決定づける証拠というよりも、モデル構築の改善を支持する根拠として解釈されるべきです。第二に、本研究では2名の術者のみが参加したことです。その結果、術者間のばらつきの評価が限定的となり、術者に関連するバイアスが導入された可能性があります。第三に、本プロトコルは8週齢の雄マウスの右下顎第一大臼歯においてのみ検証されたことです。異なる年齢群における抜歯の成功率、処置に関連する合併症、および歯槽窩の治癒に関する定量的な比較は行われませんでした。したがって、観察された利点が異なる年齢や性別の動物に一般化できるかどうかについては、さらなる調査が必要です。
要約すると、本研究ではマウス下顎第一大臼歯抜歯の最適化されたアプローチを提示し、従来法との直接比較を通じてその有用性を検証しました。この改良法により、マウス下顎歯槽骨治癒（TSHM）モデルのより再現性の高い構築が可能となり、初心者にとっての技術的なハードルが軽減されます。これらの知見は、下顎歯槽骨治癒モデルを構築する研究者にとって実用的な指針となります。
開示事項
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（助成金番号 82571084）および四川省科学技術計画（助成金番号 2024JDKXJ0001）の支援を受けて行われました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 25 G シリンジ針 | Beyotime | FS802-30pcs | 開口器およびオプションの歯周靱帯の事前緩緩に使用する使い捨てシリンジ針 |
| 4% パラホルムアルデヒド溶液 | Solarbio | P1110 | 検体固定に使用する4% パラホルムアルデヒド溶液 |
| 75% エタノール | Ouse Medical Devices Store | N/A | 表面消毒に使用する75% 医療用エタノール |
| C57BL/6マウス | Charles River | 213 | 体重 22–29 g の8週齢雄 C57BL/6マウス |
| カロプロフェン | Solarbio | C5350 | 5 mg/kg で皮下投与する術後鎮痛剤 |
| 脱脂綿 | Ouning Medical Devices | N/A | 口腔清掃および止血に使用する滅菌脱脂綿 |
| CTAn v1.18.4.0+ | SkyScan | N/A | μCT画像解析に使用するソフトウェア |
| DataViewer v1.5.6.2 | SkyScan | N/A | 再構成されたμCT画像の閲覧および書き出しに使用するソフトウェア |
| フィンガースリーブ | LeSu Office | MEKU-1/2/3B | 抜歯時の親指保護に使用するフィンガースリーブ |
| フォームボード | Dongguan Lijianglong Industrial Co., Ltd. | N/A | 手術および固定プラットフォームとして使用するフォームボード |
| ゲルダイエット | ReadyDietech | J10001 | 必要に応じてケージの床に3日間提供する術後飼料 |
| GraphPad Prism v10.1.2 | GraphPad | RRID: SCR_002798 | 統計解析およびグラフ作成に使用するソフトウェア |
| ヘッドランプ | Bazhou Pengen Protective Equipment Factory | N/A | 術野を照らすために使用するヘッドランプ |
| ヒーティングパッド | Shijiazhuang Jianuan Electrical Appliances Co., Ltd. | N/A | 術後回復のために約 38 °C に予熱したヒーティングパッド |
| ヒドロキシアパタイトファントム | QRM | QRM-70127 | CT減弱値を骨ミネラル密度に変換するために使用する校正用ファントム |
| 拡大鏡装置 | Olympus Corporation | SZX10 | 有鈎ピンセットの先端および抜歯窩を拡大して観察するために使用する装置 |
| マスク | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | サージカルマスク |
| マイクロコンピューター断層撮影スキャナー | Bruker SkyScan | SkyScan 1276 | 80 kV、500 μA、ボクセル解像度 10 μm で使用するμCTスキャナー |
| Mimics Research v21.0 | Materialise | RRID: SCR_015802 | 3次元再構成に使用するソフトウェア |
| ペントバルビタールナトリウム | Sigma-Aldrich | P3761 | 1% 麻酔溶液として使用するペントバルビタールナトリウム塩 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Solarbio | P1010 | 0.01 M リン酸緩衝生理食塩水粉末、pH 7.2–7.4 |
| ポビドンヨード消毒液 | Belkon Pharmacy Flagship Store | N/A | 腹部消毒に使用するポビドンヨード溶液 |
| 輪ゴム | Foshan Puli Rubber Products Factory | N/A | 開口器の組み立てに使用する輪ゴム |
| 生理食塩水 | Thermo Fisher | BR0053G | 口腔清掃用の溶液調製に使用する生理食塩水タブレット |
| 標準飼料 | Jiangsu Xietong Pharmaceutical and Biotechnology Engineering Co., Ltd. | XTC01WC-001 | 日常的な飼育に使用し、術後の給餌には軟化させて使用する標準飼料 |
| 高圧蒸気滅菌器 | Institutional facility | N/A | 有鈎ピンセットおよび生理食塩水を滅菌するために使用する装置 |
| 滅菌綿棒 | Kangbailai Medical Devices Store | N/A | 使い捨て滅菌綿棒 |
| 滅菌手袋 | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | 滅菌ラテックス手袋 |
| 滅菌不織布 | Shandong Xinhua Infection Control Supplies Hangzhou Store | N/A | 手術面およびヒーティングパッドの被覆に使用する滅菌不織布 |
| 滅菌サージカルキャップ | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | 滅菌サージカルキャップ |
| サージカルスクラブ | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | 処置中に着用する清潔なサージカルスクラブ |
| テープ | Thermo Fisher | 15947 | マウスの肢を固定するために使用する粘着テープ |
| 有鈎眼科用ピンセット | Beyotime | FS229 | 歯科用鉗子として使用する有鈎眼科用鉗子 |
| 動物用眼軟膏 | Dechra Veterinary Products | 143-16 | 角膜の乾燥を防ぐため、麻酔後に塗布する眼軟膏 |
参考文献
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