このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

慢性糸球腎炎に関連する炎症および線維化メサンギウム細胞モデルにおけるβ-シトステロールのネットワークガイド評価

107 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

2026年8月28日

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、ネットワーク薬理学、検証済み分子ドッキング、およびin vitro実験を統合し、Cordyceps sinensisの構成成分と慢性糸球体腎炎に関連するプロセスの間の候補化合物と標的の相互関係を評価した。化合物レベルの検証のためにβ-Sitosterolが選定され、メサンギウム細胞モデルにおいて炎症および線維化促進性の活性化を減弱させることが明らかになった。

要約

慢性糸球体腎炎（CGN）は、持続的な炎症性損傷と進行性の線維化リモデリングを特徴としていますが、天然物ベースの介入の根拠となる化合物-標的関係はまだ十分に定義されていません。本研究では、ネットワーク薬理学、検証済みの分子ドッキング、およびin vitro 実験を統合し、CGN関連の病理学的プロセスにおける冬虫夏草（Cordyceps sinensis、C. sinensis）の候補成分を評価しました。C. sinensisの候補成分をスクリーニングし、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platformから得られた化合物関連標的とCGN関連遺伝子の共通項目を抽出しました。機能濃縮分析およびタンパク質-タンパク質相互作用分析を用いて、生物学的プロセスとハブ標的を優先順位付けしました。その結果、PTGS2が重要な共通標的として同定されました。分子ドッキングは、セレコキシブが結合したCOX-2構造を用いて行われました。共結晶化したセレコキシブリガンドの再ドッキングでは、RMSD 0.876 Åで結晶学的ポーズが再現され、ドッキングプロトコルの妥当性が支持されました。β-シトステロールとリノレイル酢酸は、それぞれ−7.2および−7.5 kcal/molの結合親和性を示し、COX-2ドッキング領域との適合性が予測されました。HBZY-1ラット糸球体メサンギウム細胞における化合物レベルの検証には、β-シトステロールが選択されました。0.5–10 µMの濃度において、β-シトステロールは細胞生存能を著しく低下させませんでした。リポ多糖（LPS）刺激細胞において、β-シトステロールはTnf、Il6、およびPtgs2の発現を抑制し、プロスタグランジンE2（PGE2）の産生を減少させ、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）タンパク質の存在量を減少させました。形質転換増殖因子β1（TGF-β1）処理細胞において、β-シトステロールはCol1a1およびActa2の発現を抑制し、α-スムーズムスリンアクチン（α-SMA）タンパク質の存在量を減少させました。これらの知見は、β-シトステロールがメサンギウム細胞モデルにおける炎症性および前線維化性の活性化を調節するという仮説を生成する根拠を提供しますが、COX-2の直接的な酵素阻害やCGNにおける治療有効性を立証するものではありません。

概要

慢性糸球体腎炎（CGN）は、慢性腎臓病および末期腎不全へと進行し得る、不均一な糸球体疾患のグループで構成されています1。それは、持続的な糸球体損傷、炎症性活性化、および進行性の線維化リモデリングを特徴とします2,3。選択された患者には副腎皮質ステロイドや免疫抑制剤が使用されますが、多くの場合で長期的な疾患コントロールは困難であり、治療に関連する副作用も一般的です1,4,5。CGNの進行には、免疫活性化、内皮機能不全、酸化ストレス、および細胞外マトリックスの蓄積を含む、相互に作用する病理学的プロセスが関与しています3,6,7。したがって、炎症反応と前線維化反応をつなぐ分子ノードを特定することは、疾患に関連する介入戦略のための検証可能な仮説を構築するのに役立つ可能性があります。

Cordyceps sinensis (C. sinensis) は、腎臓に関連する臨床および実験的な文脈で使用されており、いくつかの疾患モデルにおいて抗炎症作用、抗アポトーシス作用、および細胞保護作用を及ぼすことが報告されている8,9,10。しかし、その候補成分が糸球体腎炎に関連する標的とどのように相互作用するかという分子基盤は、まだ十分に定義されていない11。C. sinensisの多成分的な性質とCGNのメカニズム的な不均一性を考慮すると、ネットワーク薬理学は、候補となる化合物・標的・パスウェイの関係を優先順位付けするための有用な枠組みを提供する12,13。

本研究では、化合物スクリーニング、ターゲット抽出、疾患・遺伝子交差分析、機能濃縮分析、タンパク質間相互作用ネットワーク分析、分子ドッキング、およびin vitro検証を統合し、C. sinensisの候補成分とCGNに関連する病理学的プロセスとの間の潜在的な分子関係を探索した。化合物-疾患ネットワークからハブターゲットとして優先的に選択されたプロスタグランジン・エンドペルオキシダーゼ合成酵素2（PTGS2）について、セレコキシブが結合したシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）構造を用いた分子ドッキングおよびリドッキング検証により評価を行った。ネットワーク解析の結果、ドッキング分析、および抗炎症・抗線維化活性に関する先行知見に基づき、下流の検証における代表的な候補化合物としてβ-シトステロールを選択した14,15,16。炎症性活性化およびCOX-2/プロスタグランジンE2（PGE2）関連反応を評価するためにリポ多糖（LPS）刺激メサンギウム細胞を用い、線維化促進マーカーの発現を評価するためにトランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）誘導モデルを用いた。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

ネットワーク薬理学およびバイオインフォマティクス解析は、公開データベースに基づいて行われ、ヒト参加者または動物は関与していません。in vitro実験は、既知の細胞株を用いて実施され、施設上の要件に従い、倫理委員会の承認は必要ありませんでした。

候補成分のスクリーニングおよび標的の回収

2025年7月13日に、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)において、検索キーワード「dongchongxiacao」を用いて候補成分およびそれらに対応する標的を抽出した。予測経口バイオアベイラビリティが30%以上、かつドラッグライクネスが0.18以上の化合物を保持した。その結果、7つの候補成分が両方のスクリーニング基準を満たした。記述的な比較を行うため、分子量、経口バイオアベイラビリティ、ドラッグライクネス、およびその他の利用可能な薬物動態記述子をTCMSPから記録した。

抽出された成分に関連する化合物-ターゲット情報は、TCMSPから直接ダウンロードした。非冗長なターゲットセットを構築する際、重複するターゲットエントリを手動で削除したが、その後のネットワーク構築のために元の化合物-ターゲット関係は保持した。TCMSPではターゲット名が標準化された遺伝子シンボルではなくフルネームで提供されていたため、各ターゲットをUniProtデータベース（2025年7月14日にアクセス）で検索した。対応するヒトのエントリを選択し、ターゲット名を公式の遺伝子シンボルに変換した。この標準化された化合物-ターゲットデータセットを、疾患-ターゲットの共通項抽出および化合物-ターゲットネットワーク解析に使用した。

糸球体腎炎関連遺伝子の収集およびターゲットの交差解析

2025年7月14日に、検索ワードとして「glomerulonephritis」を用い、GeneCards、DisGeNET、PharmGKB、およびTherapeutic Target Databaseから疾患関連遺伝子を抽出した。GeneCardsについては、レリバンススコアが中央値である10を超えるエントリーを保持した。その他のデータベースからは、キュレーション済みの疾患標的アノテーションに基づき、適格なエントリーを抽出した。遺伝子名はヒトの公式遺伝子シンボルに統一し、重複するエントリーを削除した。この手順により、1,134個の固有の糸球体腎炎関連遺伝子が得られた。検索に「glomerulonephritis」という広義の用語を使用したため、得られたデータセットは、特定の組織病理学的亜型ではなく、慢性糸球体腎炎に関連する分子プロセスに関連するものと見なした。

TCMSP由来の化合物関連ターゲットを、Rを用いて疾患関連遺伝子セットと交差させました。その結果、23個の共通ターゲットが同定されました。ベン図はRパッケージのvennを用いて作成し、化合物と共通ターゲットのネットワークはCytoscapeを用いて構築および可視化しました。候補成分と共通ターゲットの関係を表1にまとめています。

機能濃縮分析およびタンパク質間相互作用解析

Gene Ontology (GO) および Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) の濃縮分析を、R の clusterProfiler および org.Hs.eg.db を用いて実施した。Gene Ontology タームについては、「生物学的プロセス」、「細胞成分」、「分子機能」のカテゴリーで分析を行った。P 値は Benjamini-Hochberg 法を用いて多重検定補正を行い、補正後 P 値が 0.05 未満のタームまたはパスウェイを抽出した。濃縮されたタームおよびパスウェイは、個別に作成した棒グラフおよびドットプロットを用いて表示した。

重複する23個のターゲットをSTRINGに投入し、生物種としてHomo sapiensを選択し、最小相互作用スコアを0.4より大きく設定した。得られたタンパク質-タンパク質相互作用ネットワークをCytoscapeにインポートした。ネットワークトポロジーは、次数、介在中心性、近接中心性、固有ベクトル中心性、局所平均接続度、およびネットワーク中心性に基づき、CytoNCAを用いて評価した。ハブターゲットは、次数、介在中心性、近接中心性、固有ベクトル中心性、局所平均接続度、およびネットワーク中心性の値がいずれもネットワークの対応する中央値を上回るノードとして定義した。この解析により、その後の解釈に向けて9つのハブターゲットを優先的に抽出した。

分子ドッキングおよびリドッキングによる検証

セレコキシブが結合したシクロオキシゲナーゼ-2の構造（PDB ID 3LN1）を用いて分子ドッキングを実施しました。受容体の調製において、チェーンAおよびそれに付随するヘム群を保持し、結晶学的水分子および共結晶化したセレコキシブリガンドは除去しました。リドッキングによる検証のため、チェーンAから天然のセレコキシブ配座を別途抽出しました。AutoDockToolsを用いて極性水素原子とGasteiger電荷を付加し、受容体をPDBQT形式で保存しました。PDB ID 3LN1は、セレコキシブが結合したマウスCOX-2の2.40 Å分解能構造です。β-シトステロールおよびリノレイル酢酸の構造はPubChemから取得し、Open Babelを用いて調製しました。水素原子とGasteiger部分電荷を付加し、回転可能結合を割り当てた後、各リガンドをPDBQT形式に変換しました。セレコキシブ、β-シトステロール、およびリノレイル酢酸を、同一の受容体および探索パラメータを用いてAutoDock Vinaによりドッキングさせました。

ドッキングボックスは、以下の座標を用いて天然のセレコキシブ結合領域を中心として設定した：center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å。exhaustive値は16、出力モード数は10、エネルギー範囲は3 kcal/molに設定した。予測結合エネルギーが最も低い、上位のポーズを可視化のために保持した。プロトコルの妥当性確認のため、天然のセレコキシブを同一条件下で再ドッキングし、結晶構造のポーズと再ドッキングされたポーズ間の重原子二乗平均平方根偏差（RMSD）をPyMOLを用いて算出した。RMSDが2 Å未満であれば、参照ポーズの許容可能な再現とみなした。各ドッキングリガンドから4 Å以内に位置する残基をPyMOLで特定した。ドッキングスコアおよびポーズは、構造的な適合性の推定値として解釈し、標的結合または酵素阻害の直接的な証拠とはみなさなかった。

細胞培養および化合物の調製

HBZY-1ラット糸球体メサンギウム細胞を、10%胎児牛血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した高グルコースDulbecco’s modified Eagle mediumを用い、37 °C、5% CO₂の加湿条件下で培養した。すべての実験には継代数2～7の細胞を使用し、使用前にマイコプラズマ陰性であることを確認した。化学的に定義された化合物として、β-Sitosterolおよびcelecoxibを使用した。β-Sitosterolは、絶対エタノールに溶解して10 mMのストック溶液（約4.15 mg/mL）を調製した。必要に応じて、短時間の超音波処理および50–60 °Cへの加温を行い、視覚的に透明な溶液とした。Celecoxibは、ジメチルスルホキシドに溶解して10 mMのストック溶液（約3.81 mg/mL）を調製した。ストック溶液は分注し、−20 °Cで保存した。 処理直前に、ストック溶液をあらかじめ加温した培地で直接希釈し、直ちに混合した。

溶媒濃度は各実験内で一致させた。細胞生存率アッセイでは、テストしたβ-sitosterolの最高濃度が20 µMであったため、すべての群で最終エタノール濃度を0.2% v/vに調整した。LPS誘導性炎症実験では、すべての群でエタノールおよびジメチルスルホキシドの最終濃度を、それぞれ0.1%および0.01% v/vに調整した。TGF-β1誘導性線維化実験では、すべての群で最終エタノール濃度を0.1% v/vに調整した。コントロール群、LPS群、およびTGF-β1群には、対応する溶媒を同量添加した。

細胞生存率アッセイ

細胞を96ウェルプレートに、完全培地100 µLを用いて1ウェルあたり5 × 103 cellsの密度で播種し、24時間かけて接着させた。β-sitosterolsの濃度範囲を評価するため、細胞を0.5、1、5、10、または20 µMのβ-sitosterolとともに24時間インキュベートした。LPS関連の細胞生存率アッセイでは、細胞を1、5、または10 µMのβ-sitosterolで2時間前処理し、続いて1 µg/mLのリポポリサッカライドにさらに24時間曝露させた。

処理群は、コントロール、0.5 µM β-sitosterol、1 µM β-sitosterol、5 µM β-sitosterol、10 µM β-sitosterol、20 µM β-sitosterol、LPS、LPSおよび1 µM β-sitosterol、LPSおよび5 µM β-sitosterol、およびLPSおよび10 µM β-sitosterolとした。Cell Counting Kit-8試薬を1ウェルあたり10 µL添加し、プレートを2時間インキュベートした。その後、450 nmで吸光度を測定した。細胞不含のブランク値を差し引いて細胞生存率を決定し、コントロール群に対する相対値として算出した。各条件において、6回の独立した生物学的実験を行い、それぞれ6つのテクニカルウェルを用いた。各実験のテクニカルウェルの値を平均し、統計分析用の1つの生物学的レプリケート値とした。

LPS誘発性炎症活性化

炎症性活性化実験では、HBZY-1細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり2 × 105 cellsの密度で播種し、コンフルエンシーが約70%～80%に達した後に処理を行った。細胞は処理前の12時間、1%胎児牛血清を添加した培地で維持した。LPS刺激の2時間前に、β-Sitosterolまたはセレコキシブを投与した。その後、細胞を1 µg/mL LPSに24時間曝露させた。

実験群は、コントロール群、10 µMのβ-sitosterol投与群、LPS投与群、LPSおよび1 µMのβ-sitosterol投与群、LPSおよび5 µMのβ-sitosterol投与群、LPSおよび10 µMのβ-sitosterol投与群、ならびにLPSおよび1 µMのcelecoxib投与群とした。Celecoxibは、COX-2依存的なプロスタグランジン産生抑制の機能的陽性対照として導入した。処理終了後、PGE2測定のために培養上清を回収した。また、Tnf、Il6、Ptgs2の定量リアルタイムPCR分析およびCOX-2のウェスタンブロット分析のため、細胞を別途回収した。

TGF-β1誘導性線維化促進活性化

線維化促進活性を評価するために、別のTGF-β1誘導モデルを用いた。HBZY-1細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり2 × 105 cellsの密度で播種し、処置前の12時間、1%胎児牛血清を添加した培地で維持した。細胞をβ-sitosterolで2時間前処理した後、10 ng/mLのリコンビナントTGF-β1で48時間刺激した。

処理群は、コントロール、β-シトステロール (10 µM)、TGF-β1、TGF-β1 + β-シトステロール (5 µM)、および TGF-β1 + β-シトステロール (10 µM) とした。処理期間の終了後、細胞を回収し、Col1a1 および Acta2 の定量的リアルタイムPCR解析、ならびにα-平滑筋アクチン (α-SMA) のウェスタンブロット解析に用いた。

定量リアルタイムPCR

製造元のプロトコルに従い、フェノール・グアニジニウムベースのRNA抽出試薬を用いて、処理済み細胞から全RNAを単離した。分光光度計を用いてRNAの濃度と純度を測定した。A260/A280比が1.8–2.0のサンプルのみを逆転写に使用した。各サンプルについて、1 µgの全RNAを最終反応量20 µLで相補的DNAへと逆転写した。得られた相補的DNAは、定量PCRの前にヌクリーゼフリー水で5倍に希釈した。定量PCRは、10 µLの2× SYBR Greenマスターミックス、各10 µMのフォワードおよびリバースプライマーを0.4 µLずつ、2 µLの希釈済み相補的DNA、および7.2 µLのヌクリーゼフリー水を含む、合計20 µLの容量で実施した。増幅条件は、95 °Cで30 sの初期変性後、95 °Cで5 sの変性と60 °Cで30 sのアニーリング・伸長を40サイクル繰り返した。その後、増幅の特異性を確認するため、65 °Cから95 °Cまでの融解曲線分析を行った。

測定した遺伝子は、Tnf、Il6、Ptgs2、Col1a1、Acta2、およびGapdhである。Gapdhを内部参照遺伝子として用いた。相対的な遺伝子発現量は、Control群を校正用サンプルとして2−ΔΔCt法を用いて算出した。プライマー配列は付録表1に記載している。各サンプルについてテクニカルレプリケートを3回ずつ解析し、独立した生物学的実験を6回行った。統計解析の前に、テクニカルレプリケートから得られた値を平均した。

酵素結合免疫吸着法（ELISA）によるPGE2の測定

LPS刺激から24時間後に培養上清を回収し、4 °Cで1,000 × g、10分間遠心分離して細胞残渣を除去した。PGE2濃度は、市販の酵素免疫測定法（ELISA）キットを用い、製造元の指示に従って測定した。

標準試料とサンプルをアッセイプレートに二連で分注した。抗体結合および呈色ステップの完了後、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmにおける吸光度を測定した。PGE2濃度は、4パラメータロジスティック標準曲線から決定し、pg/mLとして算出した。6つの独立した細胞実験から得られた上清を解析した。統計解析の前に、各生物学的サンプルの二連測定値の平均を算出した。

ウェスタンブロッティング

処理した細胞を、プロテアーゼ阻害剤混合物を添加した放射免疫沈降アッセイ（RIPA）バッファーで溶解させた。溶解物を氷上で30分間インキュベートし、4 °Cで12,000 × gで15分間遠心分離した。上清中のタンパク質濃度をビシンコニン酸（BCA）タンパク質定量法を用いて決定した。等量（1レーンあたり30 µg）のタンパク質をローディングバッファーと混合し、95 °Cで5分間変性させた。LPS実験のタンパク質は10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで、TGF-β1実験のタンパク質は12%ゲルで分離した。分離したタンパク質をその後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。

メンブレンを0.1% Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水で調製した5%脱脂粉乳で室温にて1時間ブロッキングし、その後、COX-2（1:1000）、α-SMA（1:1000）、およびGAPDH（1:5000）に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。COX-2はLPS実験のサンプルで分析し、α-SMAはTGF-β1実験のサンプルで分析した。洗浄後、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（1:5000）とともに室温で1時間インキュベートした。タンパク質バンドを強化化学発光基質を用いて可視化し、化学発光イメージングシステムでキャプチャした。露光時間はCOX-2で約10 s、α-SMAで10 s、GAPDHで2 sとした。

バンド強度はImageJを用いて定量化した。COX-2およびα-SMAのシグナルは、対応するGAPDHのシグナルで標準化した。ウェスタンブロッティングは、6回の独立した細胞培養および処理実験から得られたタンパク質サンプルを用いて実施した。

統計解析

統計解析にはGraphPad Prismを使用しました。データは平均値 ± 標準偏差で的に示しています。定量的な分析ごとに6回の独立した細胞培養および処理実験を行い、各独立実験を1つの生物学的レプリケートとしました。同一の生物学的実験から得られたテクニカルレプリケートの測定値は、統計解析の前に平均化し、独立した観察値としてはカウントしていません。

細胞生存率アッセイでは、各生物学的実験において条件ごとに6つのテクニカルウェルを用いました。定量PCR反応は各生物学的サンプルについてテクニカルトリプリケート（3連）で実施し、PGE2の測定はデュプリケート（2連）で実施しました。ウェスタンブロットの定量は、独立して調製した6つのタンパク質サンプルに基づいて行いました。したがって、各定量バーには6つの個別の生物学的レプリケート値が含まれています。

多群間の差異は、一元配置分散分析後、Tukeyの多重比較検定を用いて解析した。両側 P 値 < p < 0.05を統計学的に有意であるとみなした。個々の生物学的反復値は、平均値および標準偏差とともに示した。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

候補成分のスクリーニング、ターゲットの抽出、およびターゲットの共通項の特定

候補となる化合物と疾患の共通ターゲットを特定するためのワークフローをFigure 1Aにまとめる。OB ≥30%およびDL ≥0.18という事前定義されたスクリーニング基準を満たしたC. sinensisの7つの候補化合物は、アラキドン酸、リノレイル酢酸、β-シトステロール、ペロキシエルゴステロール、セレビステロール、パルミチン酸コレステリル、およびCLRであった（Table 2）。並行して、GeneCards、DisGeNET、PharmGKB、およびTTDから1,134個の糸球体腎炎関連遺伝子を取得し、4つのデータベースにおけるそれらの分布をFigure 1Bに示す。化合物関連ターゲットセットと疾患関連遺伝子セットの交差分析により、23個の共通ターゲットが特定された（Table 1, ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、ネットワーク薬理学、リファレンドリガンドで検証した分子ドッキング、および化合物レベルの実験を統合し、C. sinensisの候補成分から導出されたPTGS2関連の仮説を検討した。7つの成分が事前に定義されたTCMSPスクリーニング基準を満たし、23個のターゲットが糸球腎炎関連の遺伝子セットと重複した。タンパク質相互作用解析により9つの中心的なターゲットが優先的に抽出され、その中からPTGS2がドッキングおよび実験的評価の対象として選定された。セレコキシブの再ドッキングにより結晶構造上のポーズが再現された一方、β-シトステロールとリノレイル酢酸は、COX-2ドッキング領域に対して中程度の予測適合性を示した。HBZY-1メサンギウム細胞において、β-シトステロールはLPS誘発性の炎症性遺伝子発現、COX-2量、およびPGE2産生を抑制し、さらにTGF-β1誘発性の線維化促進マーカーの発現を抑制した。これらの知見は、計算機による優先順位付けと細胞表現型を結びつけるものであるが、確定的な治療メカニズムではなく、候補となる調節関係を支持するものである。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。言語編集および概略図の予備設計の補助として、人工知能ベースのツール（ChatGPT, OpenAI）が使用されました。図1Aおよび図7の予備的なグラフィカルドラフトの作成に生成AIが使用され、その後、報告された方法および結果との整合性を確保するために著者によってレビューおよび修正が行われました。AIによるすべての出力は、著者によって厳格に評価され、承認されました。著者は最終的な図の内容を確認し、原稿の完全性と正確性について全責任を負います。

謝辞

本研究は、中西医結合腎病特性専門科（ZYTSZK2-3）および、慢性疾患管理の視点から見た慢性腎臓病に対する中医学的介入戦略の研究（202240169）からの支援を受けて行われました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
絶対エタノールSigma-Aldrich/MerckE7023200 proof、非変性分子生物学グレードエタノール。β-シトステロールストック溶液用溶媒。
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2分子ドッキングシミュレーション
バイオセーフティキャビネットThermo Fisher Scientific1300 Series A2無菌的な細胞培養操作
セレコキシブMedChemExpressHY-14398陽性対照として使用した選択的COX-2阻害剤。DMSOを用いた10 mMストック溶液。  
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04細胞生存率測定用のWST-8比色アッセイ。450 nmで吸光度を測定。
化学発光イメージングシステムBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPウェスタンブロット画像の取得
clusterProfiler RパッケージBioconductorVersion 4.10.0GOおよびKEGG濃縮分析
CO2細胞培養インキュベーターThermo Fisher ScientificForma Series II 311137 °C、5% CO2での細胞培養インキュベーション
COX-2 (D5H5) ウサギモノクローナル抗体Cell Signaling Technology12282ヒト、マウス、ラットのCOX-2で検証済みのウェスタンブロット用抗体。1:1,000で希釈して使用。
CytoNCAプラグインCytoscape App StoreVersion 2.1.6ハブターゲットのトポロジー分析
CytoscapeソフトウェアCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0ネットワークの可視化および分析
ジメチルスルホキシドSigma-Aldrich/MerckD2650滅菌ろ過済みBioReagent、≥99.7%。セレコキシブストック溶液用溶媒。
DisGeNETデータベースIntegrative Biomedical Informatics GroupNot applicable糸球体腎炎の疾患-遺伝子検索
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTHBZY-1細胞培養用基礎培地
高感度化学発光基質Beyotime BiotechnologyP0018Sウェスタンブロットバンドの可視化
胎児牛血清Gibco/Thermo Fisher Scientific10099-141C細胞培養用血清サプリメント
GAPDH (D16H11) ウサギモノクローナル抗体Cell Signaling Technology5174ウェスタンブロット用ローディングコントロール。ヒト、マウス、ラットのGAPDHに反応。内部最適化後、1:5,000で希釈して使用。
GeneCardsデータベースWeizmann Institute of ScienceNA糸球体腎炎関連遺伝子の検索
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121in vitro実験データの統計分析
HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体Proteintech GroupSA00001-2ウサギ一次抗体用二次抗体
ImageJソフトウェアNational Institutes of HealthVersion 1.54ウェスタンブロットのデンシトメトリー分析
倒立位相差顕微鏡OlympusCKX53細胞形態の観察
org.Hs.eg.db RパッケージBioconductorVersion 3.18.0濃縮分析用のヒト遺伝子アノテーション
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液Gibco/Thermo Fisher Scientific15140122細胞培養用抗生物質サプリメント
PGE2 パラメーターアッセイキットR&D Systems, a Bio-Techne brandKGE004B細胞培養上清用複数種対応競合ELISA。アッセイ範囲 39–2,500 pg/mL。450 nmで比色検出。
PharmGKBデータベースPharmacogenomics KnowledgebaseNA疾患関連ターゲットの検索
PubChemデータベースNational Center for Biotechnology InformationNAリガンド構造の検索
PVDF膜Millipore/MerckIPVH00010ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜
PyMOL分子グラフィックスシステムSchrödinger, LLCVersion 2.6.2ドッキングポーズの可視化
RソフトウェアR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2ターゲットの共通部分および濃縮分析
ラット糸球体メサンギウム細胞株 (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117in vitroメサンギウム細胞検証モデル
RCSB Protein Data BankResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1PTGS2/COX2結晶構造の検索
リコンビナントヒトTGF-β1タンパク質PeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand100-21-10UGHEK293由来リコンビナントヒトTGF-β1。10 ng/mLで線維化促進刺激。  
SDS-PAGE電気泳動システムBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSDS-PAGEによるタンパク質分離
STRINGデータベースELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築
TCMSPデータベースTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNA冬虫夏草（Cordyceps sinensis）の候補化合物のスクリーニング
Therapeutic Target DatabaseInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNA治療ターゲットの検索
α-SMA一次抗体Proteintech Group14395-1-APα-SMAタンパク質発現の検出
β-シトステロール (純度 >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5。細胞処理に使用した定義化合物。絶対エタノールを用いた10 mMストック溶液。  

参考文献

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

β-シトステロールネットワーク薬理学分子ドッキングCOX-2阻害炎症経路前線維化活性化冬虫夏草タンパク質相互作用解析
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。