慢性糸球腎炎に関連する炎症および線維化メサンギウム細胞モデルにおけるβ-シトステロールのネットワークガイド評価

サマリー

本研究では、ネットワーク薬理学、検証済み分子ドッキング、およびin vitro実験を統合し、Cordyceps sinensisの構成成分と慢性糸球体腎炎に関連するプロセスの間の候補化合物と標的の相互関係を評価した。化合物レベルの検証のためにβ-Sitosterolが選定され、メサンギウム細胞モデルにおいて炎症および線維化促進性の活性化を減弱させることが明らかになった。

要約

慢性糸球体腎炎（CGN）は、持続的な炎症性損傷と進行性の線維化リモデリングを特徴としていますが、天然物ベースの介入の根拠となる化合物-標的関係はまだ十分に定義されていません。本研究では、ネットワーク薬理学、検証済みの分子ドッキング、およびin vitro 実験を統合し、CGN関連の病理学的プロセスにおける冬虫夏草（Cordyceps sinensis、C. sinensis）の候補成分を評価しました。C. sinensisの候補成分をスクリーニングし、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platformから得られた化合物関連標的とCGN関連遺伝子の共通項目を抽出しました。機能濃縮分析およびタンパク質-タンパク質相互作用分析を用いて、生物学的プロセスとハブ標的を優先順位付けしました。その結果、PTGS2が重要な共通標的として同定されました。分子ドッキングは、セレコキシブが結合したCOX-2構造を用いて行われました。共結晶化したセレコキシブリガンドの再ドッキングでは、RMSD 0.876 Åで結晶学的ポーズが再現され、ドッキングプロトコルの妥当性が支持されました。β-シトステロールとリノレイル酢酸は、それぞれ−7.2および−7.5 kcal/molの結合親和性を示し、COX-2ドッキング領域との適合性が予測されました。HBZY-1ラット糸球体メサンギウム細胞における化合物レベルの検証には、β-シトステロールが選択されました。0.5–10 µMの濃度において、β-シトステロールは細胞生存能を著しく低下させませんでした。リポ多糖（LPS）刺激細胞において、β-シトステロールはTnf、Il6、およびPtgs2の発現を抑制し、プロスタグランジンE2（PGE2）の産生を減少させ、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）タンパク質の存在量を減少させました。形質転換増殖因子β1（TGF-β1）処理細胞において、β-シトステロールはCol1a1およびActa2の発現を抑制し、α-スムーズムスリンアクチン（α-SMA）タンパク質の存在量を減少させました。これらの知見は、β-シトステロールがメサンギウム細胞モデルにおける炎症性および前線維化性の活性化を調節するという仮説を生成する根拠を提供しますが、COX-2の直接的な酵素阻害やCGNにおける治療有効性を立証するものではありません。

概要

慢性糸球体腎炎（CGN）は、慢性腎臓病および末期腎不全へと進行し得る、不均一な糸球体疾患のグループで構成されています¹。それは、持続的な糸球体損傷、炎症性活性化、および進行性の線維化リモデリングを特徴とします^2,3。選択された患者には副腎皮質ステロイドや免疫抑制剤が使用されますが、多くの場合で長期的な疾患コントロールは困難であり、治療に関連する副作用も一般的です^1,4,5。CGNの進行には、免疫活性化、内皮機能不全、酸化ストレス、および細胞外マトリックスの蓄積を含む、相互に作用する病理学的プロセスが関与しています^3,6,7。したがって、炎症反応と前線維化反応をつなぐ分子ノードを特定することは、疾患に関連する介入戦略のための検証可能な仮説を構築するのに役立つ可能性があります。

Cordyceps sinensis (C.....

プロトコル

ネットワーク薬理学およびバイオインフォマティクス解析は、公開データベースに基づいて行われ、ヒト参加者または動物は関与していません。in vitro実験は、既知の細胞株を用いて実施され、施設上の要件に従い、倫理委員会の承認は必要ありませんでした。

候補成分のスクリーニングおよび標的の回収

2025年7月13日に、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)において、検索キーワード「dongchongxiacao」を用いて候補成分およびそれらに対応する標的を抽出した。予測経口バイオアベイラビリティが30%以上、かつドラッグライクネスが0.18以上の化合物を保持した。その結果、7つの候補成分が両方のスクリーニング基準を満たした。記述的な比較を行うため、分子量、経口バイオアベイラビリティ、ドラッグライクネス、およびその他の利用可能な薬物動態記述子をTCMSPから記録した。

抽出された成分に関連する化合物-ターゲット情報は、TCMSPから直接ダウンロードした。非冗長なターゲットセットを構築する際、重複するターゲットエントリを手動で削除したが、その後のネットワーク構築のために元の化合物-ターゲット関係....

結果

候補成分のスクリーニング、ターゲットの抽出、およびターゲットの共通項の特定

候補となる化合物と疾患の共通ターゲットを特定するためのワークフローをFigure 1Aにまとめる。OB ≥30%およびDL ≥0.18という事前定義されたスクリーニング基準を満たしたC. sinensisの7つの候補化合物は、アラキドン酸、リノレイル酢酸、β-シトステロール、ペロキシエルゴステロール、セレビステロール、パルミチン酸コレステリル、およびCLRであった（Table 2）。並行して、GeneCards、DisGeNET、PharmGKB、およびTTDから1,134個の糸球体腎炎関連遺伝子を取得し、4つのデータベースにおけるそれらの分布をFigure 1Bに示す。化合物関連ターゲットセットと疾患関連遺伝子セットの交差分析により、23個の共通ターゲットが特定された（Table 1, .......

ディスカッション

本研究では、ネットワーク薬理学、リファレンドリガンドで検証した分子ドッキング、および化合物レベルの実験を統合し、C. sinensisの候補成分から導出されたPTGS2関連の仮説を検討した。7つの成分が事前に定義されたTCMSPスクリーニング基準を満たし、23個のターゲットが糸球腎炎関連の遺伝子セットと重複した。タンパク質相互作用解析により9つの中心的なターゲットが優先的に抽出され、その中からPTGS2がドッキングおよび実験的評価の対象として選定された。セレコキシブの再ドッキングにより結晶構造上のポーズが再現された一方、β-シトステロールとリノレイル酢酸は、COX-2ドッキング領域に対して中程度の予測適合性を示した。HBZY-1メサンギウム細胞において、β-シトステロールはLPS誘発性の炎症性遺伝子発現、COX-2量、およびPGE2産生を抑制し、さらにTGF-β1誘発性の線維化促進マーカーの発現を抑制した。これらの知見は、計算機による優先順位付けと細胞表現型を結びつけるものであるが、確定的な治療メカニズムではなく、候補となる調節関係を支持するものである。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
絶対エタノール	Sigma-Aldrich/Merck	E7023	200 proof、非変性分子生物学グレードエタノール。β-シトステロールストック溶液用溶媒。
AutoDock Vina	Scripps Research	Version 1.1.2	分子ドッキングシミュレーション
バイオセーフティキャビネット	Thermo Fisher Scientific	1300 Series A2	無菌的な細胞培養操作
セレコキシブ	MedChemExpress	HY-14398	陽性対照として使用した選択的COX-2阻害剤。DMSOを用いた10 mMストック溶液。
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	CK04	細胞生存率測定用のWST-8比色アッセイ。450 nmで吸光度を測定。
化学発光イメージングシステム	Bio-Rad Laboratories	ChemiDoc MP	ウェスタンブロット画像の取得
clusterProfiler Rパッケージ	Bioconductor	Version 4.10.0	GOおよびKEGG濃縮分析
CO2細胞培養インキュベーター	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3111	37 °C、5% CO2での細胞培養インキュベーション
COX-2 (D5H5) ウサギモノクローナル抗体	Cell Signaling Technology	12282	ヒト、マウス、ラットのCOX-2で検証済みのウェスタンブロット用抗体。1:1,000で希釈して使用。
CytoNCAプラグイン	Cytoscape App Store	Version 2.1.6	ハブターゲットのトポロジー分析
Cytoscapeソフトウェア	Cytoscape Consortium	Version 3.8.0	ネットワークの可視化および分析
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich/Merck	D2650	滅菌ろ過済みBioReagent、≥99.7%。セレコキシブストック溶液用溶媒。
DisGeNETデータベース	Integrative Biomedical Informatics Group	Not applicable	糸球体腎炎の疾患-遺伝子検索
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	C11995500BT	HBZY-1細胞培養用基礎培地
高感度化学発光基質	Beyotime Biotechnology	P0018S	ウェスタンブロットバンドの可視化
胎児牛血清	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10099-141C	細胞培養用血清サプリメント
GAPDH (D16H11) ウサギモノクローナル抗体	Cell Signaling Technology	5174	ウェスタンブロット用ローディングコントロール。ヒト、マウス、ラットのGAPDHに反応。内部最適化後、1:5,000で希釈して使用。
GeneCardsデータベース	Weizmann Institute of Science	NA	糸球体腎炎関連遺伝子の検索
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.0.0.121	in vitro実験データの統計分析
HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体	Proteintech Group	SA00001-2	ウサギ一次抗体用二次抗体
ImageJソフトウェア	National Institutes of Health	Version 1.54	ウェスタンブロットのデンシトメトリー分析
倒立位相差顕微鏡	Olympus	CKX53	細胞形態の観察
org.Hs.eg.db Rパッケージ	Bioconductor	Version 3.18.0	濃縮分析用のヒト遺伝子アノテーション
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140122	細胞培養用抗生物質サプリメント
PGE2 パラメーターアッセイキット	R&D Systems, a Bio-Techne brand	KGE004B	細胞培養上清用複数種対応競合ELISA。アッセイ範囲 39–2,500 pg/mL。450 nmで比色検出。
PharmGKBデータベース	Pharmacogenomics Knowledgebase	NA	疾患関連ターゲットの検索
PubChemデータベース	National Center for Biotechnology Information	NA	リガンド構造の検索
PVDF膜	Millipore/Merck	IPVH00010	ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜
PyMOL分子グラフィックスシステム	Schrödinger, LLC	Version 2.6.2	ドッキングポーズの可視化
Rソフトウェア	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.3.2	ターゲットの共通部分および濃縮分析
ラット糸球体メサンギウム細胞株 (HBZY-1)	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0117	in vitroメサンギウム細胞検証モデル
RCSB Protein Data Bank	Research Collaboratory for Structural Bioinformatics	PDB ID: 3LN1	PTGS2/COX2結晶構造の検索
リコンビナントヒトTGF-β1タンパク質	PeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand	100-21-10UG	HEK293由来リコンビナントヒトTGF-β1。10 ng/mLで線維化促進刺激。
SDS-PAGE電気泳動システム	Bio-Rad Laboratories	Mini-PROTEAN Tetra	SDS-PAGEによるタンパク質分離
STRINGデータベース	ELIXIR/STRING Consortium	Version 12.0	タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの構築
TCMSPデータベース	Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database	NA	冬虫夏草（Cordyceps sinensis）の候補化合物のスクリーニング
Therapeutic Target Database	Innovative Drug Research and Bioinformatics Group	NA	治療ターゲットの検索
α-SMA一次抗体	Proteintech Group	14395-1-AP	α-SMAタンパク質発現の検出
β-シトステロール (純度 >98%)	MedChemExpress	HY-N0171A	CAS 83-46-5。細胞処理に使用した定義化合物。絶対エタノールを用いた10 mMストック溶液。