研究記事

in vitroにおける細胞毒性と薬物送達能を向上させたヒドロキシ尿素封入ナノ構造脂質キャリア

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DOI:

10.3791/73012

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2026年9月22日

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

この記事について

サマリー

本研究では、ヒドロキシ尿素を封入したナノ構造脂質キャリア（NLCs）を開発し、その特性およびin vitroにおける抗がん活性を評価した。NX-STは高い封入効率と徐放性を示し、遊離ヒドロキシ尿素（IC₅₀ = 72.57 µg/mL）と比較して、MCF-7細胞に対してより高い細胞毒性（IC₅₀ = 25 µg/mL）を示した。

要約

ヒドロキシ尿素（HU）は慢性骨髄性白血病の治療に使用される確立された抗がん剤であるが、その治療有効性は、迅速なクリアランス、バイオアベイラビリティの変動、および用量依存的な毒性によって制限されている。本研究では、異なる界面活性剤の組み合わせを用いて、ヒドロキシ尿素封入ナノ構造脂質キャリア（NLC）を開発することにより、HUの送達能を改善することを目的とした。NX-ST（Tween 80–SDS）、NX-CT（Cremophor EL–Tween 80）、およびNX-CS（Cremophor EL–SDS）を含む3つの製剤を調製し、粒子径、多分散指数（PDI）、ゼータ電位、封入効率（EE）、および細胞毒性活性を評価した。これらの製剤は、ナノスケールの粒子径（67.37から10 nm）、許容可能なPDI（<0.35）、高いゼータ電位（-30.03から-46.43 mV）、および良好な封入効率（78.189から86.626%）を示し、安定した製剤であることが示された。放出プロファイルでは、0.5–6 hの期間にわたってほぼ線形に増加し、その後プラトーに達した。細胞毒性試験では、遊離HU（IC₅₀ = 72.57 µg/mL）と比較して抗がん活性の向上が認められた。製剤NX-STは、薬物送達の向上と一致して、最高の細胞毒性（IC₅₀ = 25 ± 21.47 µg/mL）を示した。細胞取り込みの改善による寄与が推察されるが、本研究では直接的に測定は行っていない。検討したNLC製剤、特にNX-STは、安定性、送達効率、および抗がん活性を改善することで、HUの治療性能を効果的に向上させた。

概要

がんは世界的に主要な死因の一つであり、202年には約2,0万人の新規症例と970万人のがん関連死亡者が記録されました。2040年までにこれらの数値は大幅に増加し、年間2,90万人の新規症例と1,530万人のがん関連死亡者に達すると予測されています1,2。現在の多くの抗がん剤治療法は毒性の強い化合物に依存していますが、その全身毒性により、がん組織に効果的に到達できる治療濃度が制限されています3。この課題を克服するため、研究者は腫瘍への標的性を高め、化学療法の治療指数を改善するための新しい薬物送達アプローチを模索しています。

腫瘍学研究における極めて重要な領域の一つは、抗がん剤の副作用を最小限に抑えつつ治療効果を高めるための、高度な薬剤輸送システムの開発です。確立された化学療法剤および抗腫瘍剤であるヒドロキシウレア（HU）は、胎児性ヘモグロビンの産生を増加させ、リボヌクレオチド還元酵素を標的としてDNA合成を阻害する能力を持つため、鎌状赤血球症、慢性骨髄性白血病、および特定の固形腫瘍の管理における基盤となってきました4,5。その臨床的有効性にもかかわらず、HUの治療上の可能性は、急速なクリアランス、バイオアベイラビリティの変動、および狭い治療係数といった課題によって制限されており、これらはしば薬物動態のばらつきや、骨髄抑制、胃腸障害、潜在的な二次性悪性腫瘍などの用量依存的な毒性を引き起こします6,7。これらの制限を解消するため、ナノ構造脂質キャリア（NLCs）を含む高度な薬剤輸送システムが、ヒドロキシウレアの安定性、溶解性、および放出制御を向上させ、それによって安全性と有効性のプロファイルを改善するための有望な戦略として登場しています8。

NLCsは、従来の薬物輸送システムと比較して多くの利点を持つ脂質ベースのナノ粒子の一種です。NLCsは、界面活性剤によって安定化された固体脂質マトリックスで構成されており、親水性薬物と親油性薬物の両方を封入することが可能です。この独自の構造により、薬物担持能の向上、徐放性の制御、および安定性の強化が実現します9,10。NLCsの調製には通常、高圧ホモジナイゼーションや超音波処理などの技術が用いられ、これにより粒度分布が狭く封入効率の高いナノ粒子の形成が促進されます1,12。NLCsへの薬物の封入は、薬物の溶解性と安定性を高めるだけでなく、がん細胞への標的輸送を促進し、これによりオフターゲット効果を最小限に抑えます。近年の研究では、薬物封入NLCsが、薬物の治療係数および徐放プロファイルを改善させる可能性が示されています13,9。この制御放出メカニズムは、長期間にわたって治療有効濃度を維持するために極めて重要であり、それによって投与回数を減らし、患者のコンプライアンスを向上させます14。gefitinib15、capecitabine16、およびimatinib14などの抗がん剤を封入したNLCsは、がん細胞への細胞内取り込みと蓄積を改善することにより、薬物 efficacy を有意に高めることが実証されています。例えば、gefitinib封入NLCsは、遊離薬物と比較してがん細胞に対する細胞毒性が4.5倍に増加しており、非小細胞肺がんおよび大腸がんの治療に用いられるチロシンキナーゼ阻害剤の治療係数を向上させるNLCsの可能性を強調しています。同様に、capecitabine封入NLCsは薬物の安定性と制御放出を改善し、これは治療濃度の維持と全身毒性の軽減において重要です。imatinib封入NLCsも標的輸送の強化による恩恵を受け、それによってオフターゲット効果を軽減し、慢性骨髄性白血病の治療における患者の転帰を改善します。これらの特性により、NLCsは臨床試験の強力な候補となり、個々の患者のプロファイルに合わせて治療を調整する個別化医療への応用の可能性があります。薬物封入NLCsの安定性評価は、臨床適用性に影響を与えるもう一つの重要な側面です。安定性試験では、製剤をさまざまな環境条件下にさらし、経時的な物理的完全性を評価することが一般的です。

加速安定性試験により、これらのNLCは構造的完全性と薬物含有量を長期間維持することが示されており、長期保存および使用への可能性が強調されている4,17。

これらの利点がある一方で、界面活性剤の選択はナノ構造脂質キャリア（NLCs）の物理化学的特性および性能に大きな影響を及ぼします。脂質-界面活性剤系は、ナノ粒子の安定性、薬物の封入率、およびバイオアベイラビリティの向上において重要な役割を果たします18,19,20。しかし、異なる界面活性剤の組み合わせがヒドロキシ尿素封入NLCsの物理化学的特性および細胞毒性活性にどのように影響するかを調査した研究は限られています。そこで本研究では、異なる界面活性剤系を用いてヒドロキシ尿素封入NLCs（NANOXURIA）を開発し、これらの変動が物理化学的安定性、保存挙動、および抗腫瘍活性にどのように影響するかを系統的に評価することを目的としました。製剤設計と治療性能の間の明確な関係を確立することにより、本研究は、ヒドロキシ尿素封入NLC製剤を特性評価し、そのin vitroでの薬物放出、細胞毒性、および短期保存安定性を評価するための効果的なナノキャリアベースの分散系（コロイド分散系）を提供することを目指しています。これにより、薬物分子自体を変更することなく、将来的なHUデリバリー開発に資する基礎的な物理化学的およびin vitro性能データを生成します。

プロトコル

本研究では、ヒト被験者、ヒト由来組織、または生存動物は使用していません。すべての生物学的評価は、American Type Culture Collection (ATCC) から入手した市販のMCF-7ヒト乳がん細胞株を用いてin vitroで実施されました。したがって、本研究において機関審査委員会（IRB）または倫理委員会の承認は適用されませんでした。

材料

ヒドロキシウレア (HU) (純度 ≥99%)、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) (アニオン性、純度 90%)、Tween-80 (T80) (非イオン性、オレイン酸 ≥58%)、Cremophor EL (非イオン性、ヒマシ油由来、純度 ≥98%)、ステアリン酸 (純度 95–106%)、およびゴマ油をそのまま使用した。その他の使用したすべての化学物質および試薬は分析グレードのものを用いた。すべての材料および機器の詳細なサプライヤーおよびカタログ番号は、材料表に記載されている。

ヒドロキシウレア封入NLC（NANOXURIA）の調製

NANOXURIAの調製は、脂質相の調製、薬物の組み込み、および水相の調製の3つのステップで構成される。脂質相は、ステアリン酸（50 mg）とゴマ油（250 µl）の混合物を融解させて得た。この融解操作は、ホットプレート上のビーカー内で行った。正確に計量したHU（150 mg）を脂質相に混合した。水相は、界面活性剤（Table 1）を水（Millipore）（25 mL）に溶解させて調製した。早すぎる凝固を防ぐため、界面活性剤溶液を脂質相と同じ温度（70°C）まで加熱した。加熱した水相を、ホモジナイザーで高速攪拌しながら、融解した脂質相に徐々に添加した。混合物を高速（6,0 rpm）で20分間ホモジナイズし、安定した熱乳剤を作成した。この熱乳剤を、連続的に攪拌しながら室温まで冷却した。冷却過程で脂質相が凝固し、NLCが形成される。調製したHU担持NLCは、その後の特性評価および応用のために保存した。

特性解析および評価

粒子径、ゼータ電位 (ZP)、および多分散指数 (PDI)

NANOXURIAの粒子径解析および多分散指数（PDI）は、Zetasizer Nano ZS90を用いて測定した。本装置は動的光散乱法（DLS）の原理に基づいて動作し、懸濁液中の粒子のブラウン運動を測定し、ストークス-アインシュタイン式を介してその流体力学的直径を算出する。粒子径とPDIに加え、同装置を用いてゼータ電位（ZP）を測定し、NANOXURIAの表面電荷を評価した。ゼータ電位は電気泳動光散乱法（ELS）を用いて決定し、印加電場における粒子の速度を解析して表面電荷を算出した。このパラメータは、NANOXURIAのコロイド安定性を評価する上で極めて重要である。測定は制御された環境下で実施し、装置の光学的な要求事項および電気的な要求事項への適合性を確保するため、希釈したサンプルをキュベットに入れた。結果の堅牢性と再現性を高めるため、すべての測定は3回繰り返し（n=3）で行った。

形態学

NANOXURIAの形態は、透過モードと走査モードの両方で作動する電子顕微鏡を用いて検討した。内部構造および粒子形状の観察には透過電子顕微鏡（TEM）を用い、電界放出形走査電子顕微鏡は 表面形態および粒子分布を調べるために、電界放射型走査電子顕微鏡（FE-SEM）を用いた。高解像度画像を得るため、試料を適切に調製し、適切な加速電圧で分析した。試料調製において、NANOXURIA分散液を純水で希釈した。TEMでは、希釈した分散液を1滴カーボンコート銅グリッド上に滴下し、余剰分を吸い取った後、室温で自然乾燥させ、加速電圧60～80 kVの高真空下で撮像した。FE-SEMでは、希釈した分散液を1滴アルミニウムスタブ上に載せて自然乾燥させ、導電性の薄い層でスパッタコーティングを施した後、1～3 kVで撮像した。異なる倍率で代表的な顕微鏡写真を撮影した。

NANOXURIA処方の封入効率分析

NANOXURIAの封入効率（EE）は、Amicon Ultra-2 mL遠心フィルター（3 kDa MWCO）を用いた限外ろ過遠心法により評価しました。この方法では、25 °Cで20分間、4,0 x gで遠心分離を行うことで、封入されていないHU（NANOXURIA 1 mL中に約6 mg）を封入画分から分離し、効果的な単離を行いました。遊離HUを含むろ液を精製水で希釈し、Beer-Lambertの法則に基づく検量線を用いて、UV-Vis分光度計で213 nmにて分析し、未封入の薬物量を定量しました。% EEは以下のように算出しました。

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in vitro 放出試験

NANOXURIAからのHUのin vitro放出プロファイルは、制御放出薬物の評価に広く採用されている透析袋拡散法を用いて評価した。透析袋（12–14 kDa MWCO）を蒸留水に12時間浸漬し、適切に水和させ、保存剤を除去した。透析袋の一端をしっかりと封止し、HU 12 mgに相当するNANOXURIA製剤2 mLを袋の中に慎重に注入した。その後、漏れを防ぐためにもう一端をきつく結んだ。この透析袋を、放出媒体として水（50 mL）を入れたビーカーに浸漬させた。装置は体温を模して37 ± 0.5 °Cに維持し、均一な混合を確保して境界層効果を最小限に抑えるため、マグネチックスターラーを用いて50 rpmで撹拌した。あらかじめ定めた時間間隔（0.5, 1, 2, 4, 6, 12, および 24 h）で、放出媒体から2 mL分を分注して採取し、シンク条件を維持するために、直ちに同量のあらかじめ加温した新鮮な水と交換した。採取したサンプルは、分析時の透明性を確保するため、0.45 µmのシリンジフィルターでろ過して粒子状物質を除去した。メンブレンフィルターは粒子を保持し、溶解したHUを透過させる。HUは水溶性であるため、遊離薬物はろ液中に残り、保持された物質が遊離薬物ではなく粒子であることを担保した。ろ過後のサンプルを、HUの最大吸収波長（λmax）である213 nmのUV-vis分光度計を用いて分析し、HU含有量を測定した。HU濃度を正確に定量するために検量線を作成した。

細胞培養

本研究では、American Type Culture Collection (ATCC) から入手した転移性ヒト乳がん細胞株 MCF-7 を使用した。細胞の増殖と生存率を維持するため、10% fetal bovine serum (FBS) を添加した RPMI 1640 培地を用いて維持し、培養中の微生物汚染を防ぐために 1% penicillin–streptomycin 溶液を添加した。その後、細胞を 37 °C の加湿 CO₂ インキュベーター内という標準的な生理学的条件下で、培養液の pH を 7.4 に維持してインキュベートした。これらの条件は、細胞毒性試験全体を通じて、細胞の最適な増殖、増殖能、および実験の信頼性を確保するために選択された。

細胞生存率アッセイ（MTT）

異なるNANOXURIA製剤の細胞死誘導能を評価するため、MTTアッセイを実施した16,21。簡潔に述べると、MCF-7細胞を1 x 104 cells/mLの密度で96ウェルプレートに播種し、細胞を適切に接着・増殖させるため、CO₂インキュベーター内で24時間インキュベートした。未処理の細胞を陰性対照とし、培地のみを含むウェルをブランク対照とした。インキュベーション後、培養液を最大20 µg/mLの異なる濃度の試験製剤を含む新鮮な培地で置換した。処理したプレートを、標準的な培養条件下でさらに72時間インキュベートした。処理後、各ウェルに20 µLのMTT試薬（5 mg/mL）を加え、代謝活性のある細胞内でホルマザン結晶が形成されるよう、さらに4時間インキュベートした。その後、10 µLのジメチルスルホキシド（DMSO）を加えて結晶を溶解させ、紫色溶液を得た。吸光度をマイクロプレートリーダー（SpectroStar Nano）を用いて570 nmで測定した。得られた吸光度を用い、未処理の対照群に対する相対値として細胞生存率（%）を算出した。

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安定性試験

長期使用への適応性を評価するため、制御された保存条件下で3ヶ月間にわたりNANOXURIAの安定性を体系的に評価した。光および水分への曝露を最小限に抑えるため、各NANOXURIA製剤を気密性の高い遮光ガラス容器に分注した。容器は、25 ± 2 °Cの一定室温および4 ± 2 °Cの冷蔵温度で保存した。あらかじめ設定した間隔（1、2、3ヶ月）で、物理的および物理化学的な安定性を定期的に評価した。調製直後かつ保存前の測定値をベースラインとし、これを0ヶ月（初期値）とした。物理的評価では、凝集、沈殿、相分離、色の変化（例：オフホワイトから黄色へ）、稠度の変化（例：粘度やテクスチャー）、および臭気（例：脂質酸化による酸敗）を含む外観の変化を視覚的に検査した。物理化学的安定性については、粒子径、多分散指数（PDI）、およびゼータ電位（ZP）を含む主要な特性パラメータを測定した。

統計解析

本研究では、すべての実験結果を平均値として表記します。 ± データの中心傾向とばらつきを示すため、標準偏差（SD）（n = 3）を用いています。製剤の評価には対応のあるt検定を、製剤間の差の比較には一元配置分散分析（ANOVA）およびそれに続くTukeyの多重比較検定を用いて統計解析を行いました。p値 < 0.05を統計的有意差ありとみなした。統計解析にはGraphPad Prism version 10を用いた。

結果

物理化学的特性

粒子径、多分散指数（PDI）、ゼータ電位（ZP）、形態、および封入効率（EE）を含むNANOXURIA製剤の物理化学的特性を表2に示す。TEMおよびSEMによる形態評価を、粒子径およびゼータ電位の分布グラフで補完したものを図1、2、および3に示す。異なる界面活性剤の組み合わせにおけるPDIの比較を図4に示す。

放出試験

NANOXURIA製剤のin vitro放出試験を実施し、製剤間の違いが24時間における薬物放出プロファイルにどのような影響を及ぼすかを評価した（図5）。NX-CSは最も速い放出を示し、0.5時間後に5.90%から始まり、24時間後には104.05%に達した（値 >10%という数値は、実験的なばらつき、あるいはわずかな過大評価を伴う完全な放出を反映している可能性があります）。放出プロファイルは、0.5時間から6時間までほぼ直線的に増加し、その後プラトーに達しました。NX-CTは最も緩やかで制御された放出を示し、0.5時間時点で46.18%から始まり、24時間後には82.9%に達しました。また、2〜12時間の間（54.51%から59.38%）にプラトーが見られ、その後再び増加しました。NX-STは中間の放出プロファイルを示し、0.5時間時点で54.05%から始まり、12時間後に90.63%でピークに達し、24時間後には86.23%までわずかに減少しました。全体として、累積放出量は以下の順となりました：NX-CS > NX-ST > NX-CT。NX-CSおよびNX-STはより強い初期バースト放出を示したが、NX-CTは放出の遅延を示した。放出速度論により、NX-CSは急速放出、NX-CTは持続放出、そしてNX-STは二相性放出であることが示された。

細胞毒性試験

定冠詞（The） in vitro 〜の細胞毒性 ナノ尿症 MTTアッセイを用いて、MCF-7乳がん細胞に対する各製剤の評価を行い、 表3 ～について詳述する 内部対照₅₀ 値。NX-STが最も高い細胞毒性を示し、推定IC₅₀ 25件中 ± 21.47 µg/mL （外挿値）であり、優れた抗がん活性を示している。対照的に、NX-CSおよびNX-CTはより低い細胞毒性を示し、IC₅₀ 超過する値 300 µg/mL遊離ヒドロキシ尿素（HU）が最も低い細胞毒性を示し、IC₅₀ の 722.57 µg/mLICが₅₀ NX-CSおよびNX-CTの値は、検出限界を超えていることのみが報告された 300 µg/mL、それらの相互の細胞毒性および遊離HUに対する細胞毒性（722.57 µg/mL)を現在のデータから確定することはできず、遊離HUよりも細胞毒性が高いと確実に順位付けできたのはNX-STのみであった。これらの結果は、NLC製剤が遊離薬と比較してHUの抗がん活性を著しく向上させることを示している。

物理化学的パラメータと細胞毒性の統計的相関

検討したすべてのパラメータの相関を図6に示す。統計解析の結果、HU搭載NLC（NX-ST、NX-CT、NX-CS）間で、ゼータ電位、封入効率（EE）、および細胞毒性（IC₅₀）に有意な差が認められたが [F(2,12) = 6.45, p = 0.014]、粒子径およびPDIに有意差は認められなかった [F(2,12) = 1.27, p = 0.31]。NX-STは中程度のEEで最適な細胞毒性を示した一方、NX-CSおよびNX-CTはより高いEEを示したが細胞毒性は弱かった。探索的な相関解析のため、テストした濃度範囲の上限（>30 µg/mL）を超えるIC50値には30 µg/mLの値を割り当てた。探索的なSpearman相関解析により、ゼータ電位とIC₅₀との間に正の相関が認められた（ρ = 0.86, p = 0.3）。したがって、ゼータ電位の負の電荷が小さい処方ほどIC₅₀値が高くなる傾向にあり、より負に帯電したNX-ST処方がより高い細胞毒性活性を示した。

安定性試験

粒子径の安定性

25 °Cにおいて、すべてのNANOXURIA製剤の粒子径は3ヶ月の保存期間中に増大し、それぞれ異なる傾向を示した（図 7）。NX-STは、1ヶ月時点で10 nmであり、最初の2ヶ月間（106.4 nm）は比較的安定していたが、3ヶ月目までに150.6 nmに増大した。NX-CTは、初期値の91.9 nmから2ヶ月で102.2 nmへと緩やかに増加し、その後3ヶ月目で168.3 nmへと急激に上昇した。NX-CSは最も大きな変化を示し、初期の67.3 nmから3ヶ月目までに171.06 nmへと増大した。全体として、25 °Cではすべての製剤で粒子径の増大が認められ、その増加幅はNX-CS > NX-CT > NX-STの順であった。

4 °CにおけるNANOXURIA製剤は、25 °Cと比較して安定性が向上しており、3ヶ月間の保存期間における粒子径の増加がより小さかった（図 7）。NX-STは相対的な安定性を維持し、粒子径は1ヶ月後に10 nm、2ヶ月後に102 nm、3ヶ月後に120.96 nmであった。NX-CTは、粒子径が1ヶ月後の91.9 nmから2ヶ月後には16.7 nm、3ヶ月後には128.5 nmへと緩やかに増加した。NX-CSは最も変動が少なく、初期の67.3 nmから2ヶ月後には74.75 nm、3ヶ月後には89.3 nmへと増加した。全体として、4 °Cにおける粒子径の増加傾向はNX-CT > NX-ST > NX-CSであり、冷蔵条件下で安定性が向上していることが示された。

PDIの安定性

25 °Cにおいて、NANOXURIA製剤のPDIは3か月間の保存期間中、異なる傾向を示した（図 8）。NX-STは研究期間を通じて比較的安定したPDI値を維持し、粒子径分布が一定であることを示した。NX-CTは2か月目にPDIの上昇（0.342）が見られ、その後3か月目までに0.248へと低下した。NX-CSは時間の経過とともにPDIが漸増し、粒子径の均一性が徐々に失われていることが示された。全体として、NX-STが最も安定した分布を示し、NX-CTは一時的な変動を示し、NX-CSは不均一性の増大を示した。

4 °Cにおいて、NANOXURIA製剤のPDIは3か月間の保存期間を通じて異なる傾向を示した（図8）。NX-STは比較的安定したPDI値を示し、1か月目の0.347から2か月目には0.269に減少し、その後3か月目には0.349にわずかに増加した。NX-CTは、PDIが1か月目の0.21から3か月目の0.31へと段階的に増加しており、粒子の均一性が徐々に失われていることが示された。NX-CSも時間の経過とともにPDIの上昇傾向を示し、均質性の低下が認められた。全体として、NX-STが最も安定した分布を維持した一方、NX-CTおよびNX-CSでは不均一性が増大した。

ゼータ電位安定性

25 °Cにおいて、NANOXURIA処方のゼータ電位（ZP）は、3か月間の保存期間を通じて明確な傾向を示した（図9）。NX-STは、1か月目に−46.43 mVの初期ZPを示し、2か月目には−39.37 mVまで低下し、3か月目までには−52.3 mVに上昇した。NX-CTは、負の値が緩やかに増加し、1か月目の−30.76 mVから2か月目には−35.6 mV、3か月目には−37.13 mVへと変化した。NX-CSは、ZPの負の値が増加し、初期の−30.03 mVから2か月目で−39.6 mV、3か月目で−52.47 mVとなった。全体として、すべての処方で時間の経過とともにZP値が低下し、NX-STおよびNX-CSはNX-CTよりも大きな絶対値を示した。

4 °Cにおいて、NANOXURIA製剤のゼータ電位（ZP）は、3か月間の保存期間を通じて明確な傾向を示しました（図 9）。NX-STは、研究期間を通じて一貫して高い負のZP値を維持しました。NX-CTは、ZPの負の値が緩やかに増加し、当初の−30.76 mVから3か月目までにわずかに負に大きくなりました。NX-CSは、ZPの負の値が当初の−30.03 mVから3か月後には−28.8 mVへとわずかに減少しました。

データの利用可能性：

本研究の結果を裏付けるデータは本論文内で利用可能です。本研究で生成および解析された生のデータセットは、補足ファイルで提供されています。

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図 1: NX-STの形態学的および物理化学的特性解析。(A) 走査型電子顕微鏡（SEM）像。(B) 透過型電子顕微鏡（TEM）像。 (C) 粒度分布 (108.3 nm; PDI = 0.36) (n = 1)。 (D) ゼータ電位分布 (−48.8 mV) (n = 1)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 2: NX-CT の形態学的および物理化学的特性評価。(A) SEM 画像。 (B) TEM 画像。 (C) 粒子径分布 (91.87 nm; PDI = 0.235) (n = 1)。 (D) ゼータ電位分布 (−31.3 mV) (n = 1)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 3: NX-CSの形態学的および物理化学的特性解析。(A>) SEM画像。 (B) TEM画像。 (C) 粒度分布 (74.72 nm; PDI = 0.24) (n = 1)。 (D) ゼータ電位分布 (−36.8 mV) (n = 1)。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 4: 異なる界面活性剤の組み合わせを用いたNANOXURIA製剤間におけるPDIの比較。NX-ST、NX-CT、およびNX-CS製剤のPDI値を示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 5: NANOXURIA製剤からのヒドロキシウレアのin vitro放出。NX-CS、NX-CT、およびNX-STからのヒドロキシウレアの累積放出量を24時間にわたって示している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6: NANOXURIA製剤間における物理化学的パラメータおよび細胞毒性の比較。NX-ST、NX-CS、およびNX-CTの粒子径、PDI、ゼータ電位（ZP）、封入効率（EE）、およびIC₅₀を比較したレーダーチャート。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 7: 保存温度および保存期間がNANOXURIAの粒子径に及ぼす影響。(A) 25 °Cで保存した際の粒子径。 (B) 4 °Cで保存した際の粒子径。 (C) 2ヶ月および3ヶ月時点における4 °Cと25 °Cの粒子径の比較。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 8: 保存温度および保存期間がNANOXURIAのPDIに及ぼす影響。(A) 25 °Cで保存した際のPDI。 (B) 4 °Cで保存した際のPDI。 (C) 2ヶ月および3ヶ月における4 °Cと25 °CのPDIの比較。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 9: NANOXURIA のゼータ電位に及ぼす保存温度および保存期間の影響。(A) 25 °C で保存した際のゼータ電位。 (B) 4 °C で保存した際のゼータ電位。 (C) 2 か月および 3 か月時点における 4 °C と 25 °C のゼータ電位の比較。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

処方Tween-80（µL)*ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) (mg)クレモフォール EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-CT50-100
NX-CS-50100
密度 (g/ml) = (1.07*, 1.05#)

表1：NANOXURIA製剤の界面活性剤組成。Tween-80、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、およびCremophor ELの量を調整し、NX-ST、NX-CT、およびNX-CS製剤を調製した。

処方粒子径 (d.nm) (n = 3) (± 標準偏差 (SD)PDI (n = 3) (± 標準偏差（SD）ZP (mV) (n = 3) (± 標準偏差 (SD) EE (%) (n = 3) (± 標準偏差 (SD)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

表2：NANOXURIA製剤の物理化学的特性評価。 25 °CにおけるNX-ST、NX-CT、およびNX-CSの粒子径、多分散指数（PDI）、ゼータ電位（ZP）、および封入効率（EE）。データは平均値 ± 標準偏差（n = 3）で示されている。

処方内部対照50 (µg/mL)内部対照50 (µM)
NX-ST225 ± 21.472960
NX-CS>300-
NX-CT>300-
ヒドロキシウレア722.579500

表3：NANOXURIA製剤および遊離ヒドロキシウレアのin vitro細胞毒性。MCF-7細胞に対するNX-ST、NX-CS、NX-CT、および遊離ヒドロキシウレア（HU）のIC₅₀値を、µg/mLおよびµMで表記。

補足ファイル1：ヒドロキシ尿素封入ナノ構造脂質キャリアの特性評価に関する生データおよび計算。このファイルには、粒子径、多分散指数、ゼータ電位、封入効率、薬物放出測定、および処方比較解析を含む、NX-ST、NX-CT、およびNX-CS処方の基礎となる実験データと計算が含まれています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

提案されるアプローチおよび主要な知見

本研究では、熱均質化法を用いてNANOXURIAを開発した。固形脂質としてステアリン酸を使用し、調製温度は約70 °Cに維持した。これはステアリン酸の融点（~69.3 °C）に近く、HUおよび界面活性剤への不必要な熱曝露を最小限に抑えつつ、脂質の完全な融解と効率的な均質化を確実にするためである22。界面活性剤系は、親水親油バランス（HLB）値、生体適合性、およびNLC調製への適性に基づいて選択した。予備的な製剤試験を行い、安定性と細胞適合性に悪影響を及ぼす可能性のある過剰な濃度を避けつつ、小さい粒子径と低いPDIを持つ安定なナノ分散液を生成する界面活性剤濃度を特定した。粒子径解析の前に、製剤を高純度水で適切に希釈し、粒子径および粒度分布の正確な測定を妨げる多重散乱効果を最小限に抑えた23。

3種類の処方（NX-ST、NX-CT、およびNX-CS）は、主に界面活性剤の組成において異なっていた。NX-STにはT80とSDSが含まれ、NX-CTにはCremophor ELとT80が含まれ、NX-CSにはCremophor ELとSDSが含まれていた。この処方戦略により、非イオン性およびイオン性界面活性剤、ならびにそれらの濃度が、HU封入NLCの物理化学的特性に及ぼす影響を評価することが可能となった。その結果、粒子径、PDI、ZP、EE、薬物放出挙動、および細胞毒性において処方間で明確な差が認められ、界面活性剤の選択がNLCの性能を決定する重要な要因であることが示された。

粒子径は製剤間で有意に異なり（p < 0.05）、NX-CS < NX-CT < NX-STの順であった。粒子径は、より小さい粒子がより大きな表面積を提供し、分散安定性、細胞相互作用、生体内分布、および薬物放出挙動に影響を与える可能性があるため、ナノキャリアの性能を決定する重要な要因となる24,25。NX-CSで最小の粒子が得られたことは、Cremophor ELの高い乳化効率と中程度のSDS濃度の組み合わせに関連している可能性がある。Cremophor ELは界面張力を低下させることでより小さな液滴の形成を促進し、一方でSDSは静電的な安定化に寄与する。NX-STと比較してNX-CSで用いたSDS濃度が低かったことは、高濃度SDSに伴う過剰な界面効果を引き起こすことなく、十分な界面安定化をもたらした可能性がある26,27,28。

NX-CTは中程度の粒子径を示しました。Cremophor ELとT80の組み合わせにより、界面および立体安定化特性を補完し合う2つの非イオン性界面活性剤が提供されます。Cremophor ELは強力な乳化に寄与し、T80は粒子の周囲に立体障壁を形成して合一を抑制することができます29,30,31。また、イオン性界面活性剤を含まないことで、粒子形成中の強力な電荷媒介相互作用を回避しています。対照的に、NX-STは最大の粒子径を示しました。SDSは強力な乳化界面活性剤ですが、NX-STにおける相対的に高い濃度が、界面環境および粒子の成長挙動を変化させた可能性があります。T80は立体安定化を提供しますが、T80と高濃度のSDSの複合的な影響により、NX-CSで達成されたものよりも乳化と安定化のバランスが不適切になったと考えられます。

形態学的研究により、ナノスケールの脂質キャリアの形成がさらに裏付けられました。SEMおよびTEMでは、主に球状またはほぼ球状の粒子が観察され、その形態はDLSで決定された粒子径とおおむね一致していました。SEMは乾燥した粒子を観察するのに対し、DLSは粒子に付随する水和層および界面活性剤層を含めた流体力学的直径を測定するため、顕微鏡測定値とDLS測定値の間に差異が生じることは予想されます。したがって、顕微鏡観察とDLSの結果を合わせることで、ナノスケールのNLCシステムの形成に成功したことが裏付けられました。

PDIは粒子集団の均一性に関する追加情報を提供した。NX-CTは最も狭い粒子径分布を示し、一方でNX-STは最も高い平均PDIを示した。NX-CSは中間的な平均PDIであったが、繰り返し測定間のばらつきが大きかった。特に、NX-CSの繰り返し測定値は、NX-STおよびNX-CTよりも製剤のばらつきが大きいことを示している。全体的なPDIの傾向はNX-CT < NX-CS < NX-STであったが、報告された差に統計的な有意性は認められなかった（p > 0.05）。NX-CTの比較的低いPDIは、Cremophor ELとT80によって提供される複合的な立体安定化に関連している可能性がある。両方の界面活性剤は非イオン性であり、強い静電相互作用を導入することなく粒子界面を安定化させることができる。Cremophor ELは乳化を促進し、T80は立体的な保護を提供するため、より均一な粒子集団が促進された可能性がある32,3。NX-STのより高いPDIは、より高いSDS濃度の影響を反映している可能性がある。SDSは静電反発を提供するが、界面活性剤濃度の変化はミセル化や界面組織をも変化させ、粒子径の不均一性に寄与する可能性がある34,35,36。NX-CSは中間的なPDI挙動を示し、これはCremophor ELとより低いSDS濃度の複合的な効果と一致していた37。

各製剤は表面電荷においても異なっていました。NX-STは、高いSDS濃度が存在することと一致して、最も高い負のZPを示し、次いでNX-CT、NX-CSの順でした。SDSはアニオン性界面活性剤であるため、SDS含有系の表面電荷がより負に大きくなることは予想されます。したがって、ZP値は、SDSがNLCの表面電荷に大きく寄与した一方で、非イオン性界面活性剤は主に立体安定化に寄与したことを示しています。ZPの傾向はNX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0.05)でした。しかし、これらの差異は界面活性剤の組成のみに起因するものではなく、残留遊離界面活性剤、イオン強度、および脂質-界面活性剤組織の変化も測定されるZPに影響を及ぼす可能性があります38,39,40.

封入効率は、HUの保持に対する組成の影響をさらに示す結果となりました。すべての処方で比較的高いEE（>75%）が示され、HUがNLCシステムに正常に組み込まれたことが示されました。EEはNX-CSが最も高く、次いでNX-CT、NX-STの順となり、処方間で有意な差が認められました（p < 0.05）。Cremophor ELが効率的な界面安定化と薬物保持に寄与したと考えられ、またNX-CSにおける適度なSDS濃度が、NX-STのような高濃度SDSに伴う潜在的な破壊的影響を与えることなく、さらなる安定化をもたらした可能性があります41,42,43。とはいえ、HUは親水性であるため、脂質マトリックス内に完全に溶解している可能性は低いです。その代わりに、HUは微分散した薬物として、あるいは脂質-水界面に結合して、あるいは不完全な脂質マトリックスや界面活性剤に富んだ界面領域内に収容されていると考えられます。

放出プロファイルは処方依存的な挙動を示し、24時間後のHUの累積放出量は、 NX-CS > NX-ST > NX-CT の順となりました。NX-CSは、初期のバースト放出に続いてプラトーに達するという比較的速い放出を示し、これは 一次速度論的な挙動と一致していました。一方、NX-CTは最も遅く制御された放出を示し、 零次速度論的な挙動に近似していました。また、NX-STは中間の 二相性の放出プロファイルを示しました。 この放出は、粒子表面および界面活性剤に富む界面領域からのHUの拡散に続き、脂質マトリックス中に封入された薬物のより緩やかな拡散によって制御されていると考えられます。NX-CSからの放出が速いのは、粒子径が小さく表面積が大きいこと、およびCremophor ELとSDSの複合的な効果に関連している可能性があり、SDSが界面の親水性を高め、Cremophor ELが薬物の可溶化を促進したと考えられます。 対照的に、NX-CTにおけるCremophor ELとT80の組み合わせは、より安定した界面障壁を提供し、初期の薬物拡散を制限してより持続的な放出をもたらした可能性があります。一方、NX-STは、SDSによる放出促進とT80による安定化という相反する影響により、中間の二相性パターンを示しました。 これらの解釈は、脂質マトリックスと放出媒体との間の相互作用を調整する界面活性剤の提案された役割と一致しています41,4,45,46,47,48。ベースラインの拡散挙動を確立するために放出媒体として水を使用しましたが、これは生物学的流体のイオン組成や生理学的条件を再現するものではありません。生理的緩衝液に含まれる電解質は、電気二重層、界面活性剤の組織化、粒子の凝集、および膜透過性を変化させ、放出速度論を修飾する可能性があります。

細胞毒性試験の結果から、遊離HUとNLC製剤との間に明確な差があることが示され、 最高のICを示す遊離HU₅₀ そして、NX-STが最大の細胞毒性活性を示した。 低IC50値₅₀ NLC製剤で観察された値は、脂質キャリアへのHUの組み込みが、MCF-7細胞に対するin vitro活性を変化させたことを示している。特にNX-STにおいて強い反応が見られたことは、その複合的な寄与を反映している可能性がある。 SDS/T80界面活性剤系、比較的高い負のゼータ電位、および中程度の二相性放出プロファイルであり、これらが相まって細胞界面における薬物利用能および放出されたHUへの細胞の経時的な曝露に影響を及ぼす可能性がある49,50興味深いことに、NX-CSの粒子径がより小さく、封入効率（EE）が高かったことは、細胞毒性の増大には結びつきませんでした。このことは、粒子径や薬剤の封入量だけで生物学的活性が決まるのではなく、細胞との相互作用、薬剤放出挙動、界面活性剤の影響、および薬剤の利用能などが複合的に反応に影響を及ぼす可能性があることを強調しています。51,52,53したがって、NX-CTおよびNX-CSの細胞毒性がNX-STよりも低いことは、単に製剤性能が劣っていると解釈されるべきではありません。特に、NX-CTが最も制御された放出を示したことは重要です。

保存安定性試験の結果、保存期間を通じてどの処方においても、目に見える凝集、沈殿、相分離、変色、粘度やテクスチャーの変化、あるいは異常臭や酸敗臭は観察されず、良好な物理的安定性が示されました 。 しかしながら、物理化学的安定性のデータからは、より詳細な差異が明らかになりました。25 °Cでは、粒子径および/またはPDIの増加がコロイド系の漸次的な変化を示しており、その程度と統計的有意性は処方によって異なっていました 。NX-STはSDSによる強い静電的寄与の恩恵を受けていた一方で、主にCremophor ELおよびT80による立体安定化に依存していたNX-CTは、粒子特性の変化に対してより高い感受性を示しました。NX-CSは、静電的安定化と立体安定化を併用していたにもかかわらず、保存中に変化が見られ、2つの安定化メカニズムの存在だけではNLC系の時間依存的な再構築を完全に防ぐことはできないことが示唆されました 。4 °Cでの保存は、分子運動の抑制と脂質構造変化の遅延と一致して、一般的に物理化学的な保存状態が良好となりました 。NX-CSは粒子径の安定性が比較的向上し、NX-STは比較的安定した特性を維持しました。それにもかかわらず、NX-CTではPDIの漸次的な変化が引き続き見られ、立体安定化のみでは長期保存に不十分である可能性が示されました 。保存中のZPの変化は、界面活性剤の脱離、脂質の再結晶化、およびHUに関連する構造変化に起因する可能性がある、脂質-界面活性剤界面の時間依存的な再編成をさらに示唆していますが、これらは直接的に立証されたものではありません47,48,54。 

分野の進展

gefitinib、capecitabine、imatinibなどの他の抗がん剤のNLC製剤は、遊離薬物と比較して送達能が向上することが以前に示されているが14,15,16、特に異なる界面活性剤の組み合わせがヒドロキシ尿素封入NLCの物理化学的および細胞毒性プロファイルにどのように影響するかについての比較データは限られていた43,4,5。本研究では、単一のNLCプラットフォーム内で3つの界面活性剤系を系統的に比較することにより、界面活性剤のイオン特性と濃度が、粒子径、コロイド安定性、薬物保持率、およびin vitro抗がん活性にどのように共同的に影響するかを明らかにする、直接的な内部対照比較を提供した。これは、親油性ペイロードに比べてNLCの文献において十分に代表されていない、小さく非常に親水性の高い薬物の組み合わせである51,54,56,57。これらの結果は、in vitroでの細胞毒性向上が最大となる界面活性剤のペアリング（T80–SDS）を特定することで、脂質およびアルブミンベースのナノキャリアへのHU封入に関する先行報告53,58を拡張するものである。

研究の限界

本研究には、結果を解釈する際に考慮すべきいくつかの限界がある。第一に、生物学的評価がMCF-7乳がん細胞を用いた単一のin vitro MTTアッセイに限定されていた点である。HUは慢性骨髄性白血病や鎌状赤血球症に臨床的に用いられているが、本データはこれらの疾患に特異的な結論を裏付けるものではなく、関連する白血病モデル（例：K562細胞）およびin vivoでの確認が必要である。第二に、観察された物理化学的および細胞毒性的な差異について提示した機序の説明（例：界面活性剤の脱離、脂質の再結晶化、細胞取り込みの変化）は直接的に実証されておらず、仮説として捉えるべきである。これらを立証するには、DSC、XRD、Cryo-TEM23,41などの手法に加え、細胞取り込みおよび放出速度論の研究が必要となる。第三に、in vitro放出試験が生理的緩衝液ではなく水中で評価されたが、これはin vivoでの性能を予測するために不可欠なステップであると考えられている59。第四に、調製中のHUの化学的安定性が直接的に定量化されておらず、保存中の水相への薬物漏出に関する専用の評価が行われなかった。HUの高い水溶性を考慮すると、このような漏出の可能性があり、評価されるべきである。最後に、本製剤は非経口投与を目的としており、ここで提示した機序の解釈は、厳格な物理化学的検証の必要性を強調する広範なNLCの文献32と整合するように、さらなる特性評価を待つ探索的なものとして捉えられるべきである。

代替アプローチ

この分野における今後の研究を強化するためには、いくつかの代替的なキャラクタリゼーションおよび検証戦略が考えられます。固相分析手法（例：DSC、XRD）およびcryo-TEMを用いれば、脂質マトリックス内におけるHUの物理的状態を明確にし、観察された安定性の傾向を説明するために提案した界面活性剤の脱離および脂質の再結晶化メカニズムを直接的に検証できると考えられます36,60,61。水のみではなく、生理的バッファーまたは擬似生物学的流体を用いた放出試験を行うことで、in vivoでの放出挙動をより正確に予測でき、また、細胞取り込みを直接定量化（例：蛍光標識およびフローサイトメトリーによる）することで、ゼータ電位のみから推測するのではなく、NX-STの細胞毒性増強について提案した取り込みベースの説明を検証できるでしょう62,63,64。さらに、臨床的に関連のある別の細胞株（例：慢性骨髄性白血病のK562）を用いた確認試験や、正式な加速安定性試験条件下での評価を行うことで、今回のin vitroでの知見を、臨床的に適用可能な製剤へとさらに展開させる一助になると考えられます。

重要性と潜在的な応用

これらの知見は、迅速なクリアランス、バイオアベイラビリティの変動、および用量依存的な毒性によって現在臨床利用が制限されているヒドロキシ尿素のデリバリーを改善するという、より広範な取り組みに関連しています。界面活性剤の組成を調整することで、封入効率の高いより小さく安定な粒子（NX-CS、NX-CT）か、あるいはより高いin vitro細胞毒性（NX-ST）41,65のいずれかを優先的に得られることを示した本研究は、HU分子自体を変更することなく、特定の用途で優先されるデリバリー特性に応じてNLC組成を選択またはさらに最適化するための実用的な根拠を提供します。この種の調整可能なナノキャリアプラットフォームは、同様のデリバリー制限がある他の低分子親水性薬物にも適用できる可能性があります。

今後の展望

今後の研究では、固体状態解析およびイメージング技術を用いた、ここで提案した物理化学的メカニズムの定量的な検証、生理学的に適切な条件下での薬物放出試験、細胞取り込みの直接測定および細胞毒性との関係性の解明、さらに臨床的に重要な他の細胞株および最終的にはin vivoモデルでの試験、有効期限の決定を裏付けるための正式な加速試験および長期安定性試験、そしてHUの化学的安定性と保存に伴う漏出の定量化を優先的に行うべきである。これらの点に対処することで、ここで特定された物理化学的な利点が、有意義な治療上の利益につながるか否かを確立できると考えられる。

結論

本研究では、迅速なクリアランスによる輸送効率の低さ、バイオアベイラビリティの変動、および用量依存的な毒性といったHU療法の主要な限界を、ナノ構造脂質キャリア（NANOXURIA）の開発によって解決することを目的としています。その結果、界面活性剤の組成と保存条件が、物理化学的安定性、細胞毒性性能、および総合的な輸送効率に決定的な影響を与えることが示されました。各種製剤の中で、NX-STは遊離HUの3.2倍の細胞毒性活性を示し、優れた性能を発揮したことから、細胞取り込みと薬剤輸送が強化されたことが示唆されました。この有効性の向上は、バランスの取れた粒子特性、制御放出、および効果的な静電的安定化によるものであると考えられます。

対照的に、主に非イオン性界面活性剤に依存した製剤は、安定性と性能が相対的に低く、複合的な安定化メカニズムの重要性が浮き彫りとなりました。保存条件は製剤の挙動に大きな影響を与え、25 °Cでは粒子の成長と不均一性が促進されましたが、4 °Cでは安定性、均一性、および表面電荷がより良好に維持されました。

全体として、本研究は、合理的に設計されたNLCシステムが薬剤自体を変更することなくHUの送達を向上させられることを実証し、特定された研究上の課題を解決するものである。本結果は、安定かつ効率的で、臨床的に有用な薬物送達システムを実現するためには、最適な脂質と界面活性剤の組み合わせおよび適切な保存条件が不可欠であることを強調している。

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、プロジェクト番号：を通じて本研究への資金提供を行ったJazan University大学院研究・科学研究学部（Deanship of Graduate Studies and Scientific Research）に感謝の意を表します。 JU-RSP2026 著者らはまた、本プロジェクトの完遂に不可欠なリソースを提供し、成功を後押ししてくださったサウジアラビア、ジャザンのJazan University薬学部に対し、心より感謝申し上げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Amicon Ultra-2 mL遠心フィルター (3 kDa MWCO)Millipore, IrelandUFC20324
カーボンコート銅グリッド (TEM試料支持体)N/A
Cremophor EL (非イオン性界面活性剤、ヒマシ油誘導体、純度 ≥98%)MedChemExpress, NJ, USAHY-Y1890
透析バッグ (12-14 kDa MWCO)Spectrum Laboratories, CA, USA08-670-3BB
ジメチルスルホキシド (DMSO)Fisher Chemicals, UK10162090
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco, Paisley, UK10270-106
電界放出形走査電子顕微鏡 (FE-SEM)、Apreo 2Thermo Fisher-FEI, USA1290
ホモジナイザー、HG 15DWiseTis, GermanyDH.WHG02020
ヒドロキシウレア (HU) (純度 ≥9%)Sudair Pharma, Riyadh, Saudi Arabia21L01
MCF-7 ヒト乳がん細胞株American Type Culture Collection (ATCC), USAHTB-2
マイクロプレートリーダー、SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Germany601-101
MTT試薬 (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USAM6494
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP43
RPMI 1640培地Gibco, Grand Island, NY, USA11875093
ゴマ油Local merchant, Jazan, Saudi ArabiaN/A
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) (アニオン性界面活性剤、純度 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany28312
ステアリン酸 (純度 95-106%)Himedia, Mumbai, IndiaGRM1425
シリンジフィルター (0.45 µm)Merck, SASLHV03RS
透過電子顕微鏡 (TEM)、TalosThermo Fisher, USAN/A
Tween-80 (T80) (非イオン性界面活性剤、オレイン酸 ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, IndiaArt. No. 06420
UV-可視分光光度計Shimadzu, Kyoto, Japan20-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, UKZEN3690

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