このランダム化比較試験では、急性虚血性脳卒中ケアの補助療法として、標準化された鍼治療と加味逍遙散（modified Xiaoxuming Decoction）を併用するための再現可能なプロトコルを提供します。介入により、28日目の神経学的改善および特定のバイオマーカーにわずかな差異が認められましたが、参加者レベルの分析では、媒介効果や因果媒介の主張を支持する結果は得られませんでした。
研究記事
急性虚血性脳卒中に対する標準化鍼治療および改良小消鳴湯の併用療法：ランダム化比較試験
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
急性虚血性脳卒中には、全身性炎症および腸内細菌叢の乱れが伴います。本単一センター、評価者盲検化ランダム化比較試験では、標準治療に標準化鍼治療と加減小蓄陽湯を併用することが、早期の神経学的回復を改善し、事前に定義された腸および炎症バイオマーカーと関連するかどうかを検証しました。画像診断で確認された発症72時間以内の急性虚血性脳卒中患者で、National Institutes of Health Stroke Scale（NIHSS）スコアが4～15の成人を、標準治療群または併用介入群に1:1の割合でランダムに割り付け、各群64名として28日間実施しました。主要エンドポイントは、ベースラインのNIHSS、年齢、性別、再灌流療法、および発症からランダム化までの時間で調整した28日目のNIHSSとし、欠測値は30回の多重代入法で処理しました。副次および探索的アウトカムには、Barthel Index、90日目のmodified Rankin Scale（mRS）、有害事象、炎症マーカー、リポ多糖（LPS）、糞便微生物多様性、特定の属、および短鎖脂肪酸が含まれました。多重代入分析の結果、介入群で28日目のNIHSSスコアが低いことが推定されました（調整後差：−1.30点、95%信頼区間：−2.36～−0.24、P = 0.017）。28日目のBarthel Indexは高値を示しましたが、90日目のNIHSS、Barthel Index、および観察されたmRS 0–2に有意差は認められませんでした。28日目において、介入群はShannon diversityと糞便中酪酸が高く、interleukin-6とLPSが低い結果となりました。酪酸、interleukin-6、LPS、およびShannon diversityの個人レベルでの変化は、NIHSSの変化と有意に関連していなかったため、媒介分析は実施しませんでした。介入に関連する重篤な有害事象は認められませんでした。併用介入は、緩やかな早期神経学的改善および特定のバイオマーカーの差と関連していましたが、生物学的な知見は探索的なものであり、因果関係のある脳腸相関経路を立証するものではありません。
概要
脳卒中は世界的に依然として死因および長期的な障害の主要な原因であり、その大部分を虚血性脳卒中が占めています。標準的な治療では、迅速な診断、適応がある場合の再灌流療法、抗血小板療法、リスク因子の管理、合併症の予防、およびリハビリテーションが重視されています1,2。これらの対策を講じたとしても、神経学的後遺症が残ることが一般的であるため、再現性のある補助的な介入法の評価が求められています。
虚血後の炎症、内皮および血液脳関門のストレス、末梢免疫の活性化、および代謝異常は、二次的損傷と回復に寄与します3。また、脳卒中は腸の運動能、透過性、微生物組成、および腸由来の免疫シグナル伝達を変化させることがあり、これにより、一般に脳腸相関として記述される双方向的な関連性が構築されます4。
臨床研究により、急性虚血性脳卒中と腸内細菌叢の乱れ（ディスバイオーシス）、短鎖脂肪酸（SCFA）プロファイルの変化、および予後の悪化との関連が示されています5。酪酸は、上皮バリアの完全性を維持し、免疫シグナル伝達を調節するため注目されています6。これらの知見は、神経学的アウトカムと併せて、微生物の多様性、微生物代謝物、エンドトキシンへの曝露、および炎症性メディエーターを測定することを正当化しますが、同時に、並行して起こる変化が必ずしも介在を証明するものではないことを認識しておく必要があります。
鍼治療は脳卒中の補助療法として評価されてきましたが、公表されている試験では、実施タイミング、経穴の選択、頻度、およびアウトカム評価に差異があります7,8。したがって、再現可能なプロトコルには、刺鍼、刺激、留針、安全性、および遵守手順に関する明確な規定が必要です。消風散（Xiaoxuming Decoction）は、脳卒中に関連する疾患に用いられる古典的な漢方処方です。系統的な研究および薬理学的研究では有益な可能性が報告されていますが、臨床的根拠はサンプルサイズ、異質性、およびバイアスのリスクによって依然として限定的です9,10。2群間の複合介入デザインでは、その寄与を鍼治療から分離して評価することはできません。
本試験では、臨床結果および事前に定義された探索的な腸および炎症バイオマーカーを用いて、標準化された複合介入を評価した11。標準治療に標準化された鍼治療および修正小蓄陽湯（modified Xiaoxuming Decoction）を加えることで、早期の神経学的回復が改善し、事前に定義された脳腸相関に関連するバイオマーカーに好影響を与えるという仮説を立てた。
プロトコル
本研究に対する倫理承認は、2025年6月10日に達州市中西医結合病院の医学倫理委員会によって発行されました（承認番号：2025–29、有効期限：2027年6月9日まで）。ランダム化に先立ち、各参加者または法的代理人から書面によるインフォームドコンセントを得ました。同意内容には、鍼治療、漢方治療、血液および糞便の採取、マイクロバイオームデータの保護、および標準的なケアを損なうことなく生体試料採取から撤退することが含まれていました。手順はヘルシンキ宣言に従いました。プロトコルで使用した研究ツールは材料表に記載されています。参加者のリクルート開始前に登録が完了していなかったため、本試験は前向きに登録されていません。
1. 研究デザインとランダム化
参加者は2025年3月1日から12月31日まで募集され、各参加者は90日間追跡調査された。本研究では、28日間の能動的介入を伴う単一センター、評価者盲検、並行群間比較デザインを採用した。適格な参加者は、標準治療群または標準治療に鍼治療および修正小蓄陽湯（modified Xiaoxuming Decoction）を加えた群に1:1の割合で割り付けられた。ランダム化には、コンピュータで生成された4または6のブロックを用い、ベースラインのNIHSSスコア（4–8 vs. 9–15）で層別化した。割り付けは、連続番号付きの不透明な密封封筒を用いて隠蔽された。
最終的な28日間の介入は2026年1月28日に完了し、最終フォローアップは2026年3月31日に完了した。データベースは2026年4月15日にロックされ、事前定義された解析は2026年4月30日までに完了した。本研究はCONSORT原則12に従った。参加者のフローは図1に、評価スケジュールは表1に示されている。
2. 被験者のスクリーニングおよび登録
コンピューター断層撮影（CT）または磁気共鳴画像法（MRI）で確認された急性虚血性脳卒中の患者を、症状発現または最後に健常であったことが確認された時点から72時間以内にスクリーニングした。適格基準は、年齢40～80歳の成人で、ベースラインのNational Institutes of Health Stroke Scale（NIHSS）スコアが4～15であり、救急評価後にバイタルサインが安定しており、24時間以内に割り当てられた介入を開始でき、かつ血液および糞便サンプルの提供に同意した者とした。NIHSSの評価は、訓練を受けた評価者によって実施された13。
除外基準は、脳内出血、梗塞を伴わない一過性脳虚血発作、昏睡、減圧術の予定がある場合、経口摂取が不安全な場合、全身性抗菌薬を必要とする活動性感染症、4週間以内の抗菌薬、プロバイオティクスサプリメントまたはプレバイオティクスサプリメントの使用、炎症性腸疾患、慢性下痢、6ヶ月以内の胃腸手術、悪性腫瘍、重度の肝機能または腎機能障害、コントロール不良の高血圧、不安定狭心症、不適当な不整脈、血小板数 < 80 × 109/L、鍼治療の禁忌、生薬製剤へのアレルギー、妊娠または授乳、3ヶ月以内の他の介入試験への参加、またはフォローアップを完了できない場合とした。日常的な中国の食事を完全に標準化することは不可能であるため、一般的な植物性食品、漬物、および発酵豆腐は禁止製品に分類しなかった。
3. 標準ケアおよびマイクロバイオームに関連する曝露
両群ともに、適応がある場合は静脈内血栓溶解療法および／または機械的血栓回収術を含むガイドラインに基づいた治療、抗血小板療法、脂質低下療法、血圧管理および血糖管理、水分補給と栄養管理、嚥下スクリーニング、肺炎および深部静脈血栓症の予防、リハビリテーション、および二次予防14を受けた。研究への参加によって再灌流療法が遅延したり、代替されたりすることはなかった。
ランダム化から28日目まで、研究以外の鍼治療、お灸、脳卒中関連の漢方処方、プロバイオティクス/プレバイオティクス/シンバイオティクスサプリメント、および微生物叢標的製剤の使用は禁止された。参加者と介護者には、これらの制限が日常的な食品ではなく、サプリメントおよび市販のプロバイオティクス製品に適用されることが伝えられた。
再灌流療法およびプロトコルからの逸脱を記録した。食事、嚥下障害の重症度、経腸栄養、ランダム化後の抗菌薬投与、プロトンポンプ阻害薬の使用、便秘、および入院期間を、マイクロバイオームに関連する潜在的な共変量として記録した。これらの変数はマイクロバイオームの統計モデルに共変量として組み込まれなかったため、残留交絡因子として検討された。
4. 割付の隠蔽化
ランダム化割り付け順序は、独立した統計学者によって作成された。リクルート、治療、アウトカム評価、ラボ作業、または統計解析に関与していないコーディネーターが、連番が付された不透明で密封された封筒を準備した。インフォームドコンセントの取得、適格性の確認、およびベースライン評価の完了後にのみ、次の封筒が開封された。ランダム化順序はパスワードで保護されたファイルに保存され、主要解析が完了するまで、アウトカム評価者、ラボ担当者、および解析者はこのファイルにアクセスできない状態で管理された。
5. アウトカム、ラボ、および解析の盲検化
NIHSS、バーセル指数、および修正ランキンススケール（mRS）の評価は、治療の実施担当者とは別の評価者によって行われました。参加者および介護者には、治療の割り当てをアウトカム評価者に開示しないよう指示しました。生体試料にはコード化された識別子が貼付され、検査担当者および統計解析者は、事前に規定された解析が完了するまで群コードについて盲検化されました。偶発的な盲検解除が発生した場合は、その内容を記録しました。
6. 標準化された手技鍼治療
担当の神経内科医が血行動態の安定および許容可能な出血リスクを確認した後、ランダム化から24時間以内に鍼治療を開始した。治療スケジュールは、1回30分を1日1回、週5日、4週間にわたり、計20回のセッションを計画した。
被験者を安全な姿勢に固定し、刺鍼前に皮膚を消毒した。百会（GV20）、水溝（GV26）、左右の風池（GB20）、曲池（LI11）、合谷（LI4）、足三里（ST36）、陽陵泉（GB34）、および三陰交（SP6）に、表215に規定された側性と深さに従って刺鍼した。
サイズ 0.25 mm × 40 mm の滅菌使い捨てステンレス製鍼を使用しました。鍼は、経穴および体格に応じて 10–25 mm の深さに刺入しました。得気または局所的な刺鍼反応が得られるまで、手技による提插および捻転を行いました。鍼は 30 分間留置し、10 分ごとに手動で再刺激しました。電気鍼は使用しませんでした。
鍼治療は、5年以上の臨床経験を持つ免許保持した鍼灸師によって行われました。発熱、血圧の不安定、神経学的悪化、活動性出血、激しい興奮または疲労、あるいは参加者の拒否がある場合は、セッションを延期しました。延期の理由および関連する有害事象はすべて記録されました。
7. 改良小澄湯
1日あたりの投与量は、Ephedrae Herba 6 g、Cinnamomi Ramulus 9 g、Paeoniae Radix Alba 12 g、Saposhnikoviae Radix 9 g、Zingiberis Rhizoma Recens 6 g、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 6 g、Angelicae Sinensis Radix 10 g、Chuanxiong Rhizoma 10 g、Astragali Radix 20 g、Poria 15 g、および Paeoniae Radix Rubra 12 g で構成されていた。処方された生薬の同一性は、調剤前に病院の薬剤部によって確認され、標準的な調剤および煎じ手順に従った。処方の詳細は表 39˒16に示されている。
あらかじめ定義された修正のみが許可された。便秘がある場合は Cannabis Fructus 10 g を追加でき、軟便がある場合は Poria を 20 g まで増量でき、顕著な自汗がある場合は Astragali Radix を 30 g まで増量できた。すべての修正、服用忘れ、嘔吐、および治療の中断を記録した。
1日分を病院薬剤部で煎じ、400 mLまで濃縮した。この調剤物を200 mLずつ2回に分け、朝食後および夕食後に28日間投与した。嚥下困難、持続的な嘔吐、アレルギー、またはアラニン・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ALT/AST）の上昇が認められた場合は、投与を中止した。 >3× 推算糸球体濾過量の正常上限値 <45 mL/min/1.73 m²2、コントロール不能な血圧、臨床的に重要な頻脈性不整脈、新たな胸痛、または治験責任医師が判断したリスク。
8. 対照群の制限事項
対照群に割り当てられた参加者は、標準治療のみを受けた。プロトコル外の鍼治療、お灸、脳卒中関連の漢方療法、プロバイオティクス/プレバイオティクス/シンバイオティクスサプリメント、および微生物叢標的製品の使用は28日目まで禁止された。これらの介入が行われた場合はすべて、プロトコル逸脱として記録された。
9. 遵守状況および安全性のモニタリング
鍼治療のコンプライアンスは、完了したセッション数を計画された20セッションで除して算出した。漢方薬のコンプライアンスは、返却されたパッケージと服薬日記を用いて評価した。プロトコル遵守（per-protocol adherence）は、少なくとも16回の鍼治療セッションを完了し、処方された煎剤投与量の80%以上を服用したことと定義した。入院患者は毎日観察し、外来患者は予定されたフォローアップ時にモニタリングを行った。記録された有害事象には、局所の出血、血腫、疼痛、めまい、失神、感染、胃腸症状、発疹、肝機能または腎機能の異常、動悸、血圧変動、およびアレルギーが含まれていた。重篤な有害事象およびその因果関係は、2名の臨床医によって、無関係、可能性あり、おそらく関係あり、または確実に関係ありのいずれかに独立して分類された。
10. 臨床アウトカム評価
NIHSSは、ベースライン時、および14日目、28日目、90日目に評価した。ベースラインのNIHSSで調整した28日目のNIHSSを主要評価項目とした。Barthel Indexはベースライン時、および28日目、90日目に評価し、mRSは90日目に評価した。再発脳卒中、全死因死亡、および有害事象は90日目まで記録した17。90日目の良好な転帰は、mRS 0–2と定義した。臨床的および生物学的アウトカム、評価時点、定義、および解析分類を表4にまとめる。
11. 採血およびバイオマーカーアッセイ
静脈血は、介入前のベースライン時、および14日目と28日目に、可能な限り一晩の絶食後06:30から08:30の間に採取した。非絶食状態で採取した場合は、必要に応じてその旨を記録した。
サンプルは2 h以内に処理した。遠心分離は4 °Cで850 × g、10 min間で行った。血清および血漿は滅菌済みクライオバイアルに分注し、−80 °Cで保存した。可能な限り、同一被験者のサンプルは同一のアッセイバッチ内で処理した。
高感度C反応性蛋白、インターロイキン-6 (IL-6)、腫瘍壊死因子-α、リポ多糖 (LPS)、およびゾヌリンを、指定のアッセイを用いて定量した。IL-6、腫瘍壊死因子-α、LPS、およびゾヌリンはn=2で測定し、重複測定の変動係数が15%を超えた場合は再測定を行った。
研究固有のバリデーション結果ではなく、メーカーが報告しているカタログ仕様は以下の通りであった：hs-CRPの感度は5.36 pg/mL、測定範囲は18.75–1,200 pg/mL、血清中のアッセイ内/アッセイ間CVは1.4%/4.0%。IL-6の感度は0.7 pg/mL、測定範囲は3.12–300 pg/mL、血清/血漿のアッセイ内CVは1.6%–4.2%、アッセイ間CVは3.3%–6.4%。腫瘍壊死因子アルファの感度は6.23 pg/mL、測定範囲は15.6–1,000 pg/mL、アッセイ内CVは2.2%–3.0%、アッセイ間CVは7.3%–8.4%。および、ゾヌリンの検出限界は0.183 ng/mL、定量限界は0.183 ng/mL、直線性は3.03–40.25 ng/mL、併行精度CVは3.5%–6.0%、再現性CVは7.7%–8.3%であった。ゾヌリンの検出限界および定量限界は、試料希釈係数を適用する前の値としてメーカーより報告されたものである。
LPS濃度はEU/mLで、血漿中トリメチルアミン-N-オキシド濃度はµmol/Lで報告された。両方の測定値は探索的なバイオマーカーアウトカムとして扱われた。
12. 糞便採取および16S rRNAシーケンシング
糞便サンプルは、ベースライン時および28日目に滅菌チューブを用いて採取し、排便時間および凍結時間を記録した。予定された採取期間内に排便できなかった参加者については、臨床的に可能な限り速やかに、次回の自然排便時にサンプルを採取した。ランダム化されたすべての参加者が、最終的にマイクロバイオームおよび短鎖脂肪酸分析に適した糞便サンプルを提供した。採取の遅延が生じた場合でも、予定されていた糞便ベースの分析において検体の欠損はなかった。採取の遅延および便秘の状態を記録し、研究サンプリングのみを目的とした下剤の投与は行わなかった。
新鮮な糞便は2 h以内に輸送した。直ちに輸送できない場合は、サンプルを4 °Cで6 h以内に保持した後、−80 °Cで保存した。凍結融解の繰り返しは避けた。DNAは指定の糞便用DNA抽出キットを用いて抽出した。338Fおよび806Rプライマーを用いてV3–V4領域を増幅し、300-bpのペアエンドシーケンシングを行った。QIIME 2 version 2024.10.1 (RRID: SCR_021258)を用いて、リードのデマルチプレクシングおよびプライマーのトリミングを行った。品質フィルタリング、デノイジング、ペアリードの統合、キメラ除去、およびアンプリコン配列バリアント（ASV）の推定にはDADA2を使用した。分類群の割り当てはSILVA release 138.1 (RRID: SCR_006423)に基づいて行った。
α多様性のためにShannon指数およびChao1指数を算出した。β多様性にはBray–Curtis距離および主座標分析を用い、β多様性の差を評価するために permutation multivariate analysis of variance (PERMANOVA) を用いた18。
13. 分便中短鎖脂肪酸の定量
解凍した便約100 mgを0.5% リン酸 1.0 mLと混合し、60秒間ボルテックスした後、4 °Cにて14,000 × gで10分間遠心分離した。上清を、内部標準として 4-methylvaleric acid を含む酢酸エチルで抽出した。
1 µLの分注量を、30 m × 0.25 mm × 0.25 µmのDB-FFAPカラムを用いた質量選択検出器付きガスクロマトグラフィーにより分析した。ヘリウムを流量1.0 mL/min、スプリット比10:1で使用し、70 eVの電子衝撃イオン化を行った。
酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、およびイソ吉草酸を定量し、それらの総和を総短鎖脂肪酸と定義した。分析者は治療群の割り付けについて盲検化されており、短鎖脂肪酸分析は探索的な解析として扱った。
14. 探索的バイオマーカー応答
探索的複合応答は、28日目の変化のうち、シャノン指数の増加を含む4つの指標のうち少なくとも2つが認められたことと定義した。 > 0.20, 糞便中酪酸の増加 > 20%の血漿LPS減少 > 15%であり、IL-6は減少した > 20%。これらの実用的閾値は、わずかな分析上の変動を上回ることを目的として設定されたものであり、臨床的な検証は行われておらず、探索的な記述にのみ使用されました。シャノン閾値は…… < 1.5を使用した。
15. サンプルサイズの算出
サンプルサイズの算出では、28日目のNIHSS変化量における群間差を1.2点、標準偏差を2.3、両側αレベルを0.05、検出力を80%と想定した。この計算により、1群あたり58名の被験者が必要となった。主要エンドポイントの不備が10%生じると想定し、目標登録数を1群あたり64名とし、合計128名のランダム化被験者を設定した19。
16. データ管理と品質管理
臨床データは標準化された症例報告書を用いて記録し、二重データ入力を行った。データベースのロック前に範囲チェックおよび整合性チェックを実施し、不一致については原資料に照らして解決した。アウトカム評価者は登録前にトレーニングを受けた。検体の採取、処理時間、保存温度、凍結融解サイクル、アッセイバッチ、およびシーケンシングバッチは、コード化された識別子を用いて追跡した。
17. 統計解析
ランダム化された全128名の参加者が、主要な意図した治療による分析（ITT分析）に含まれた。プロトコル準拠集団は、28日目の評価を完了し、割り当てられた介入の80%以上を受けており、かつ重大なプロトコル違反がない者と定義した。処置を受けたすべての参加者が安全性分析に含まれた。マイクロバイオームおよび短鎖脂肪酸の分析は、ベースライン時および28日目に収集された評価可能な糞便検体を用いて実施した。ランダム化されたすべての参加者が分析可能な糞便サンプルを提供したため、除外された参加者はなく、糞便ベースの分析において欠損検体の補完は不要であった。
欠損している28日目のNIHSS値は、治療、ベースラインおよび14日目のNIHSS、ベースラインのBarthel Index、年齢、性別、再灌流療法、および発症からランダム化までの時間を変数に含めた連鎖方程式ベイジアンリッジモデルを用い、ランダム欠損の仮定の下で30回代入された。推定値はRubinのルールを用いて統合され、感度分析として完解析が実施された。
ヒストグラムとQ–Qプロットを確認し、モデルの残差に対してShapiro–Wilk検定を適用した。主要な完全ケース分析によるANCOVAの残差は、正規分布に適合していた（P = 0.308）。右に強く歪んだバイオマーカーについては、必要に応じて線形モデル化の前に変換を行った。ロジスティック回帰においては、二値アウトカムの分布に正規性は不要であるため、連続予測変数の線形性と影響力の強い観測値について評価した。
28日目のNIHSSについては、治療法、ベースラインのNIHSS、年齢、性別、再灌流療法、および発症からランダム化までの時間をモデルに組み込んだ共分散分析（ANCOVA）を用いた20。28日目の連続的な探索的アウトカムについては、ベースライン調整線形モデルを用いた。割合についてはカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を用い、Bray–Curtis距離については9,999回の置換を用いたPERMANOVAを用いた。マイクロバイオームの多様性およびコミュニティ構造解析では、食事、嚥下障害の重症度、経腸栄養、ランダム化後の抗菌薬投与、プロトンポンプ阻害薬の使用、便秘、または入院期間による調整は行わなかった。これらの因子は、潜在的な残留交絡因子であると考えられた。
表示された3つの属全体にBenjamini–Hochberg偽発見率補正を適用し、名目P値とq値の両方を報告した。参加者レベルの探索的関連については、5,000回のブートストラップ再サンプリングによるSpearman rhoを用い、推論的な解釈にピアソン相関係数は使用しなかった。暴露–媒介因子および媒介因子–アウトカムの両方の関連性が支持された場合にのみ、媒介分析を行う計画とした。一次的に設定した臨床アウトカムについては、両側 P < 0.05 を有意水準とした。
図1：参加者のフローおよび評価スケジュール。(A) スクリーニング（n = 176）、除外（n = 48）、ランダム化（各群64名）、静脈内血栓溶解療法（対照群16名、介入群18名）、機械的血栓回収術（4名、5名）、28日目NIHSSの利用可能性（59名、58名）、90日目の追跡観察（57名、56名）、および解析対象集団を示すCONSORTスタイルのフローチャート。 (B) 介入および評価スケジュール。NIHSS：米国国立衛生研究所脳卒中スケール、ITT：意図した治療による分析、mRS：修正ランキンスケール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 研究手順 | スクリーニング | ベースライン | 1–28日目 | 14日目 | 28日目 | 90日目 |
| カレンダー期間 | 2025年3月1日–12月31日 | ランダム化と同日 | 2025年3月–2026年1月 | ±2日 | ±3日 | ±7日 |
| 適格性評価 | ✓ | |||||
| 書面によるインフォームドコンセント | ✓ | |||||
| CT/MRIによる虚血性脳卒中の確認 | ✓ | |||||
| 人口統計学的データおよび臨床データの収集 | ✓ | |||||
| ランダム化 | ✓ | |||||
| 標準的な急性虚血性脳卒中治療 | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | |
| 標準化手技による鍼治療 | ✓ | |||||
| 修正小蓄明湯 | ✓ | |||||
| NIHSS評価 | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ||
| バーセル指数（Barthel Index）評価 | ✓ | ✓ | ✓ | |||
| 修正ランキンスケール（mRS）評価 | ✓ | |||||
| 末梢血サンプルの収集 | ✓ | ✓ | ✓ | |||
| 糞便サンプルの収集 | ✓ | ✓ | ||||
| 有害事象のモニタリング | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | |
| 最終臨床フォローアップの完了 | 2026年3月31日まで | |||||
| データクリーニングおよび統計解析 | 2026年4月1日–4月30日 |
表1：研究スケジュール、介入曝露、検体採取、およびアウトカム評価。CT：コンピューター断層撮影、MRI：磁気共鳴画像法、NIHSS：米国国立衛生研究所脳卒中尺度
| ツボ（経穴） | 場所カテゴリー | 側性 | 針の刺入深さ | 刺激方法 | 保持時間 | 治療頻度 | 安全上の注意事項 |
| 百会 (GV20) | 頭皮点 | 単一の | 10–15 mm | 軽微な手動刺激を伴う斜め挿入 | 30分 | 週5回、4週間 | バイタルサインが不安定な患者への過度な刺激を避ける |
| 水溝 (GV26) | 顔面ポイント | シングル | 5–10 mm | 緩やかな手動刺激を伴う斜方向挿入 | 30分 | 週5回、4週間 | 局所の皮膚損傷、感染症、または協調性の低い患者への穿刺は避けてください。 |
| 風池 (GB20) | 頭頸部ポイント | 両側性の | 15–25 mm | 斜めに刺入し、深部の内側への針刺しは避けた。 | 30分 | 週5回、4週間 | 脊柱管または椎骨動脈領域への深い挿入を避けてください。 |
| 曲池 (LI11) | 上肢点 | 両側性の | 15–25 mm | 手動でのリフティング・スラスティングおよびツイリング | 30分 | 週5回、4週間 | 皮下出血、浮腫、または感染のある皮膚への穿刺は避けてください。 |
| 合谷（LI4） | 上肢点 | 両側性の | 10–20 mm | 手動によるリフティング・スラスティングおよびツイリング | 30分 | 週5回、4週間 | 虚弱な患者、または疼痛耐性の低い患者において、過度な操作は避けること。 |
| 足三里 (ST36) | 下肢点 | 両側性の | 20–25 mm | 手動によるリフティング・スラスティングおよびツイーリング | 30分 | 週5回、4週間 | 浮腫、感染、または局所的外傷がある部位への刺針は避けてください。 |
| 陽陵泉 (GB34) | 下肢ポイント | 両側性の | 20–25 mm | 手動によるリフティング・スラスティングおよびトゥワーリング | 30分 | 週5回、4週間 | 重度の肢痛、外傷、または不穏状態にある患者への穿刺は避けてください。 |
| 三陰交 (SP6) | 下肢ポイント | 両側性の | 15–25 mm | 手動によるリフティング・スラスティングおよびツイーリング | 30分 | 週5回、4週間 | 妊娠中および局所に皮膚病変のある患者への投与は避けてください。 |
表2：標準化された鍼治療処方および操作プロトコル。 操作上の注意：0.25 mm × 40 mmの滅菌使い捨てステンレス針を使用した。得気感が報告されるか、局所的な刺鍼反応が観察されるまで手技による刺激を加えた。針は30分間留置し、留置期間中は10分ごとに手技による刺激を繰り返した。
| 構成要素 | ラテン語の医薬品名 | 1日投与量 | 処方における機能的役割 | 品質管理および安全上の注意点 |
| マオウ | 麻黄 | 6 g | 祛風通絡成分 | 治療期間中、血圧、動悸、胸部不快感、および不眠症をモニタリングした。 |
| 桂枝 | 桂枝 | 9 g | 加温および循環補助コンポーネント | 多汗症または熱関連症状のある患者への投与は慎重に行うこと |
| 白牡丹根 | 芍薬根 | 12 g | 調和および抗痙攣成分 | 薬局による認証およびバッチ文書の作成が必要であった。 |
| サポシュニコビア根 | 沙뽀什尼科根（サポシュニコヴィアエ・ラディクス） | 9 g | 祛風成分 | 薬剤局による認証およびバッチ文書が求められた。 |
| 生姜 | 生姜（ショウガ）根茎 | 6 g | 胃腸調和成分 | 持続的な嘔吐が認められた場合は、投与を中止した。 |
| 甘草根 | 甘草 | 6 g | 処方調和成分 | 高リスク患者において、電解質異常および浮腫のモニタリングを行った。 |
| 当帰根 | 当帰根 | 10 g | 補血および活血成分 | 抗血小板薬または抗凝固薬の併用について記録した。 |
| 川芎根茎 | 川芎根茎 | 10 g | 血液活性化成分 | 出血に関連する有害事象をモニタリングし、記録した。 |
| アストラガルス根 | 黄耆 | 20 g | 補気成分 | 顕著な自然発汗が認められる場合は、プロトコルで定義された変更として記録することを条件に、30 gまで増量することが可能である。 |
| ブク rowing (Poria) | ブクロウコノケ（茯苓） | 15 g | 健脾除湿成分 | 軟便の場合は20 gまで増量可能であるが、その際はプロトコルで定義された変更として記録すること。 |
| 牡丹根 | 牡丹皮 | 12 g | 活血および抗炎症成分 | 薬局による認証およびバッチ文書の作成が必要であった |
| ヘンプシード | 大麻果実 | 必要に応じて10 g | 便秘調節のみ | 便秘に対してのみ追加され、プロトコル定義による変更として記録された |
表3：改良小枢明湯の組成および投与プロトコル。 投与プロトコル：1日分を病院の調剤薬局で煎じ、400 mLに濃縮した。この煎剤を200 mLずつ2回に分け、朝食後と夕食後に28日間連続で経口投与した。嚥下困難、持続的な嘔吐、アレルギー反応の疑い、アラニンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが正常上限値の3倍を超えた場合、推定糸球体濾過量が45 mL/min/1.73 m2未満の場合、標準的な管理後も血圧が制御不能な場合、臨床的に有意な頻脈性不整脈、新たな胸痛、または研究者が安全上の懸念があると判断した患者への投与は中止した。
| アウトカムカテゴリー | 変数 | 評価時点 | 定義または測定 | 解析分類 |
| 神経学的欠損 | NIHSSスコア | ベースライン、14日目、28日目、90日目 | 盲検化された神経内科医による米国国立衛生研究所脳卒中スケール（NIHSS）の評価 | 28日目の主要臨床アウトカム、14日目および90日目の副次臨床アウトカム |
| 日常生活動作機能 | バーセル指数 | ベースライン、28日目、90日目 | 訓練を受けた盲検評価者によって評価された日常生活動作スコア | 副次的な臨床評価項目 |
| 世界的な障害状況 | 修正ランキン尺度 | 90日目 | 機能障害スコア 0–6 | 二次臨床アウトカム；観察された分布および個別にラベル付けされたITT二分法 |
| 良好な機能的転帰 | mRS 0–2 | 90日目 | mRS 0、1、または2の参加者 | 二次臨床評価項目 |
| 脳卒中の再発 | 再発性虚血性脳卒中 | 90日目まで | （可能であれば）画像診断を併用した神経内科医による診断 | 安全性関連アウトカム |
| 死亡率 | 全死因死亡 | 90日目まで | 全死亡 | 安全性アウトカム |
| 全身性炎症 | 高感度CRP、IL-6、TNF-α | ベースライン、14日目、28日目 | 血清／血漿中濃度 | 探索的バイオマーカーアウトカム |
| エンドトキシン／バリアマーカー | LPS、ゾヌリン | ベースライン、14日目、28日目 | 血中濃度 | 探索的バイオマーカーアウトカム |
| 微生物代謝物 | トリメチルアミン-N-オキシド | ベースライン、28日目 | 血漿濃度 | 探索的バイオマーカーアウトカム |
| 腸内細菌叢の多様性 | シャノン指数、Chao1指数、ブレイ・カーティス非類似度 | ベースライン、28日目 | 16S rRNA由来の多様性 | 探索的バイオマーカーアウトカム |
| 微生物組成 | 選択された属 | 28日目 | 属レベルの相対的に豊富さ | 探索的解析；提供された3属における公称P値およびBH-FDR q値 |
| 短鎖脂肪酸 | 酢酸、プロピオン酸、酪酸、総短鎖脂肪酸 | 28日目 | GC-MSによる糞便中濃度の測定 | 探索的バイオマーカーアウトカム |
| 探索的応答 | 複合応答 | 28日目 | 少なくとも2つ：シャノン >0.20; ブチレート >20%；LPSによる減少 >15%；IL-6の減少 >20% | 探索的；閾値は臨床的に検証されていない |
| 介入の安全性 | 有害事象および重篤な有害事象 | 1–90日目 | 研究者によって記録されたイベントおよびその帰属 | 安全性アウトカム |
表4：臨床的および生物学的アウトカム、ウィンドウ、定義、および解析分類。この表は、事前に規定された臨床的および生物学的アウトカム、その評価時点、操作的定義、および解析分類をまとめたものである。FDR：偽発見率、hs-CRP：高感度C反応性蛋白、IL-6：インターロイキン-6、LPS：リポポリサッカライド、mRS：修正 Rankin 尺度、NIHSS：米国国立衛生研究所脳卒中尺度、SCFA：短鎖脂肪酸、TMAO：トリメチルアミン-N-オキシド。
結果
Participant flow and analysis populations
Of 176 patients screened, 48 were excluded before randomization, and 128 were randomized (64/group; Figure 1). All randomized participants were included in the intention-to-treat and safety populations. Day-28 NIHSS was observed for 59 control and 58 intervention participants; day-90 follow-up was completed by 57 and 56 participants, respectively. The per-protocol populations comprised 58 and 57 participants (Figure 2).
Baseline characteristics
Baseline characteristics were similar between groups (Table 5). Mean age was 65.1 ± 8.7 versus 64.7 ± 9.1 years, baseline NIHSS was 8.6 ± 2.6 versus 8.4 ± 2.9, and baseline Barthel Index was 43.5 ± 13.2 versus 44.8 ± 12.7. Intravenous thrombolysis was administered to 16/64 (25.0%) control participants, and 18/64 (28.1%) intervention participants; mechanical thrombectomy was performed in 4/64 (6.3%) and 5/64 (7.8%), respectively.
Intervention adherence
In the intervention group, the median number of acupuncture sessions was 18 (interquartile range, 17–20); 57 participants completed ≥ 16 sessions, and 58 consumed ≥ 80% of the decoction. Non-protocol probiotic/prebiotic use occurred in two control participants and one intervention participant; these participants were included in the intention-to-treat analysis but excluded from the per-protocol analysis (Supplementary Table 1).
Clinical outcomes
Observed NIHSS decreased from 8.6 ± 2.6 – 5.5 ± 3.1 in the control group (n = 59 at day 28) and from 8.4 ± 2.9 – 4.1 ± 2.9 in the intervention group (n = 58; Figure 3A). Observed mean changes were −3.34 ± 4.14 and −3.97 ± 4.03 points, respectively (Figure 3B). In the prespecified 30-imputation ANCOVA, adjusted day-28 NIHSS was 1.30 points lower with the intervention (95% confidence interval [CI], −2.36 to −0.24; P = 0.017).
Day-14 NIHSS was 5.49 ± 2.45 versus 4.61 ± 2.23 (baseline-adjusted P = 0.041), and observed day-90 NIHSS was 3.68 ± 2.68 (n = 57) versus 2.88 ± 2.36 (n = 56; P = 0.091; Figure 3A).
Day-28 Barthel Index was 61.39 ± 18.80 versus 68.82 ± 19.36 (baseline-adjusted P = 0.040); observed day-90 values were 75.56 ± 19.22 versus 81.49 ± 17.67 (P = 0.098; Figure 3C). Among participants included in the observed-case day-90 mRS analysis, a favorable outcome occurred in 32/57 controls (56.1%) and 38/56 intervention participants (67.9%; P = 0.200). The complete observed-case mRS category distribution is shown in Figure 3D and Supplementary Table 1. ITT estimates for the dichotomized mRS outcome using multiple imputation (36/64 versus 44/64; P = 0.144) are reported separately.
Brain–gut axis-related biomarkers
Fecal samples were available and successfully analyzed for all randomized participants (64 per group) at the planned analysis time point. Shannon diversity at day 28 was 3.08 ± 0.52 versus 3.31 ± 0.57 (baseline-adjusted P = 0.019; Figure 4A), and fecal butyrate was 10.21 ± 4.27 versus 12.91 ± 5.08 µmol/g (P = 0.002; Figure 4B).
IL-6 was 18.23 ± 9.44 versus 15.62 ± 8.06 pg/mL at day 14 (nominal P = 0.095) and 14.61 ± 8.18 versus 11.84 ± 6.83 pg/mL at day 28 (baseline-adjusted P = 0.041; Figure 4C). LPS was 0.85 ± 0.32 versus 0.78 ± 0.30 EU/mL at day 14 (P = 0.204) and 0.78 ± 0.31 versus 0.66 ± 0.28 EU/mL at day 28 (baseline-adjusted P = 0.023; Figure 4D).
At day 28, Faecalibacterium and Roseburia were more abundant in the intervention group (nominal P = 0.006 and 0.009; both q = 0.013), whereas Bifidobacterium did not meet nominal significance (P = q = 0.056; Figure 4E). Benjamini–Hochberg correction was applied across the three displayed genera.
The exploratory composite response occurred in 21/64 controls (32.8%) and 34/64 intervention participants (53.1%; P = 0.020). Component results are reported in Figure 4F and Supplementary Table 2; the thresholds are exploratory and not clinically validated.
Participant-level exploratory associations
Participant-level exploratory associations were assessed using Spearman's rho with 5,000 bootstrap resamples. Changes in fecal butyrate, IL-6, LPS, and Shannon diversity were not significantly associated with the corresponding neurological or biomarker changes (Figure 5).
Changes in fecal butyrate and NIHSS were not significantly associated (Spearman rho = −0.05; 95% bootstrap confidence interval [CI], −0.23 to 0.13; P = 0.601; n = 117). IL-6 change was not associated with NIHSS change (rho = −0.01; 95% bootstrap CI, −0.18 to 0.15; P = 0.887; n = 117), and LPS change was not associated with IL-6 change (rho = −0.14; 95% bootstrap CI, −0.29 to 0.03; P = 0.125; n = 128).
Shannon diversity change was not significantly associated with NIHSS change (rho = −0.15; 95% CI, −0.34 to 0.06; P = 0.119; n = 117). Because the prespecified participant-level exposure–mediator and mediator–outcome associations were not supported, mediation analysis was not performed, and no indirect effect or causal brain–gut pathway was inferred.
Safety outcomes
Any adverse event occurred in 8/64 controls and 11/64 intervention participants (12.5% versus 17.2%; P = 0.456). Needle-site bruising occurred in 0 versus 5 participants (P = 0.023) and resolved without treatment; mild gastrointestinal discomfort occurred in 3 versus 6 participants (P = 0.300; Table 6).
Serious adverse events occurred in 3 controls and 2 intervention participants (P = 0.648). One death occurred in each group; no serious adverse event was judged definitely related to acupuncture or modified Xiaoxuming Decoction.
In summary, the combined intervention was associated with a modest improvement in day-28 NIHSS and selected day-28 biomarkers. Day-90 clinical differences were not statistically significant, and participant-level data did not support mediation through the measured biomarkers.
Figure 2: Clinical and biological sampling workflow. Blood and fecal specimens were collected for microbiome, short-chain fatty acid (SCFA), inflammatory, and gut barrier-related measurements. The workflow defines exploratory associations and does not assert a causal brain–gut mechanism. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 3: Clinical outcomes. (A) NIHSS trajectory; points are mean ± SD, with n shown at each time point. (B) Observed NIHSS change from baseline to day 28, presented as mean ± SD (control n = 59; intervention n = 58); the annotation reports the 30-imputation ANCOVA adjusted for baseline NIHSS, age, sex, reperfusion, and onset-to-randomization time. (C) Barthel Index, presented as mean ± SD, with n shown. (D) Observed-case day-90 mRS categories (control n = 57; intervention n = 56); percentages use observed denominators. P values are two-sided. No significance symbols are used. CI, confidence interval; MI, multiple imputation; SD, standard deviation. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 4: Exploratory biomarkers. Bars and points are mean ± SD. All randomized participants provided evaluable samples for the corresponding analyses; therefore, n = 64/group was available for every panel. Fecal samples were successfully collected and processed from all participants, including those requiring delayed collection within the prespecified collection window. (A) Shannon index and (B) fecal butyrate: day-28 baseline-adjusted linear models. (C) IL-6 and (D) LPS trajectories: day-14 Welch tests and day-28 baseline-adjusted models. (E) Selected day-28 genera: Welch tests with Benjamini–Hochberg correction across the three displayed genera; both nominal P and q values are shown. (F) Response components: Pearson chi-square tests. All P values are two-sided; no significance symbols are used. IL-6, interleukin-6; LPS, lipopolysaccharide; SCFA, short-chain fatty acid; SD, standard deviation. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 5: Participant-level exploratory associations. (A) Butyrate change versus NIHSS change (n = 117). (B) IL-6 change versus NIHSS change (n = 117). (C) LPS change versus IL-6 change (n = 128). Lines are shown for visualization only and do not represent regression-based inference. Statistical inference was based on Spearman's rho with 5,000 bootstrap resamples. (D) Spearman estimates with 5,000-resample bootstrap 95% CIs, including Shannon change versus NIHSS change (n = 117). No association met P < 0.05; therefore, mediation analysis was not performed. No significant symbols are used. Please click here to view a larger version of this figure.
| Variable | Control group (n = 64) | Intervention group (n = 64) | P value |
| Age, years | 65.1 ± 8.7 | 64.6 ± 9.0 | 0.775 |
| Male sex, n (%) | 40 (62.5) | 39 (60.9) | 0.855 |
| Onset to randomization, h | 41.7 ± 14.9 | 40.9 ± 15.7 | 0.773 |
| Baseline NIHSS score | 8.6 ± 2.6 | 8.4 ± 2.9 | 0.665 |
| Baseline Barthel Index | 43.5 ± 13.2 | 44.8 ± 12.7 | 0.573 |
| Hypertension, n (%) | 42 (65.6) | 41 (64.1) | 0.855 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 18 (28.1) | 17 (26.6) | 0.839 |
| Intravenous thrombolysis, n (%) | 16 (25.0) | 18 (28.1) | 0.690 |
| Mechanical thrombectomy, n (%) | 4 (6.3) | 5 (7.8) | 0.732 |
| hs-CRP, mg/L | 7.21 ± 4.18 | 7.04 ± 4.03 | 0.813 |
| IL-6, pg/mL | 24.03 ± 10.14 | 23.62 ± 9.96 | 0.817 |
| TNF-alpha, pg/mL | 30.5 ± 11.2 | 30.0 ± 11.0 | 0.799 |
| Shannon index | 2.84 ± 0.55 | 2.86 ± 0.56 | 0.833 |
| Fecal butyrate, µmol/g | 8.41 ± 3.99 | 8.53 ± 4.04 | 0.859 |
| LPS, EU/mL | 0.94 ± 0.34 | 0.93 ± 0.35 | 0.870 |
| Zonulin, ng/mL | 54.50 ± 15.60 | 54.11 ± 15.08 | 0.885 |
Table 5: Baseline demographic, clinical, and biomarker characteristics. This table summarizes baseline demographic, clinical, treatment-related, and biomarker characteristics in the control and intervention groups. Values are mean ± SD or n (%). Intravenous thrombolysis and mechanical thrombectomy are reported as separate standard-care categories.
| Safety Outcome | Control Group (n=64) | Intervention Group (n=64) | P Value |
| Any adverse event, n (%) | 8 (12.5) | 11 (17.2) | 0.456 |
| Needle-site bruising, n (%) | 0 | 5 (7.8) | 0.023 |
| Mild gastrointestinal discomfort, n (%) | 3 (4.7) | 6 (9.4) | 0.3 |
| Transient dizziness, n (%) | 2 (3.1) | 3 (4.7) | 0.648 |
| Mild rash, n (%) | 1 (1.6) | 2 (3.1) | 0.56 |
| Abnormal liver function, n (%) | 1 (1.6) | 2 (3.1) | 0.56 |
| Abnormal renal function, n (%) | 1 (1.6) | 1 (1.6) | 1 |
| Blood pressure fluctuation, n (%) | 2 (3.1) | 3 (4.7) | 0.648 |
| Palpitations, n (%) | 0 | 1 (1.6) | 0.315 |
| Serious adverse event, n (%) | 3 (4.7) | 2 (3.1) | 0.648 |
| Intervention-related serious adverse event, n (%) | 0 | 0 | -- |
| All-cause death, n (%) | 1 (1.6) | 1 (1.6) | 1 |
Table 6: Adverse events and serious adverse events. This table summarizes adverse events, serious adverse events, intervention-related serious adverse events, and all-cause death in the control and intervention groups. Values are presented as n (%).
DATA AVAILABILITY:
De-identified participant-level data supporting the reported clinical, biomarker, microbiome, adherence, and safety analyses are publicly available in Zenodo (https://zenodo.org/records/22725409).
Supplementary Table 1: Follow-up, adherence, and clinical outcomes. Observed and imputed analysis populations are labeled separately. The primary estimate uses 30-fold multiple imputation and ANCOVA adjusted for baseline NIHSS, age, sex, reperfusion, and onset-to-randomization time. CI, confidence interval; IQR, interquartile range; mRS, modified Rankin Scale; NIHSS, National Institutes of Health Stroke Scale.Please click here to download this file.
Supplementary Table 2: Exploratory biomarker results. Values are mean ± SD or n (%). Nominal P values and FDR-adjusted q values are distinguished. The composite response required at least two of four prespecified changes and is not clinically validated. Correlation analyses are exploratory; mediation analysis was not performed because the prerequisite participant-level associations were not significant.Please click here to download this file.
Supplementary File 1 : The raw data corresponding to Figures and tables.Please click here to download this file.
ディスカッション
統合プロトコルにより、早期の神経学的欠損にわずかな改善が見られ、多重代入法を用いたANCOVAでは、28日目のNIHSSにおいて−1.30ポイントの差であると推定されました。28日目のBarthel Indexおよび選定された28日目のバイオマーカーにも差が認められましたが、90日目のアウトカムは統計的有意性に達しませんでした。これらの知見は、統合介入を再灌流療法、抗血栓療法、リハビリテーション、またはその他の標準治療に代わるものではなく、その補助手段として評価することを支持するものです。
本試験で観察された臨床的効果は、鍼治療が症状の調節にとどまらず、脳卒中後の回復に寄与し得るという高まりつつある見解と一致している。先行研究では、急性虚血性脳卒中において鍼治療が神経機能を改善し、炎症活性を抑制する可能性が示唆されているが、その効果の大きさや持続性は研究によってばらつきがある21。本結果は、標準化された生薬処方との併用介入の一部として鍼治療を検討し、その臨床的効果を事前に定義された脳腸相関関連のバイオマーカーと結びつけることで、この一連のエビデンスを拡張したものである。効果量は劇的なものではなく緩やかなものであったが、これは解釈において重要である。NIHSSの調整後差が1点であることは、機能的および生物学的シグナルを伴う軽度から中等度の脳卒中においては意味を持つ可能性があるが、介入単独で回復が決定づけられたという証拠として解釈すべきではない。再現性に最も影響を与えるステップは、適格性判定のタイミングの統一、割り付けの隠蔽化、安全な刺鍼、標準化された煎剤の投与、盲検化によるアウトカム評価、および迅速かつ温度管理された検体処理である。一般的な運用上の問題としては、鍼治療セッションの欠席、不安全な嚥下、排便の遅延、および輸送中の融解が挙げられる。これらの問題は、延期の記録、不安全な場合の経口治療の中止、研究専用の下剤を用いずに次回の自然排便を採取すること、便秘および採取遅延の記録、ならびに処理工程および凍結融解履歴の追跡によって対処した。
28日目におけるShannon多様性、酪酸、IL-6、およびLPSの差は、グループレベルでの探索的な関連性であった。酪酸–NIHSS、IL-6–NIHSS、LPS–IL-6、およびShannon–NIHSSの関連性に関する参加者レベルの探索的解析では、媒介分析に必要な前提条件となる関係性が支持されなかった。したがって、媒介分析は実施せず、本データによって因果的な脳-腸経路が立証されたわけではない。ショットガンメタゲノミクス、同位体標識標準物質を用いたターゲットメタボロミクス、連続的な食事記録、およびバイオマーカーの反復サンプリングを含む代替アプローチを用いれば、16S rRNAシーケンシングおよび2つの糞便採取時点での解析よりも、機能と時間的順序をより直接的に特性づけることができると考えられる22,23,24。
本研究の解釈は、単一施設でのサンプル採取、参加者の盲検化の欠如、登録前の前向き試験登録の不在、および鍼治療のみまたは煎じ薬のみの群を設けない複合介入デザインによって制限される。したがって、このデザインでは、効果を特定の構成要素や相乗効果に帰属させることはできない。日常的な食事、嚥下障害の重症度、経腸栄養、ランダム化後の抗菌薬使用、プロトンポンプ阻害薬の使用、便秘、リハビリテーションの強度、および入院期間が、マイクロバイオームの結果に影響を及ぼした可能性がある。これらの要因は調整済みマイクロバイオームモデルに含まれていないため、潜在的な残留交絡因子として残っている。選択された属に対するFDR補正は、表示された3つの属に限定されており、探索的な反応閾値は外部検証されていない。バイオマーカー解析は探索的なものであり、一部のIL-6およびTNF-alpha濃度は製造会社の公称測定範囲を下回っていたため、慎重に解釈されるべきである。
今後の研究では、前向き登録、多施設共同での被験者募集、要因設計、ソースで検証された併用介入データ、標準化された食事・曝露情報の収集、および独立して再現可能なマイクロバイオームおよびメタボロミクス解析パイプラインを用いるべきである。媒介分析、治療成分の効果、またはマイクロバイオームに基づく治療選択を検証する前に、より大規模なサンプル数とより頻回なサンプリングが必要である。安全性モニタリングにより、介入に明確に関連する重大な有害事象は認められなかったが、サンプル数が少なすぎたため、稀な有害事象を排除することはできなかった。鍼治療および漢方治療を急性期脳卒中治療に統合する際は、出血リスク、嚥下安全性、胃腸不耐症、肝・腎機能、血圧、および不整脈に特に注意を払う必要がある。
結論として、標準的な治療に加えて標準化された鍼治療と改良版小消明湯を併用したところ、28日目の神経学的改善が緩やかに認められ、特定のバイオマーカーに差異が見られました。これらの生物学的な結果は仮説を提示するものであり、脳腸相関による因果関係を証明するものではありません。
開示事項
著者は競合する利益がないことを宣言します。
著者 貢献度:
Zhiqiang Huangは、概念化、手法、調査、データキュレーション、および原稿の初稿執筆に貢献した。Bo Wangは、形式的分析、ソフトウェア、視覚化、および原稿の校閲・編集に貢献した。Zhen Chenは、調査、リソース提供、および検証に貢献した。Aiping Wangは、調査、データキュレーション、およびプロジェクト管理に貢献した。Longhai Wangは、概念化、監督、プロジェクト管理、および原稿の校閲・編集に貢献した。すべての著者が最終原稿を承認した。
謝辞
著者らは、参加者の募集、臨床ケア、およびデータ収集においてご支援をいただいた四川省大州市の中西医結合病院の臨床および研究スタッフに心より感謝いたします。また、本ランダム化比較試験にご協力いただいた患者様およびそのご家族に感謝申し上げます。本研究は、公的、商業的、または非営利セクターのいかなる資金提供機関からも特定の助成金を受けていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4-メチル吉草酸 | Sigma-Aldrich, USA | 142342 | GC-MS内部標準物質 |
| 16S rRNA遺伝子プライマー（V3–V4領域) | Sangon Biotech（中国） | カスタム合成 | 341F/806Rプライマーペア |
| 鍼針 | 華拓（蘇州医療器具工場）、中国 | 0.25 × 40 mm | 滅菌済み使い捨てステンレス製針 |
| バーセル指数による評価 | 該当なし | 該当なし | 日常生活動作評価 |
| 凍結保存チューブ | Corning, USA | 430659 | 糞便検体の保存 |
| 酢酸エチル（クロマトグラフィーグレード） | Merck, ドイツ | 109623 | 有機抽出溶媒 |
| フィルター付きピペットチップ | Axygen, USA | 各種 | RNase/DNaseフリー |
| ガスクロマトグラフ | Agilent Technologies（米国） | 7890B GC | GC分離システム |
| ヒトIL-6 ELISAキット | R&D Systems, USA | D6050 | 血清中IL-6の定量 |
| ヒトリポ多糖 (LPS) ELISAキット | Cusabio（中国） | CSB-E13066h | 血清LPSの定量 |
| ヒトTMAO測定キット | Sigma-Aldrich, USA | MAK264 | 比色法/蛍光法によるTMAO定量 |
| 質量選択検出器 | Agilent Technologies、米国 | 5977B MSD | 四重極質量分析計 |
| MassHunter ワークステーション ソフトウェア | Agilent Technologies, USA | G1701EA | GC-MSデータの取得および解析 |
| マイクロピペット | Eppendorf（ドイツ） | リサーチ・プラス・シリーズ | 研究室における液量操作 |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles) | Illumina, USA | MS-102-3003 | ペアエンド 2 × 300 bp シークエンシング |
| MiSeqシステム | Illumina（米国） | SY-410-1003 | ペアエンドシーケンシングプラットフォーム；2 × 300 bp シーケンシング化学 |
| 修正ランキンスケール（mRS）評価 | 該当なし | 該当なし | 90日目の機能的アウトカム評価 |
| 加味消腫湯（生薬処方） | 大州市中西医结合医院 薬剤部 | 該当なし | 施設薬剤部の基準に従って調製され、病院薬剤師によって認証および調剤された。 |
| NIHストロークスケール（NIHSS）評価フォーム | 国立神経疾患・脳卒中研究所 | 該当なし | 標準化臨床評価尺度 |
| NumPy | NumPy開発者 | RRID: SCR_008633 | バージョン 1.26.x |
| pandas | pandas開発チーム | RRID: SCR_018239 | バージョン 2.1.x |
| リン酸 | Sigma-Aldrich, USA | 79619 | 分析用試薬 |
| Python | Python Software Foundation | RRID: SCR_008394 | バージョン 3.11.x |
| QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit | Qiagen（ドイツ） | 51804 | 糞便マイクロバイオームDNA抽出 |
| QIIME 2 | QIIME 2開発チーム | RRID: SCR_008249 | バージョン 2024.5 |
| Qubit dsDNA HS アッセイキット | Thermo Fisher Scientific（米国） | Q32851 | 蛍光ベースのDNA定量 |
| scikit-learn | scikit-learn開発者 | RRID: SCR_002577 | バージョン 1.4.x |
| SciPy | SciPy開発者 | RRID: SCR_008058 | バージョン 1.11.x |
| SILVA rRNAデータベース | SILVAプロジェクト | RRID: SCR_006423 | バージョン 138.1 |
| 超低温冷凍庫 | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | −80 °C 保存 |
参考文献
- GBD 2019 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Neurol. 2021;20(10):795-820. doi:10.1016/S1474-4422(21)00252-0.
- Campbell BCV et al. Ischaemic stroke. Nat Rev Dis Primers. 2019;5(1):70. doi:10.1038/s41572-019-0118-8.
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