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方法論記事

造影剤誘発急性腎障害ラットモデルにおける、造影後N-アセチルシステインおよびモンテルカスト投与による腎保護効果

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DOI:

10.3791/73087

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2026年9月3日

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1Department of Emergency Medicine, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine, 2Department of Histology and Embryology, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、造影剤誘発性急性腎障害のラットモデルを提示し、造影後におけるN-アセチルシステインおよびモンテルカストの単独投与および併用投与の効果を評価します。治療レジメンにより、腎機能障害、酸化ストレス、炎症、および組織病理学的損傷の程度が軽減されましたが、併用療法が単剤療法を一貫して上回る結果は見られませんでした。

要約

造影剤誘発性急性腎不全（CI-AKI）は、ヨード造影剤への曝露によって引き起こされる重要な合併症であり、酸化ストレスと炎症プロセスが腎損傷に寄与します。本研究では、CI-AKIのラット実験モデルを構築し、造影剤投与後に開始したN-アセチルシステイン（NAC）、モンテルカスト、またはその併用療法の効果を検討しました。成体雄性Wistarラットに水分制限を行い、続いてNω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME）、インドメタシン、およびイオヘキソールを順次静脈内投与しました。治療は、イオヘキソール投与完了の1時間後（L-NAME投与から約1.5時間後）に開始し、3日間連続で1日1回実施しました。腎機能指標、酸化ストレスパラメータ、炎症性サイトカイン、腎損傷バイオマーカー、および腎臓の組織病理学的評価を行いました。未治療のCI-AKI群では、顕著な腎機能不全、好ましくない酸化ストレスおよび炎症プロファイル、ならびに重大な組織病理学的損傷が認められました。未治療のCI-AKI群と比較して、NAC、モンテルカスト、または併用療法を受けた動物では、一般的に生化学的および組織病理学的所見の改善が見られました。グルタチオン（GSH）値は併用群で最も高く、平均組織病理学的損傷スコアは数値的に最も低かったものの、評価した全項目において併用療法が単剤療法を一貫して上回ることはありませんでした。本プロトコルは、CI-AKIにおける造影後介入を評価するための制御された前臨床的枠組みを提供するものであり、得られた知見は、臨床的有効性や併用特有の優位性を確立することなく、NACおよびモンテルカストのさらなる実験的調査を正当化するものです。

概要

急性腎障害（AKI）は、入院患者の経過において頻繁に合併し、罹患率、死亡率、および医療資源の利用増大の一因となります。ヨード造影剤は診断画像診断やインターベンション手技で日常的に使用されているため、造影剤曝露後の腎機能悪化は重要な臨床的懸念事項となっています。現在の用語定義では、造影剤投与後に発生したあらゆるAKIのエピソードを包含する造影剤関連急性腎障害（CA-AKI）と、腎損傷が造影剤に起因すると因果関係が認められる造影剤誘発急性腎障害（CI-AKI）が区別されています。造影剤への曝露が腎損傷に直接結びつく制御された実験モデルにおいては、したがってCI-AKIという用語が引き続き広く用いられています1,2。

慢性腎臓病、糖尿病、高齢、心不全、またはその他の心血管系併存疾患を有する患者は、特に造影剤誘発急性腎不全（CI-AKI）を起こしやすい。影響を受けた患者の多くは腎機能が回復するが、より重症の症例では、持続的な腎機能障害、腎代替療法の必要性、および死亡リスクの上昇が生じる可能性がある。また、CI-AKIは入院期間の長期化および医療資源の利用増大とも関連している。これらの悪影響は、造影剤に関連した腎障害に対する効果的な予防および治療法の開発が引き続き必要であることを強調している。1,3,4,5.

CI-AKIの発症には、腎血流の変動、髄質の酸素不均衡、酸化ストレス、炎症、および直接的な尿細管毒性を含む、相互に関連した複数のプロセスが関与しています。造影剤への曝露は、腎血管の緊張を血管収縮側にシフトさせると同時に血管拡張反応を弱め、その結果、腎血流を減少させます。外髄質は、生理的条件下ですでに酸素供給が制限されているため、特に脆弱な領域です。したがって、造影剤投与後に酸素供給がさらに低下すると、低酸素性尿細管障害が誘発される可能性があります2,6,7。

造影剤への曝露後に起こる腎低酸素状態は、活性酸素種（ROS）の生成増加を伴い、これが腎障害に大きく寄与します。ROSの生成が内因性の抗酸化能を超えると、細胞内の脂質、タンパク質、およびDNAに酸化損傷が生じると同時に、炎症性シグナル伝達が亢進します。実験的および臨床的な設定の両方において、造影剤の投与は酸化ストレスパラメータの上昇および抗酸化防御能の低下に関連しています。この反応に関与する分子経路には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼ依存的なラジカル形成および核内因子カッパB（NF-κB）の活性化が含まれます1,6,8,9。

炎症の関与は、CI-AKIが血行動態の乱れのみで説明できないことを示唆しています。最近のエビデンスでは、造影剤曝露後の腎傷害にフェロトーシス、ニトロソストレス、および好中球細胞外トラップが関与していることも明らかになっています。これらの追加メカニズムが認識されたことで、CI-AKIの予防および治療に向けて研究されている分子標的の範囲が広がっています1。

血清クレアチニン値と尿量でCI-AKIを同定するのが一般的ですが、どちらも腎損傷が既に進行した後にのみ変化することがあります。このような限界があるため、尿細管損傷を反映するkidney injury molecule-1 (KIM-1) や、糸球体濾過の変化に関連するシスタチンCなど、より早期の指標の評価が進められてきました。実験的および臨床的研究の証拠から、これらのバイオマーカーの変化はCI-AKIの早期段階で検出可能になり、それによって腎損傷のより早期の評価を支援できることが示されています9,10,11。

造影剤誘発急性腎不全（CI-AKI）の病態生理に関する理解が進んだことで、酸化および炎症経路を標的とした薬理学的介入の評価が進められてきました。適切な水分補給が依然として主要な予防策である一方、薬剤を用いたアプローチで報告されている有益性は研究によってばらつきがあります。その結果、CI-AKIに対する標準的な臨床的介入として採用されるほどの十分かつ一貫した有効性を示した薬理学的治療は、まだ存在しません1,4,12,13。

N-アセチルシステイン (NAC) は、造影剤誘発急性腎障害 (CI-AKI) を抑制するための薬理学的アプローチとして広く評価されてきました。提案されている腎保護効果は、活性種の消去およびグルタチオン貯蔵の回復に関連しています。初期の臨床的な支持は、慢性腎臓病患者を対象とした画期的な研究から得られ、そこでは NAC が造影剤に関連する腎機能障害の発症率を低下させることが示されました14。しかし、その後の臨床試験やエビデンスの統合では、一部の研究で有益性が報告される一方で、他の研究では有意な臨床的効果が認められないなど、一貫性のない結果となりました。したがって、CI-AKI に対する NAC の有効性は不確実なままです12,15,16,17。

モンテルカストはシステイニルロイコトリエン受容体-1を選択的に遮断し、長年、喘息やアレルギー性疾患の治療に使用されてきました。また、実験的な証拠により、本剤が抗炎症作用、抗酸化作用、および抗アポトーシス作用を有することが示されています。腎障害のさまざまなモデルにおいて、モンテルカストの投与は、脂質過酸化の抑制、内因性抗酸化防御の強化、組織病理学的損傷の軽減、および腎損傷の減弱に関連しています18,19,20,21,22。

CI-AKIにおけるモンテルカストを具体的に検証したエビデンスは依然として限られています。得られている実験的知見は、その腎臓への影響に酸化ストレスおよび炎症シグナルの調節が関与している可能性を示唆しています。NADPHオキシダーゼ4（NOX4）、p22phox、およびNF-κBの発現低下が、モンテルカストが造影剤誘発腎障害を軽減させる一つのメカニズムとして提案されています9。

NACとモンテルカストは、腎障害に関与する、部分的に異なりつつも重複する経路に影響を及ぼします。NACは主に抗酸化防御をサポートする一方、モンテルカストは抗炎症作用と抗酸化作用の両方を併せ持っています。したがって、これらの薬剤を併用することで、CI-AKIの病態生理における複数の構成要素に影響を与える可能性がありますが、その相互作用が相加的または相乗的な利益をもたらすかどうかは、実験モデルにおいて確立されていません18,19,20,21,22

これまでの研究では、主に造影剤への曝露前に投与される介入策が評価されてきましたが、曝露後に開始される治療に関するエビデンスは不足しています。特に、実験的CI-AKIにおけるモンテルカストとNACの造影後投与については、十分な調査が行われていません。したがって本研究では、造影剤曝露後に単独または併用して投与したモンテルカストおよびNACについて、腎機能、酸化ストレスパラメータおよび抗酸化防御、腎損傷および炎症バイオマーカー、ならびにCI-AKIラットモデルにおける組織病理学的変化について評価しました。

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プロトコル

動物を用いたすべての実験手順は、実験動物の飼育および使用に関する国際的に認められたガイドラインに従って実施され、Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) ガイドラインに準拠して行われました。実験プロトコルは、トルコ、クルシェヒルの Ahi Evran University 動物実験地域倫理委員会によって承認されました（決定番号2、会議番号12、日付：2025年6月12日）。研究全体を通じて、動物の苦痛を最小限に抑え、使用する動物数を削減するためにあらゆる努力が払われました。使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に記載されています。

化学薬品の調製

本研究では、Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)、インドメタシン、イオヘキソール、モンテルカストナトリウム、およびNACを使用した。L-NAME溶液（10 mg/mL）は、100 mLの滅菌0.9%生理食塩水に1 gのL-NAMEを溶解して調製した。本溶液は投与当日に調製し、当日中に使用した。実験的CI-AKIモデルの導入のため、L-NAMEを10 mg/kgの用量で静脈内投与（IV）した。体重約220 gのラットにおける算出量は約2.2 mgであり、投与量に相当する液量は約0.22 mLであった。インドメタシンは、100 mgを最終容量10 mLの5%炭酸水素ナトリウム溶液に溶解させ、濃度10 mg/mLで調製した。調製液は、視覚的に均一になるまでボルテックスミキサーで撹拌した。調製したインドメタシン溶液の最終pHは実験中に測定しなかったため、遡及的に決定することはできなかった。調製したインドメタシン溶液に関する特定の滅菌またはろ過の手順は実験記録に記載されておらず、そのため遡及的に報告することはできなかった。正式な安定性期間は設定および評価しておらず、溶液は当日中に調製して使用した。実験的CI-AKIモデルを導入するため、インドメタシンを10 mg/kgで静脈内投与した。体重約220 gのラットにおける算出量は約2.2 mgであり、投与量に相当する液量は約0.22 mLであった。

647 mg iohexol/mLを含有し、ヨウ素相当濃度が300 mg/mLである市販のiohexol製剤を、追加希釈せずに投与した。注入時のiohexolの正確な温度は記録されていない。製剤固有の浸透圧値については、利用可能な実験記録から確実に確認できなかったため、ここでは報告しない。実験的CI-AKIモデルを誘導するため、iohexolを3 g iodine/kgの用量で静脈内投与した。体重約220 gのラットにおいて、この用量は約0.66 gのヨウ素に相当し、注入量としては約2.2 mLとなった。

0.5% カルボキシメチルセルロース (CMC) 中にモンテルカストナトリウム懸濁液を調製した。これは各投与日に調製し、投与直前にボルテックスミキサーで撹拌することで、懸濁粒子の均一な分散を得た。各個体に必要とされるモンテルカスト投与量は、試験開始時に記録した体重に基づき、以下の計算式を用いて個別に算出した：必要投与量 (mg) = 体重 (kg) × 10 mg/kg。体重が約 220 g の動物の場合、算出された投与量は約 2.2 mg であり、経口ゾンデを用いて投与した。投与前に懸濁液を目視で点検し、沈殿が見られる調製物は使用前に再度ボルテックス撹拌を行った。

NACを、市販の製剤からさらなる希釈を行わずに、100 mg/kgの腹腔内投与量で処置群に投与した。各個体に対し、試験開始時に記録した体重から必要投与量を個別に算出した。体重が約220 gの個体では、これは約22 mgのNACと約0.15 mLの投与量に相当した。投与前に溶液を視覚的に検査し、透明で可視粒子が含まれていない調製液のみを使用した。

各調製液は、投与前に目視検査を行った。L-NAME、インドメタシン、イオヘキソール、およびNAC溶液について、変色および可視粒子がないかを確認した。投与直前にモンテルカスト懸濁液をボルテックスし、均一であることを目視で確認した。これらの判定基準を満たさない調製液は使用しなかった。すべての化学物質の調製および投与時には、白衣、保護手袋、および眼保護具を着用した。すべての手順は、機関の実験室安全およびバイオセーフティ要件に従って実施した。

動物の選択、飼育、実験群およびランダム化

トルコのクルシェヒルにあるAhi Evran大学の実験動物研究ラボから、成齢のWistar albinoラット雄30匹（8～12週齢、体重 200–220 g）を入手した。以前に報告された実験的CI-AKIモデルとの方法論的一貫性を維持し、発情周期の段階という追加の生物学的変数の導入を避けるため、雄ラットを選択した。本研究において、性は実験変数として評価されていない。動物施設は繁殖・生産ライセンスNo. 184を保有しており、ラットは標準的なラボ条件下でそこで繁殖および飼育された。登録時において、動物に特定の無菌（SPF）ステータスやその他の正式な微生物学的健康分類の記録はなかった。各ラットは、粗く刻んだパイン材の削り節を敷材とした 40 cm × 25 cm × 20 cm のポリカーボネート製ケージで個別に飼育した。室温は自動環境制御および換気システムにより 24 °C ± 2 °C、相対湿度は 35% ± 10% に維持した。12時間の明期／12時間の暗期スケジュールを適用し、照明は 07:00 から 19:00 までとした。7日間の馴化期間およびその後の実験期間中、専用の環境エンリッチメントは提供しなかった。CI-AKI誘導前の規定の16時間水制限期間を除き、標準的なペレット状の齧歯類用飼料と水道水を自由摂取させた。飼料組成は、粗タンパク質 24%、粗セルロース 3.94%、粗脂肪 5.08%、粗灰分 8.8%、リシン 1.44%、メチオニン 0.61%、カルシウム 1.14%、リン 0.89%、ナトリウム 0.28% であった。すべての動物は、実験 procedure を開始する前に7日間馴化した。馴化期間および実験期間の両方において、全身状態、餌および水の摂取量、運動能、姿勢、被毛の外観、および苦痛の兆候を評価するために、日次観察を行った。選択バイアスを最小限に抑えるため、コンピュータで生成したランダム割り付けシーケンスを用いて動物を5つの実験群に割り付け、各群に6匹を配分した。サンプルサイズは、G*Power version 3.1.9.6 を用いた事前パワー分析によって決定した。

サンプルサイズは、5つの実験群を含む固定効果の一元配置分散分析のための事前パワー分析によって決定されました。効果量 (f) を0.65、第I種の過誤率 (α) を0.05、統計的パワーを80%と想定し、必要とされる総サンプルサイズを30匹（1群あたり6匹）と算出しました。効果量 (f = 0.65) は、5群間の比較において全体として大きな群間効果を表すものとして事前に想定されました。この算出は、そのような全体的な効果を検出するために必要なサンプルサイズを決定することを目的としており、活性治療群間のより小さなペアワイズの差を検出することを具体的に目的としたものではありません。すべての解析において、個々の動物を実験単位と見なしました。

日常的な飼育、毎日の健康モニタリング、および最終処置を除き、対照群（Control group）の動物には、プロトコルに関連するハンドリングや拘束、水制限、静脈内または腹腔内注射、経口投与、あるいは溶媒の投与は行わなかった。CI-AKI群は、8日目にCI-AKIモデルを作製し、治療を行わなかった動物で構成された。CI-AKI + Montelukast群は、CI-AKIモデルを作製し、その後モンテルカストで治療した動物で構成された。CI-AKI + NAC群は、CI-AKIモデルを作製し、その後NACで治療した動物で構成された。CI-AKI + Montelukast + NAC群は、CI-AKIモデルを作製し、その後モンテルカストとNACの併用療法で治療した動物で構成された。対照群および未治療のCI-AKI群には、治療に合わせたシャム処置は行わなかった。具体的には、これらの群において、シャムハンドリング、シャム経口投与、シャム治療注射、または治療に合わせた溶媒投与は実施しなかった。L-NAME、インドメタシン、モンテルカストの調製に使用した溶媒は、「化学物質の調製」の記載通り、それぞれ0.9%生理食塩水、5%炭酸水素ナトリウム溶液、および0.5% CMCであった。NACは市販の製剤をそのまま投与し、NAC用の個別の溶媒は調製しなかった。8日目に、対照群を除くすべての動物に16時間の水制限を行い、続いてL-NAME（10 mg/kg）、インドメタシン（10 mg/kg）、およびイオヘキソール（3 g iodine/kg）を順次静脈内投与して、造影剤誘発急性腎障害（CI-AKI）を誘発させた。指定の治療群では、8日目のイオヘキソール投与完了から1時間後（L-NAME投与から約1.5時間後）に、モンテルカスト（10 mg/kg、経口投与）および/またはNAC（100 mg/kg、腹腔内注射）を初回投与し、その後9日目と10日目の同時刻に1日1回投与した。

薬剤投与プロトコル

CI-AKIは、16時間の水分制限後、L-NAME、インドメタシン、およびイオヘキソールを順次静脈内投与するという、既報の実験プロトコルに従って作製された。23,24,25L-NAMEおよびインドメタシンをそれぞれ10 mg/kg投与し、イオヘキソールは3 g iodine/kgで投与した。治療用量は、モンテルカストナトリウムを10 mg/kg、NACを100 mg/kgとした。モデル誘導および治療の投与量の選択は、既報の実験研究に基づいた。22,26,27事前の用量設定試験および用量最適化試験は実施しなかった。NACおよびモンテルカストの用量は、各薬剤に関する既報の実験的研究に基づいて個別に選定したものであり、併用療法に特化した用量設定試験から導出したものではない。選定した用量は、薬理学的に等価な曝露量を代表させることを意図したものではなく、用量反応分析および正式な薬物相互作用分析も実施しなかった。個体レベルでモデル導入の成功を定義するための、事前に指定した数値的または臨床検査学的閾値は使用しなかった。研究終末点において、対照群と比較して、未治療のCI-AKI群に観察された特徴的な組織病理学的変化により、腎障害が正常に誘導されたことが裏付けられた。8日目に、対照群を除くすべての動物に対し、造影剤誘発急性腎障害の導入直前に1回のみ16時間の水分制限を行った。実験期間の残りの期間において、水分制限は繰り返さなかった。水分制限期間中、標準的なペレット状飼料は随時自由に取り込める状態で維持した。16時間の水分制限期間の終了後、最初のモデル導入剤であるL-NAMEを投与する前に、水分制限を行ったすべての実験群において、水道水へのアクセスを同時に、かつ随時自由に回復させ、その後も実験期間終了までこれを維持した。水分の回復タイミングおよび条件は、水分制限を行ったすべての群で同一とした。回復後の水分摂取量は、あらかじめ定義した容量に制限せず、定量的な測定も行わなかった。16時間の水分制限期間の直前および直後の体重を対照的に測定しなかったため、脱水に伴う体重減少率は算出できなかった。尿量についても定量的なモニタリングは行わなかった。水分の回復後、CI-AKIの導入を開始した。L-NAME、インドメタシン、およびイオヘキソールの連続的な静脈内投与はすべて、滅菌済み5 mLシリンジに取り付けた26 G針を用いて、尾側尾静脈から行った。静脈内投与の前に、尾側尾静脈の可視化と拡張を促進するため、数分間温水で尾部を温めた。各静脈内投与後、0.5 mLの滅菌0.9%生理食塩水で静脈内をフラッシュした。 さらに 各モデル誘発剤の算出投与量に従い投与した。投与およびフラッシングの間、注射部位に腫脹、漏出、または血管外漏出の徴候がないか視覚的にモニターした。まずL-NAME（10 mg/kg）を投与した。L-NAME投与の15分後、同じ側尾静脈からインドメタシン（10 mg/kg）を静脈内投与した。インドメタシン投与の15分後、同じ側尾静脈からイオキソールを3 g iodine/kgの用量で静脈内投与した。各動物について、イオキソールの用量および対応する注入量は、試験開始時に記録された体重と、市販のヨウ素濃度300 mg iodine/mLに基づき、個別に算出した。これは10 mL/kgの投与量に相当し、したがって体重200～220 gのラットでは約2.0～2.2 mLとなった。プロトコルで定義された静脈内投与の最大許容量は個別に設定しておらず、本研究で使用された単一薬剤の最大の静脈内投与量はイオキソールの10 mL/kgであった。イオキソールは約1～2分かけてゆっくりと投与した。注射部位に視覚的な腫脹、漏出、または血管外漏出がないことを確認し、静脈内投与が成功したことを検証した。部分的な血管外漏出は観察されず、血管外漏出の疑いにより再試行または再投与が必要となった注入はなかった。イオキソール投与の完了から1時間後、治療群に指定の治療薬を最初に投与した。イオキソールの投与はL-NAME投与の30分後に開始され、約1～2分かけて完了したため、治療の開始はL-NAME投与から約91～92分（約1.5時間）後となった。モンテルカストナトリウム（10 mg/kg）は経口投与し、NAC（100 mg/kg）は腹腔内投与した。

22 Gステンレス製経口投与用カニューレを用いて経口ガバージを行った。各個体を直立状態で保持し、経口投与用カニューレを食道経由で胃までゆっくりと挿入した。過度な抵抗がある場合は、投与前にカニューレを一度抜き、位置を調整した。ガバージ中および直後に、逆流がないか観察した。すべての個体において、ガバージ中および直後に逆流やその他の不完全な経口投与の兆候は見られず、経口投与の失敗が疑われたために除外された個体はなかった。腹腔内投与は腹部の右下領域に行った。針を約30°–45°の角度で挿入し、投与前に吸引を行い、不注意に血管内へ入っていないかを確認した。投与中および直後に、投与部位に漏出、出血、またはその他の視認可能な合併症がないか視覚的にモニタリングした。指定された治療は、8日目、9日目、および10日目の同時刻に1日1回投与した。したがって、CI-AKI + Montelukast群の個体にはモンテルカストを3日間連続で1日1回投与し、CI-AKI + NAC群の個体にはNACを3日間連続で1日1回投与し、CI-AKI + Montelukast + NAC群の個体にはモンテルカストとNACの両方を、同様の3日間の治療スケジュールに従って1日1回投与した。すべてのモデル誘導および治療投与は、同一の研究者が行った。体重は研究開始時に各個体につき1回測定し、実験期間中は再測定しなかった。各個体について、すべてのモデル誘導剤および研究治療薬の投与量および対応する投与量は、研究開始時に記録された体重を用いて個別に算出した。すべての静脈内投与、腹腔内投与、および経口ガバージの手順は、投与に関連するばらつきを最小限に抑えるため、同一の標準化された手法を用いて行った。

安楽死処置、人道的エンドポイント、および試料採取

実験期間中、動物の全身状態、食物および水の摂取量、運動能、姿勢、被毛の外見、および苦痛の徴候について、1日1回の観察を行った。あらかじめ定義した人道的エンドポイントは、顕著な嗜眠、利用可能な食物または水の摂取不能、異常姿勢、運動能の低下、持続的な立毛、およびその他の明白な苦痛の現れとした。これらの基準のいずれかに該当した動物は直ちに安楽死させることとしたが、本研究期間中に人道的エンドポイント基準に該当した動物はいなかった。最終投与から24時間後の11日目に、ケタミン (80 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) を腹腔内投与し、深い麻酔を誘導した。足底の逃避反射の消失をもって、十分な麻酔深度にあることを確認した。十分な麻酔深度が確認された後、心臓穿刺により各動物から約 3–5 mL の血液を採取した。その後、動物が深い麻酔下にある状態で、失血により安楽死を完結させた。心拍および自発呼吸の双方が消失したことで、死亡を確認した。

血清生化学的測定用に採取した血液は、抗凝固剤不含のチューブに入れ、凝固が完了するまで放置した。その後、チューブを4 °Cで3,000 × g、10–15分間遠心分離し、血清画分を分離して分析まで−80 °Cで保存した。グルタチオン測定用のサンプルは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含むチューブに別途採取した。これらの検体は抗凝固処理されているため、対応するグルタチオン測定手順に従い、凝固工程を経ずに処理した。回収された血清が透明であり、溶血の視覚的な証拠が認められない場合に、血清分離が適切であると判断した。

死亡を確認後、正中切開を行い、各動物から両腎臓を慎重に摘出した。検体から周囲の脂肪組織および結合組織を除去した。右腎は病理組織学的検査のみに使用し、左腎は生化学的分析に割り当てた。左腎の組織は、腎皮質と腎髄質を個別に分離せず、混合組織として分析した。2つの腎臓は独立して取り扱い、異なる動物からの検体は、プールすることなく処理全体を通じて分離したままにした。右腎全体を10%中性緩衝ホルムアルデヒドに浸し、病理組織学的評価のために処理した。腎皮質および外髄質を含む切片を作成し、「病理組織学的処理およびスコアリング」に記載の手順に従って検査した。各左腎には個別にラベルを付け、ホモジナイズおよび生化学的試験まで-80 °Cで保存した。摘出後、組織の肉眼的な完全性を確認し、予定している病理組織学的および生化学的評価に十分な量の組織を確保した。

モデルの誘導および薬剤投与を担当した研究者は、実験群によって手順が異なるため、盲検化することができませんでした。しかし、生化学的分析および統計分析を行う研究者、ならびに組織病理学的評価を行う病理医には、群の構成は秘匿されました。登録されたすべての動物は研究に維持され、その後の分析に含まれました。生体試料、動物組織、ホルムアルデヒドベースの固定液、およびその他の化学廃棄物は、適切な個人用保護具を用いて取り扱われました。すべての生物学的および化学的廃棄物の処理は、施設のバイオセーフティおよび有害廃棄物管理規定に従って実施されました。

生化学的分析

生化学的測定は、各動物から採取した血清、EDTA抗凝固血、および左腎組織ホモジネートを用いて実施されました。手順は、各パラメータに使用した生物学的マトリックスに従って以下に示します。血清については、尿素、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニン、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、およびマロンジアルデヒド（MDA）を分析しました。尿素、BUN、およびクレアチニンを腎機能指標とし、SOD活性およびMDA濃度を酸化ストレスパラメータとして評価しました。血清尿素およびBUN値は、同一の酵素的ウレアーゼ-グルタミン酸脱水素酵素法を用いて得られました。この方法では、ウレアーゼによって尿素が加水分解されてアンモニアが生成され、それがグルタミン酸脱水素酵素の存在下で2-オキソグルタリン酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）と反応します。分析法には酵素的ウレアーゼ-グルタミン酸脱水素酵素速度論的アッセイを用いました。NADHの消費に伴う吸光度の減少を、分光光度計を用いて速度論的に測定しました。血清クレアチニン濃度は、自動生化学分析装置を用いて比色法で測定しました。血清SOD活性は、市販のアッセイキットを用い、同一の自動生化学分析装置で比色法により測定しました。SODアッセイは、キサンチン-キサンチンオキシダーゼ系によるスーパーオキシドラジカルの生成と、それが2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニルテトラゾリウムクロリドと反応して有色ホルマザン生成物を形成することに基づいています。エンドポイント吸光度を505 nmで測定し、SOD活性をU/mLとして算出しました。血清MDA濃度は、チオバルビツール酸反応を用いて比色法で決定しました。血清試料を冷チクロロ酢酸と混合してタンパク質を沈殿させ、得られた沈殿物を遠心分離により分離しました。この遠心分離ステップは、4 °Cで7,500 × g、5分間で行いました。上清を90 °Cで60分間チオバルビツール酸と反応させ、冷却後、532 nmで測定しました。MDA濃度は対応する検量線から算出し、nmol/mLとして表記しました。グルタチオン（GSH）分析は、EDTA抗凝固血を用いて行いました。チクロロ酢酸でタンパク質を沈殿させ、得られた脱タンパク質試料を改良エルマン法により比色分析しました。試料をpH 8.2の500 mM Tris緩衝液中で5,5′-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）と混合しました。GSHのチオール基とDTNBの反応により有色生成物が生成され、吸光度を412 nmで記録しました。カタラーゼ（CAT）活性は、2段階の比色法を用いて決定しました。まず、試料を既知量の過酸化水素とともにインキュベートし、カタラーゼによって過酸化水素を水と分子状酸素に変換させました。酵素反応を停止させた後、残存する過酸化水素を発色試薬を用いて測定しました。吸光度を405 nmで記録し、CAT活性をU/mLとして報告しました。腎組織の測定には、各動物の左腎を、皮質と髄質を分離せずに混合組織として使用しました。手順に記載の通り、右腎は組織病理学的評価のためのみに保持されました。個体別の試料は独立して処理され、どの段階においてもプールすることはありませんでした。各左腎検体は、組織と緩衝液の比率を1:10 (w/v)とし、pH 7.4の50 mM リン酸緩衝液中で氷上でホモジナイズしました。ラット1匹につき1つの個体特異的な腎組織ホモジネートを作成しました。このホモジネートの別々のアリコートを異なる腎組織測定に使用し、すべてのパラメータが同一の個体動物に由来することを確認しました。得られた腎組織ホモジネートを、4 °Cで14,000 × g、10分間遠心分離しました。遠心分離後、各動物から得られた上清を個別に回収し、計画した腎組織分析用のアリコートに分割しました。腎組織上清中の腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターロイキン-1ベータ（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、シスタチンC、およびKIM-1濃度は、ラット特異的酵素結合免疫吸着法（ELISA）キットを用いて測定しました。アッセイは製造元のプロトコルに従って実施しました。TNF-α、IL-1β、IL-6、シスタチンC、およびKIM-1のELISAのインキュベーション条件は同一でした。各アッセイにおいて、試料とELISA試薬を37 °Cで1時間インキュベートし、5回の洗浄サイクルの後、基質溶液AおよびBを添加して37 °Cで10分間インキュベートしました。簡潔に述べると、抗体がプレコートされたウェルに標準品と腎組織上清を添加し、続いて対応するビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン-西洋ホースラジッシュペルオキシダーゼ接合体を添加しました。規定のインキュベーションステップの後、未結合成分を自動マイクロプレートウォッシャーを用いて除去しました。その後、基質溶液を添加し、酸性停止液を用いて呈色反応を停止させました。吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて450 nmで測定し、分析物濃度を対応する標準曲線から算出しました。腎組織ELISA測定は2連（duplicate）で行いました。各分析物について、2つのテクニカルレプリケートウェルの平均値を算出し、1つの個体レベルの値を得ました。同一の個体特異的ホモジネートから得られたテクニカルレプリケートウェルおよび別々のアリコートは、独立した観察値とは見なしませんでした。すべての生化学的測定は、標準化されたアッセイ固有の条件下で実施されました。血清、EDTA抗凝固血、および腎組織試料は、対応する分析法の要求に従って個別に処理されました。生化学的分析を行う研究者は、群割り付けについて盲検化されました。個々の血清試料、血液試料、腎臓検体、ホモジネートのアリコート、またはテクニカルレプリケートウェルではなく、個体動物を実験単位と見なしました。したがって、各実験群の統計分析には、6つの独立した個体レベルの観察値が含まれました。

組織病理学的処理およびスコアリング

ルーチンの組織学的処理により、顕微鏡評価用の右腎検体を調製した。各動物の右腎全体を、室温で72時間、10%中性緩衝ホルムアルデヒドに浸漬させた。固定後、50%、70%、80%、96%、100%のエタノールを用いて、各濃度1時間ずつ順次組織の脱水を行った。その後、パラフィン包埋の前に、キシレン浴に30分ずつ2回さらした。ロータリーミクロトームを用い、パラフィンブロックから腎皮質と外髄質の両方を含む5 µmの切片を作製した。

ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色では、切片を脱パラフィン化および再水和し、ヘマトキシリンに5分間浸漬させた後、流水下でさらに5分間洗浄した。分分染には酸性アルコールを用い、その後、アンモニア水で1分間青染し、エオジンで2分間対比染色した。染色後の切片は、昇順のアルコール濃度で脱水し、キシレンで透視した後、カバーガラスを用いて永久封入した。

Massonのトリクローム染色に用いる切片についても、同様に脱パラフィンおよび親水処理を行った。56 °Cで60分間の媒染処理を行い、次に流水で10分間洗浄した。その後、切片をWeigert鉄ヘマトキシリン液で10分間、Biebrich scarlet–acid fuchsin溶液で15分間、リンタングステン酸溶液で10分間、およびアニリンブルー溶液で10分間、順次処理した。1%酢酸に5分間浸漬した後、切片を脱水し、キシレンで透徹させ、カバーガラスで封入した。

顕微鏡による評価に先立ち、各染色法の適切性を個別に検証した。HE染色切片については、核の詳細および細胞質のコントラストが明確に判別できる場合に適切であると見なした。一方、マッソン三色染色切片については、結合組織構造が明瞭に視認できる場合に採用した。個体ごとに、HE染色切片3枚およびマッソン三色染色切片3枚を検査した。各切片につき、ランダムに選択した5つの顕微鏡視野を40倍の× 目的。したがって、動物1頭につき染色法あたり15個の顕微鏡視野を検討した。すべての顕微鏡検査は、同一の対物レンズを用い、すべての動物および実験群において標準化された評価条件下で実施した。マッソン・トリクローム染色切片を用いて、間質のコラーゲン分布と沈着、細胞外マトリックスの蓄積、および尿細管間質構造を定性的に評価した。これらの切片は、0～3の半定量的な組織病理学的損傷スコアの算出には使用しなかった。代表的なHE染色およびマッソン・トリクローム染色の顕微鏡写真は、40倍の× 目的、および 100 µm 各代表画像にはスケールバーを記載した。これらの顕微鏡写真は例示目的で取得したものであり、組織病理学的スコアリングまたは統計解析において独立した観察値としては扱わなかった。すべての組織病理学的評価は、実験群の情報を伏せられた（ブラインド化した）1名の経験豊富な病理医によって行われた。単一のブラインド検者が評価を行うことで、評価者の違いに起因するバイアスやばらつきを制限することを意図した。尿細管壊死、尿細管拡張、細胞変性、および血管充血について、既報の腎損傷モデルから改変したシステムに基づき、HE染色した腎臓切片を用いて半定量的にスコアリングした。28,29各パラメータのスコアは0から3の範囲で、それぞれ病理組織学的損傷が「なし」、「軽度」、「中等度」、「重度」であることに対応させた。各個体について、3枚のHE染色切片のそれぞれから観察した5つの顕微鏡視野（計15視野）の所見を総合的に判断し、各病理組織学的パラメータに対して0〜3の単一スコアを割り当てた。したがって、各個体について、尿細管壊死、尿細管拡張、細胞変性、および血管充血の各項目に1つのスコアが付与された。組織切片および顕微鏡視野は個体内のサブサンプルとして扱い、独立した観察値とはみなさなかった。各切片内において、個体間および実験群間で解剖学的なサンプリングを標準化するため、腎皮質および外髄質の同等の領域から顕微鏡視野をランダムに選択した。個々の腎臓、組織切片、または顕微鏡視野ではなく、個体単位を実験単位とした。 accordingly、各実験群について、6つの独立した個体レベルの観察値を統計解析に含めた。提示された値は 表3 各実験群の6匹の動物から算出された個体レベルのスコアに基づいた群平均を表している。

統計解析

統計解析は統計解析ソフトウェアを用いて行われました。すべての統計解析において、個々の動物を実験単位としました。各実験群は6匹の独立した動物で構成されました（n = 6/群）。テクニカルレプリケート、アッセイウェル、組織切片、および顕微鏡視野は独立した観察値として扱わず、統計的なサンプルサイズを増やすために使用しませんでした。連続変数は平均値 ± 標準偏差 (SD) で示しています。正規性はShapiro–Wilk検定を用いて各実験群内で個別に評価し、分散の均一性はLevene検定を用いて評価しました。グループ間のサンプルサイズが等しい完全バランス設計の実験であるため、群間の比較には一元配置分散分析 (ANOVA) を使用しました。ペア比較にはDuncanのポストホック多重比較検定を用いました。潜在的な外れ値は、ボックスプロットの視覚的検討および個々の観察値の確認によって評価しました。測定誤差または無効な実験結果とみなされた観察値はなく、統計的な理由で除外されたデータポイントもありませんでした。p値 < 0.05 を統計的に有意とみなしました。

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結果

血清中の腎機能マーカー（尿素、血液尿素窒素、クレアチニン）

本研究の実験デザイン、動物の群分け、処置スケジュール、およびサンプル採取のタイムラインを要約したものを示す。 図1. 血清尿素、BUN、およびクレアチニン値において、群間で統計学的に有意な差が認められた（p = 0.003, p = 0.003、および p ＝0.002）。血清尿素の平均値は67.43 mg/dLであった ± 対照群では53.11 mg/dLであり、606.71 mg/dLまで上昇した ± CI-AKI群では429.42 mg/dLであった。同様に、BUN値の平均は31.51 mg/dLから上昇した ± 対照群の24.82 mg/dLから268.63 mg/dLまで ± CI-AKI群では190.84 mg/dLであり、血清クレアチニン値も0.60 mg/dLから著明に上昇した ...

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ディスカッション

この実験的CI-AKI研究では、モンテルカスト、NAC、またはその併用による造影剤投与後の治療効果について、腎機能、酸化ストレスパラメータ、炎症反応、腎障害バイオマーカー、および組織病理学的結果にわたって評価した。造影剤への曝露により、血清尿素、BUN、およびクレアチニンが大幅に増加し、酸化ストレスパラメータおよび炎症性バイオマーカーに悪影響が認められた。KIM-1およびシスタチンCレベルの上昇は、腎障害のさらなる根拠となった。

モンテルカスト、NAC、またはそれらの併用療法による造影剤投与後の治療は、評価したいくつかのパラメータにおいて好ましい変化と関連していました。しかし、生化学的アウトカムにおいて、併用療法がモンテルカスト単独療法を一貫して上回ることはありませんでした。総合すると、これらの観察結果はCI-AKIにおける酸化ストレスと炎症の関与と整合しており、これらのプロセスに作用する介入が腎障害を軽減させる可能性を示唆しています。ただし、本研究では基礎となるシグナリングパスウェイを直接的に検討していません1,

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開示事項

著者らは、競合する利益がないことを宣言します。本原稿の作成において、AI支援ツールは言語編集および文法修正のみに使用されました。データの生成、分析、解釈、および図表やグラフィカルな要素の作成に人工知能ツールは使用されていません。著者らは本原稿の内容について全責任を負います。

著者の寄与：

YS、CS、およびOKは、本研究の構想および設計に寄与した。YSは実験手順およびデータ収集を行った。OKは組織病理学的検査を実施した。YSとCSは統計解析を行い、データを解釈した。YSが原稿を起草した。すべての著者が原稿を批判的に校閲し、最終版を承認した。

謝辞

本研究は、Kırşehir Ahi Evran大学の科学研究プロジェクト調整ユニット（プロジェクト番号：TIP.A3.26.006）の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 オートストリップウォッシャーBio-Tek Instruments, USAELx50ELISAプレートの自動洗浄。
 マイクロプレートリーダーBio-Tek Instruments, USAELx800ELISA吸光度測定。
RRID:SCR_028651
10% 中性緩衝ホルマリンMerckNot recorded組織病理学用の組織固定。
ベンチトップ遠心機NüveNF048試料調製および遠心分離。
カルボキシメチルセルロース (CMC)Sigma-Aldrich, USAC5678モンテルカスト懸濁液に使用する溶媒。
CAT Kit UniversalOtto ScientificOtto3051Mindray BS-400化学分析装置を用いた血清中CAT活性の比色定量。
デジタルホモジナイザーDaihan ScientificHG-15D組織ホモジナイズ。
エオシン Y (黄色)Merck1.15935.0025HE染色。
ハリス・ヘマトキシリン溶液BSLABBS-002HE染色。
インドメタシンSigma-Aldrich, USAI7378CI-AKIの誘導に使用。
イオヘキソール (Omnipaque 300)GE HealthCareNot recordedCI-AKIを誘導するために使用する造影剤。
塩酸ケタミン (Ketalar)Pfizer, USANot recorded試料採取前の全身麻酔。
光学顕微鏡 (Nikon Eclipse)NikonNi-U組織病理学的検査およびイメージング。
RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-Aldrich, USAN5751CI-AKIの誘導に使用。
マッソン・トリクローム染色キットMOSLAB, TürkiyeBKMTO001マッソン・トリクローム染色。
Mindray化学分析装置MindrayBS-400生化学分析。
モンテルカストナトリウムSigma-Aldrich, USASML0101治療として経口ゾンデ投与。
N-アセチルシステイン (ASIST 300 mg/2 mL)MAC figure-materials-1laç, TürkiyeNot recorded治療として腹腔内投与。
ラット Cystatin C ELISA キットBT Lab, ChinaE0145Ra腎組織上清中の cystatin C の ELISA 測定。
ラット IL-1β ELISA キットBT Lab, ChinaE0119Ra腎組織上清中の IL-1β の ELISA 測定。
ラット IL-6 ELISA キットBT Lab, ChinaE0135Ra腎組織上清中の IL-6 の ELISA 測定。
ラット KIM-1 ELISA キットBT Lab, ChinaE0549Ra腎組織上清中の KIM-1 の ELISA 測定。
ラット TNF-α ELISA キットBT Lab, ChinaE0764Ra腎組織上清中の TNF-α の ELISA 測定。
ステンレス製給餌針 (22 G 経口投与カニューレ)Instech Laboratories, USANot recorded経口ゾンデ投与。
標準ペレット齧歯類飼料 (Optima)Optima, TürkiyeNot recordedロット番号 58931。栄養組成：粗タンパク質 24%、粗セルロース 3.94%、粗脂肪 5.08%、粗灰分 8.8%、リシン 1.44%、メチオニン 0.61%、カルシウム 1.14%、リン 0.89%、ナトリウム 0.28%。
Universal Creatinine KitOtto ScientificOttoBC139血清中クレアチニンの比色定量。
Universal GSH KitOtto ScientificOtto3053改変エルマン法を用いた EDTA 抗凝固血中の GSH の比色定量。
Universal MDA KitOtto ScientificOtto1001ELx800 マイクロプレートリーダーを用いた血清中 MDA の比色定量。
Universal SOD KitOtto ScientificOtto3047Mindray BS-400 化学分析装置を用いた血清中 SOD 活性の比色定量。
Universal Urea KitOtto ScientificOttoBC157血清中尿素および BUN の比色定量。
塩酸キシラジン (Rompun)Bayer, GermanyNot recorded試料採取前の全身麻酔。

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