研究記事

Yangjingカプセルは、lncRNA NONMMUT031883.2の上方制御を介してQKI-5/p38 MAPK経路を抑制することにより、マウスの精子形成不全を改善する

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DOI：

10.3791/73166

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2026年8月28日

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

本研究では、シクロホスファミドによって誘発されたマウスの精子形成不全に対する養精カプセル（Yangjing Capsule）の保護効果を評価し、lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPKシグナル伝達経路の関与について検討します。

要約

精子形成不全は男性不妊の重要な原因であり、シクロホスファミド（CP）は異常な精原細胞のアポトーシスを誘導することで精子形成を損なう可能性がある。養精 capsule（YC）は生殖機能の改善に用いられてきたが、その基礎となる分子メカニズムは依然として不明である。本研究では、CP誘導性の精子形成不全マウスモデルおよびGC-1精原細胞におけるYCの保護効果を調査した。精子数と運動率、男性の繁殖能、血清性ホルモン値、ならびに精巣および精巣上体の組織病理学的変化を評価した。GC-1細胞においては、細胞生存率、乳酸脱水素酵素の放出、アポトーシス、およびアポトーシス関連タンパク質を評価した。定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、RNAプルダウンアッセイ、免疫蛍光染色、およびウェスタンブロッティングを用いて、lncRNA NONMMUT031883.2、Quaking-5（QKI-5）、およびp38ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達を検討した。CP投与マウスにおいて、YCは用量依存的に精子の質、血清性ホルモン値、生殖器官の形態、精巣の組織病理、および繁殖能を改善した。GC-1細胞において、YCは細胞生存率を上昇させ、細胞損傷とアポトーシスを減少させた。lncRNA NONMMUT031883.2はQKI-5と物理的に相互作用しており、YC処理はlncRNA NONMMUT031883.2の発現を増加させる一方で、QKI-5の発現とp38のリン酸化を減少させた。YC処理は、GC-1細胞におけるlncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによって誘導されるアポトーシスを抑制したが、QKI-5の過剰発現はYCの抗アポトーシス効果を減弱させた。これらの知見は、YCがCP誘導性の精子形成不全を軽減し、その保護効果がlncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路の調節によって媒介されることを示唆している。

概要

精子形成不全とは、男性生殖器における精子の産生、成熟、または機能の異常によって引き起こされる生殖能の低下を指します。これは、精子数の減少、運動率の低下、および精子形態異常率の上昇によって特徴付けられます1,2。精子形成不全の病態は複雑であり、遺伝的要因、自己免疫疾患、環境毒素、化学療法による損傷、および生殖器の病変に関連しています3-5。シクロホスファミド (CP) などの化学療法剤は、精巣の精細管に直接損傷を与え、精原細胞のアポトーシスを誘導し、それによって男性の精子形成不全に寄与します6,7。現在は、ホルモン補充療法、抗酸化剤の投与、および生殖補助医療が臨床的介入として用いられています。しかし、これらのアプローチは有効性が一定ではなく、重大な副作用を伴います8,9,10。したがって、安全で効果的な介入策を特定し、その分子標的を明らかにすることは、精子形成不全患者の妊孕性結果を改善するために臨床的に重要です。

漢方薬は、マルチターゲット特性と比較的低い毒性を持つため、男性生殖機能の保護および精子形成不全の治療において可能性を示しています11,12。養精カプセル（Yangjing Capsule; YC）は、Rehmannia glutinosa、Epimedium、胎盤、Polygonatum sibiricum、Angelica sinensis、およびその他の漢方薬で構成される中国の伝統的な特許薬です。これは、腎と精を補い、血と髄を養い、生殖機能を調節するために用いられます13。先行研究では、YCが雄動物の性ホルモンレベルを調節し、精子の質を改善し、精巣組織の損傷を修復し、化学物質によって誘発される生殖器損傷を保護できることが示されています14,15。精原細胞は精子形成の基礎であり、異常な精原細胞のアポトーシスは精子形成不全の発症における中心的なイベントです16。YCは、精原細胞の生存率を改善し、S期の細胞割合を増加させ、アポトーシスを抑制することも報告されています17。しかし、CP誘発性精子形成不全におけるその保護効果と具体的な分子メカニズムは依然として不明です。

長鎖非翻訳RNA（lncRNA）は、タンパク質コード能を持たない200ヌクレオチド以上の長さを持つRNA分子である18。lncRNAは、染色体サイレンシング、クロマチン修飾、ゲノム印字、転写活性化などのメカニズムを通じて遺伝子発現を調節することができる19,20。RNA結合タンパク質であるQuaking-5（QKI-5）は、下流遺伝子の選択的スプライシングを調節することにより、細胞増殖やアポトーシスを含む生理的および病理的プロセスに関与している21。p38ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路は、アポトーシスの調節に関与しており、男性の生殖能および精巣の発達においても重要な役割を果たしている22,23。先行研究では、肝細胞癌細胞においてQKI-5の過剰発現がp38 MAPK経路を活性化することが示されている24。さらに、lncRNA NONMMUT074098.2が精原細胞においてQKI-5に結合することが示されており、一方でQKI-5のノックダウンはp38 MAPK経路を抑制し、精原細胞のアポトーシスを減少させた25。本研究では、CP誘導マウス精子形成不全モデルを用い、YCがlncRNA NONMMUT031883.2の発現およびQKI-5/p38 MAPKシグナル伝達軸を調節し、それによって精原細胞の異常なアポトーシスを減少させ、CP誘導性の精子形成不全を軽減するかどうかを検討した（Figure 1）。その目的は、精子形成に対するYCの保護効果の根底にある分子メカニズムを解明し、男性生殖機能の保護におけるその薬理学的役割についての理解を深めることであった。

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図1: 実験デザインの概略図。上段のパネルは、GC-1精原細胞を用いたin vitro 実験をまとめたものである。lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによりアポトーシスと細胞損傷を誘導し、続いてQKI-5のノックダウンを行い、アポトーシスおよび細胞損傷への影響を評価した。下段のパネルは、シクロホスファミド（CP）誘発マウス精子形成不全モデルを用いたin vivo実験をまとめたものである。マウスに養精 capsule（Yangjing Capsule）投与、および/またはlncRNA NONMMUT031883.2またはQKI-5による介入を行った。その後、妊孕性、血清ホルモンレベル、精巣および精巣上体組織、精子懸濁液、精子貯蔵量、精子品質、および精巣の組織病理学的損傷を評価した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

プロトコル

すべての動物実験は、ARRIVEガイドラインおよび米国国立衛生研究所（NIH）の実験動物の飼育および使用に関するガイドラインに従って実施されました。すべての実験プロトコルは、東南大学動物倫理委員会の審査および承認を受けました（承認番号：20230216022）。

1. YC含有血清の調製
Yangjing Capsule（YC; 0.5 g/カプセル）2粒を開封し、カプセル内容物を0.8 g量り取った。最終容量が10 mLになるまで生理食塩水を加え、混合物を十分にボルテックスして80 mg/mLの懸濁液を調製した。体重22–25 g、週齢8週のSPF（特定病原体フリー）雄性BALB/cマウスを、温度22 °C、湿度55%–60%、12時間明暗サイクルの条件下で飼育し、餌と水を自由摂取（ad libitum）させた。1週間の順化後、マウスにYCを800 mg/kg（投与量10 mL/kg）で1日1回、5日間連続して経口投与した。最終投与の2時間後、マウスを1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与で麻酔し、血清を採取してYC含有血清を調製した。血清を56 °Cで30分間不活化し、0.22 µmメンブレンフィルターでろ過した後、使用時まで−80 °Cで保存した。

2. 細胞培養およびトランスフェクション
マウスGC-1精原細胞を、1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび10%胎児牛血清を含むDMEMで維持した。すべての培養は、5% CO₂ (v/v) 含有雰囲気下の37 °Cで維持した。

LncRNA特異的ショートヘアピンRNA（sh-lncRNA）、QKI-5過剰発現プラスミド（OE-QKI-5）、QKI-5小干渉RNA（si-QKI-5）、およびそれらに対応するネガティブコントロール（sh-NC、OE-NC、およびsi-NC）を合成および構築した。GC-1細胞に、トランスフェクション試薬の説明書に従って、sh-lncRNAまたはsh-NC、si-QKI-5またはsi-NC、あるいはOE-QKI-5またはOE-NCをトランスフェクションした。48時間のインキュベーション後、lncRNA NONMMUT031883.2またはQKI-5の発現量を測定することで、トランスフェクション効率を評価した。

sh-lncRNA + si-QKI-5 + エトポシド群では、GC-1細胞にsh-lncRNAおよびsi-QKI-5をトランスフェクションし、続いて100 µMのエトポシドで12時間処理した26。その後の細胞生存率アッセイでは、GC-1細胞を5%、10%、または20%のYC含有血清を添加した培地で培養し、それぞれ低用量YC（L-YC）、中用量YC（M-YC）、および高用量YC（H-YC）群とした。YC含有血清の濃度（5%、10%、および20% YC）は、予備的な濃度勾配実験の結果に基づいて決定した。sh-lncRNA + H-YC + OE-NC群およびsh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5群では、GC-1細胞にsh-lncRNAとOE-NC、またはsh-lncRNAとOE-QKI-5をトランスフェクションして48時間後、20% YC含有血清に24時間曝露させた。

3. Cell Counting Kit-8 アッセイ
GC-1細胞を96ウェルプレートに 5 × 103 cells/well の密度で播種し、24時間培養した。細胞の接着後、元の培地をYC含有血清を添加した完全培地 100 µL に交換し、細胞を6、12、または24時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに Cell Counting Kit-8 試薬 10 µL を添加し、37 °C の暗所で2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて 450 nm における吸光度を測定した。

4. 乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイ
sh-NCまたはsh-lncRNAを導入して48時間後、GC-1細胞の培養液を回収し、遠心分離によって上清を得た。乳酸脱水素酵素アッセイキットの説明書に従い、上清を検出用作動液で穏やかに混合し、96ウェルプレートに移した。プレートを25 °Cの暗所で30分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて490 nmにおける吸光度を測定し、細胞損傷を評価するために乳酸脱水素酵素の放出量を算出した。

5. Calcein AM/プロピジウムイオダイド染色
sh-NCまたはsh-lncRNAをトランスフェクションして48時間後、Calcein AM/プロピジウムイオダイド（PI）染色を用いてGC-1細胞の生存率を評価した。細胞を12ウェルプレートに5 × 104 cells/wellで播種し、コンフルエンスが60%–70%になるまで培養した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄し、各ウェルに500 µLのCalcein AM/PI染色液を加えた。細胞を37 °Cの暗所で30分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。画像解析ソフトを用いて生存細胞と死細胞をカウントし、生存細胞の割合を算出した。

6. フローサイトメトリー
GC-1細胞を遠心分離によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄した。細胞ペレットを500 µLの結合バッファーに懸濁し、細胞密度を5 × 105 cells/mLに調整した。次に、Annexin V-APCとPIをそれぞれ5 µLずつ加え、懸濁液を十分に混合した後、25 °Cの暗所で10分間インキュベートした。アポトーシスの解析はフローサイトメトリーを用いて行い、励起/蛍光波長はAPCで633/660 nm、PIで488/630 nmとした。アポトーシス率はフローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて算出した。

7. カスパーゼ-3活性測定
規定の処理後、約1 × 106 個のGC-1細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄して再懸濁した。細胞をカスパーゼ-3活性測定キットの試薬II 100 µLと混合し、氷上で15分間溶解させた。遠心分離後、溶解液の上清 50 µLを回収し、試薬I 40 µLおよび試薬III 10 µLと混合した。この混合液を37 °Cで2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて405 nmにおける吸光度を測定し、キットの説明書に従ってカスパーゼ-3活性を評価した。

8. RNAプルダウンアッセイ
lncRNA NONMMUT031883.2のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、対応する配列に従って合成し、ビオチンで標識した。細胞を免疫沈降用細胞溶解バッファー中で氷上30分間溶解させ、遠心分離によりタンパク質を含む上清を回収した。ストレプトアビジン磁気ビーズをRNA結合バッファーで3回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含む結合バッファー中で30分間インキュベートした。

前処理済みのビーズをビオチン標識プローブと混合し、25 °Cで30分間インキュベートした。未結合のプローブを磁気分離により除去した。その後、細胞ライセート上清を加え、混合物を4 °Cで4時間インキュベートして、磁気ビーズ-RNA-タンパク質複合体を形成させた。非特異的に結合したタンパク質を除去するため、磁気ビーズを洗浄バッファーで3回洗浄した。磁気分離により洗浄バッファーを除去し、2× SDSサンプルローディングバッファーを加えた。サンプルを95 °Cで10分間加熱し、その後のウェスタンブロット解析のために、磁気分離により上清を回収した。

9. 精子形成不全マウスモデルの作製
5日間の馴化後、体重22–25 g、8週齢の特定病原体未導入（SPF）雄性BALB/cマウスに、精子形成不全モデルを確立するため、シクロホスファミド（CP）を50 mg/kgで1日1回、7日間腹腔内投与した14,27。モデル作製に成功したマウスを乱数表を用いて、CP群、200 mg/kg YC群、400 mg/kg YC群、800 mg/kg YC群、800 mg/kg YC + sh-NC群、および800 mg/kg YC + sh-lncRNA群にランダムに割り付け、各群6匹とした。

YC投与群のマウスには、YCの対応する用量を1日1回、30日間経口投与した13。800 mg/kg YC + sh-NC群および800 mg/kg YC + sh-lncRNA群では、モデルの構築に成功した後、マウスを2%イソフルランの吸入により麻酔した。各マウスに足退避反射が見られないこと、および呼吸数が安定していることを確認した後、手術部位を剃毛し、ポビドンヨードで消毒した。無菌条件下で、生殖器の前方から皮膚および体壁を通して腹側正中切開を行った。血管損傷を避けるよう注意しながら、精巣上体脂肪組織を慎重に操作して精巣を露出させた。マイクロマニピュレーターを用いて精細管を可視化し、マイクロインジェクションニードルを用いてアデノウイルス懸濁液（1 × 1010 TU/mL）1 µLをゆっくりと注入した28。注入後、ニードルを5分間留置してからゆっくりと引き抜き、滅菌綿棒で止血した。その後、対側の精巣にも同様の手順を行った。切開部を縫合し、術後のマウスをウォーミングパッドの上で回復させた。対照群のマウスには、毎日同量の生理食塩水を経口投与および注入した。

10. 生殖能の評価
薬剤投与の完了後、各群の雄マウスをBALB/c雌マウスと1:2の比率で7日間自由交配させた。雌マウスの腟栓形成を毎日モニタリングし、記録した。交配の成功が確認された後、雄マウスを取り除き、雌マウスを自然分娩まで個別に飼育した。各群から9匹の妊娠雌マウスを得て、解析に含めた。各群の雄の生殖能を評価するため、平均産子数を記録した。

実験期間の終了後、マウスをペントバルビタールナトリウム 100 mg/kg の腹腔内投与により安楽死させた。この安楽死方法は、東南大学動物倫理委員会によって承認された（承認番号：20230216022）。精巣および精巣上体を慎重に分離し、写真撮影および重量測定を行った。精巣指数および精巣上体指数は、臓器重量/体重として算出した。各マウスから片側の精巣上体を採取して切断し、予め加温したリン酸緩衝生理食塩水 1 mL（37 °C）に入れ、精子が遊出するように 20 分間インキュベートした29。精子懸濁液を緩やかに混合し、その 10 µL を予熱した血球計算盤に滴下した。光学顕微鏡を用いて 200× 倍率で精子数を手動でカウントし、結果を 106/L として表記した。さらに、全精子数に対する前進運動精子の割合を精子運動率として算出した13。

11. 性ホルモン濃度の測定
各群のマウスの眼窩静脈から血液を採取し、25 °Cで30分間静置した。その後、3,000 × gで10分間遠心分離を行い、血清を回収した30。血清中のテストステロン、黄体形成ホルモン（LH）、および卵胞刺激ホルモン（FSH）の濃度を、それぞれの酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キットを用いて測定した。

12. RNA安定性アッセイ
GC-1細胞を96ウェル培養プレートに播種し、si-QKI-5またはsi-NCをトランスフェクションして48時間培養した。その後、Actinomycin Dを5 µg/mL添加し、0、3、6、および9時間後に細胞を回収した。全RNAを単離し、逆転写後の定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によりlncRNA NONMMUT031883.2の相対的な発現レベルを決定した。各時点における相対的なRNAレベルは、0時間の発現レベルを100%として算出した。

13. 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
GC-1細胞およびマウス精巣組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、全RNA抽出のために溶解した。AMV逆転写酵素を用いた逆転写により相補的DNAを合成した。リアルタイムPCRシステムと定量PCRキットを用い、相補的DNAを増幅テンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行った。lncRNA NONMMUT031883.2の内部標準としてU6を、QKI-5の 内部標準としてGAPDHを用いた。標的遺伝子の相対的な発現量は2−ΔΔCt法を用いて算出した25。また、lncRNA NONMMUT031883.2の細胞内局在を決定するため、細胞質画分および核画分から個別にRNAを抽出した。プライマー配列は表1に記載している。

遺伝子フォワードプライマー (5'から3')リバースプライマー (5'から3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

表1：定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用したプライマー配列。lncRNA NONMMUT031883.2、QKI-5、U6、およびGAPDHのフォワードおよびリバースプライマー配列を5′–3′方向に記載している。

14. ヘマトキシリン・エオジン染色
マウスの精巣および精管組織を4%パラホルムアルデヒドに浸し、4 °Cで24時間固定した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、段階的なエタノール系列を用いて組織を脱水し、パラフィンに包埋して5 µmの厚さで切片を作成した。切片を60 °Cで60分間加熱し、キシレン中で30分間脱パラフィン処理を行った。

段階的なエタノール系列による親水化後、切片をヘマトキシリンで5分間染色し、塩酸エタノール分化液で10秒間処理し、水道水で洗浄して青染させた後、1%エオジンで2分間染色した。次に、切片を95%エタノールおよび無水エタノールで脱水し、キシレンで30分間透徹させた。風乾後、切片を中性樹脂で封入した。精巣および精巣上体の形態学的変化を顕微鏡下で観察した。

15. 免疫蛍光染色
マウス精巣のパラフィン切片を段階的なエタノール系列で脱パラフィンおよび親水化し、続いてpH 6.0のクエン酸緩衝液を用いてマイクロ波による抗原賦活化を行った。室温まで自然冷却した後、切片を0.3% Triton X-100で10分間インキュベートした。切片を5% 牛血清アルブミンで25 °Cにて60分間ブロッキングし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、Ki67に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。翌日、蛍光色素標識二次免疫グロブリンG抗体を適用し、切片を37 °Cの暗所にて60分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、切片をDAPIで10分間対比染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。蛍光強度は画像解析ソフトウェアを用いて分析した。

GC-1細胞の免疫蛍光染色では、細胞を12ウェルプレートに1 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間インキュベートした。細胞を4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、0.3% Triton X-100で10分間透過処理した後、5%牛血清アルブミンでブロッキングを行い、QKI-5に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。以降の手順は、精巣組織切片について述べた方法と同様に実施した。

16. TUNEL染色
マウス精巣のパラフィン切片を脱パラフィンし、段階的なエタノール系列で親水化した後、細胞膜透過性を高めるために0.1% Triton X-100で5分間インキュベートした。DNaseを含まない20 µg/mLのProteinase K調製液を切片に均一に塗布し、37 °Cで15分間インキュベートした。次にTUNEL検出溶液を加え、暗所で37 °Cにて90分間インキュベートした。DAPIで10分間インキュベートした後、抗退色封入剤を塗布し、蛍光顕微鏡下で精巣組織を観察した。

GC-1細胞を12ウェルプレートに播種し、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した。0.1% Triton X-100で5分間透過処理を行った後、TUNEL検出溶液を細胞に添加し、暗所で60分間インキュベートした。次いで、細胞をDAPIで10分間染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。

17. ウェスタンブロッティング
マウス精巣組織およびGC-1細胞を免疫沈降用細胞溶解バッファー中で氷上30分間溶解させ、超音波破砕を行った。遠心分離後、タンパク質を含む上清を回収し、bicinchoninic acidアッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定した。タンパク質上清にSDSローディングバッファーを混合し、沸騰水中で10分間加熱した。ゲル電気泳動による分離後、タンパク質をポリビニリデンフルオリド膜に転写し、5%牛血清アルブミンで2時間ブロッキングした31。

メンブレンを、切断型caspase-3 (1:500)、Bcl-2 (1:1000)、caspase-3 (1:2000)、Bax (1:500)、QKI-5 (1:1000)、リン酸化p38 (1:1000)、またはp38 (1:500)に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。翌日、メンブレンをTween 20含有Tris緩衝生理食塩水で洗浄し、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG (1:10000)とともに25 °Cで2時間インキュベートした。メンブレン表面に化学発光増強基質溶液を塗布し、ゲルイメージングシステムを用いてタンパク質バンドを撮影した。バンド強度は画像解析ソフトを用いて解析し、相対的なタンパク質発現量はGAPDH (1:3000)で標準化した。

タンパク質合成を阻害するために、50 µg/mLのシクロヘキシミドを使用した。QKI-5の半減期を決定するために、0、3、6、および9時間に細胞を回収し、その後、ウェスタンブロッティングによりQKI-5タンパク質レベルを測定した25。

18. 統計解析
すべてのデータは、統計、グラフ作成、および画像解析ソフトウェアを用いて統計的に解析し、プロットした。データの正規性はShapiro-Wilk検定を用いて評価した。実験データは平均値 ± 標準偏差で示した。群間の差の評価には一元配置分散分析を用いた。分散が均一な場合の事後ペア比較にはLSD-t検定を、分散が不均一な場合にはDunnett’s T3検定を用いた。p < 0.05を統計的に有意とみなした。

結果

lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによる精原細胞のアポトーシス誘導
GC-1細胞にsh-lncRNAを導入し、lncRNA NONMMUT031883.2の発現をノックダウンした。sh-NCを導入した細胞と比較して、sh-lncRNAの導入後、lncRNA NONMMUT031883.2の転写レベルは著しく低下しており、ノックダウンの成功が確認された（図2A）。lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウン後、GC-1細胞の生存率は有意に低下し（図2B）、LDH放出量は有意に増加したことから、細胞損傷の増大が示された（図2C）。Calcein-AM/PI染色では、sh-lncRNA群においてPI陽性GC-1細胞数が増加し、生存細胞の割合が減少した（図2D, E）。lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウン後、GC-1細胞のアポトーシス率は著しく上昇した（図2F, G）。また、sh-lncRNA群ではTUNEL陽性率も有意に上昇しており、アポトーシスの増加がさらに示された（図2H, I）。加えて、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンにより、GC-1細胞におけるcaspase-3活性が有意に上昇した（図2J）。sh-lncRNA群では、Baxの発現が著しく増加し、Bcl-2の発現が減少し、cleaved caspase-3/caspase-3比が有意に上昇した（図2K, L）。これらの結果は、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンがGC-1細胞のアポトーシスを誘導することを示している。すべての定量データはn = 6で得られた。

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図 2: lncRNA NONMMUT031883.2 のノックダウンによる精原細胞アポトーシスの誘導。(A) GC-1細胞における lncRNA NONMMUT031883.2 発現の定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) 解析。 (B) lncRNA NONMMUT031883.2 ノックダウン後の GC-1細胞生存率の Cell Counting Kit-8 (CCK-8) アッセイ。 (C) lncRNA NONMMUT031883.2 ノックダウン後の GC-1細胞からの乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出。 (D, E) Calcein-AM/プロピジウムヨード (PI) 染色による GC-1細胞の生存確認 (20×; スケールバー, 100 µm)。 (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2 ノックダウン後のアポトーシスのフローサイトメトリー解析。 (H, I) GC-1細胞の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ dUTP ニッキングエンド標識 (TUNEL) 解析 (40×; スケールバー, 50 µm)。 (J) lncRNA NONMMUT031883.2 ノックダウン後の Caspase-3 活性。 (K, L) sh-lncRNA トランスフェクション後の Bcl-2, Bax, caspase-3, および cleaved caspase-3 発現のウェスタンブロット解析。データは平均値 ± 標準偏差として示している; n = 6. ***p < 0.001 versus sh-NC. ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

LncRNA NONMMUT031883.2はQKI-5と相互作用する
精原細胞のアポトーシスの根底にある分子メカニズムを解明するため、lncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5の相互作用を検討した。核画分と細胞質画分に分離した後、qRT-PCR解析により、lncRNA NONMMUT031883.2が主にGC-1細胞の核に局在していることが示された（Figure 3A）。免疫蛍光解析では、QKI-5も核に集中していることが示され、lncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5が相互作用するための空間的基盤が確認された（Figure 3B）。QKI-5がlncRNAの安定性を調節しているかどうかを評価するため、アクチノマイシン D処理後のlncRNA NONMMUT031883.2の半減期を測定した。QKI-5のノックダウンは、このlncRNA転写物の半減期に顕著な影響を及ぼさなかった（Figure 3C）。シクロヘキシミドによるタンパク質合成阻害後においても、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンはQKI-5タンパク質の発現を変化させなかった（Figure 3D, E）。次に、lncRNA NONMMUT031883.2を標的とするビオチン標識アンチセンスプローブのキャプチャー効率をqRT-PCRで評価した。このアンチセンスプローブは標的lncRNAを効率的に濃縮したため、その後のRNAプルダウンアッセイに使用した（Figure 3F）。RNAプルダウンに続くウェスタンブロッティングにより、lncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5の間に特異的な物理的相互作用があることが示された（Figure 3G, H）。これらの結果は、lncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5がGC-1細胞の核内で共局在し、特異的に相互作用することを示している。Figure 3CおよびFigure 3D, Fの定量データはn = 3で得られ、その他の定量データはn = 6で得られた。

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図 3: LncRNA NONMMUT031883.2はQKI-5と相互作用する。(A) GC-1細胞におけるlncRNA NONMMUT031883.2の核および細胞質への分布に関するqRT-PCR解析。 (B) GC-1細胞におけるQKI-5の細胞内局在の免疫蛍光解析（40×；スケールバー、50 µm）。 (C) アクチノマイシン D処理およびQKI-5ノックダウン後のlncRNA NONMMUT031883.2の半減期のqRT-PCR解析（n = 3）。 (D, E) シクロヘキシミド処理およびlncRNA NONMMUT031883.2ノックダウン後のQKI-5タンパク質発現のウェスタンブロット解析（n = 3）。 (F) lncRNA NONMMUT031883.2を標的とするビオチン標識アンチセンスプローブの濃縮効率のqRT-PCRによる検証。 (G, H) lncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5の相互作用に関するRNAプルダウンおよびウェスタンブロット解析。データは平均値 ± 標準偏差で示されており、n = 6である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

QKI-5のノックダウンはp38 MAPK経路を抑制することで精原細胞のアポトーシスを阻害する
精原細胞のアポトーシスにおけるQKI-5および下流のp38 MAPK経路の役割を検討した。si-QKI-5によるトランスフェクション後、GC-1細胞においてQKI-5タンパク質レベルが有意に低下し、ノックダウンの成功が確認された（Figure 4A, B）。LncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによりp-p38/p38比が有意に上昇したが、QKI-5を同時にノックダウンするとこの比が低下し、p38 MAPK経路の活性化が抑制されることが示された（Figure 4C, D）。QKI-5のノックダウンは、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによって引き起こされたGC-1細胞へのダメージを軽減したが、アポトーシス誘導剤であるエトポシドによる処理は細胞生存率を有意に低下させた（Figure 4E）。QKI-5のノックダウンはGC-1細胞のアポトーシス率を有意に低下させた一方、エトポシド処理はアポトーシスを著しく増加させた（Figure 4F, G）。また、si-QKI-5のトランスフェクションはcaspase-3活性を有意に低下させたが、エトポシド処理はcaspase-3活性を増加させた（Figure 4H）。QKI-5のノックダウンはBaxの発現を減少させ、Bcl-2の発現を増加させ、さらにcleaved caspase-3/caspase-3比を有意に低下させたが、エトポシド処理はこれらの発現パターンを逆転させた（Figure 4I, J）。これらの結果は、QKI-5のノックダウンがp38 MAPK経路を阻害することにより、GC-1精原細胞のアポトーシスを抑制することを示している。すべての定量データはn = 6で得られた。

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図 4: QKI-5のノックダウンはp38 MAPK経路を抑制することで精原細胞のアポトーシスを抑制する。(A, B) si-NCまたはsi-QKI-5をトランスフェクションした後のGC-1細胞におけるQKI-5発現のウェスタンブロット解析。(C, D) リン酸化p38 (p-p38) および総p38発現のウェスタンブロット解析。(E) 各治療群におけるGC-1細胞の生存率のCCK-8解析。(F, G) エトポシド処理後のアポトーシスのフローサイトメトリー解析。(H) 各治療群におけるCaspase-3活性。(I, J) GC-1細胞におけるBax、Bcl-2、caspase-3、および切断型caspase-3発現のウェスタンブロット解析。データは平均値 ± 標準偏差で示されている；n = 6。***p < 0.001 vs si-NC または sh-NC；###p < 0.001 vs sh-lncRNA；&&&p < 0.001 vs sh-lncRNA + si-QKI-5。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

YCは精原細胞のアポトーシスを抑制する 〜経由で lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路
GC-1細胞をYC含有血清で6、12、および24時間処理したところ、YC濃度の増加および曝露時間の延長に伴い、細胞生存率は徐々に上昇した。したがって、これらの濃度を以降の実験に採用し、処理時間は24時間とした（図5A）。GC-1細胞において、YCで24時間処理すると、lncRNA NONMMUT031883.2の転写レベルが著しく上昇した（図5B) および QKI-5 への結合能を向上させた（図 5C, D）。YC処理後、GC-1細胞においてQKI-5の発現およびp-p38/p38比が著しく減少しており、p38 MAPK経路の抑制が示唆された（図5E, F）。また、YC処理によりアポトーシス率が著しく低下した（図5G, H）、カスパーゼ-3活性の低下（図5I）、Bcl-2発現の増加、ならびにBax発現および切断型caspase-3/caspase-3比の減少（図5J, K).

パスウェイの特異性をさらに評価するため、GC-1細胞にOE-NCまたはOE-QKI-5をトランスフェクションした。OE-QKI-5をトランスフェクションした細胞ではQKI-5タンパク質の発現が有意に増加しており、過剰発現が成功したことが確認された（Figure 5L, M）。lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンは細胞生存率を有意に低下させたが、YC処理はこの効果を反転させた。QKI-5の過剰発現は、YCの細胞保護効果を減弱させた（Figure 5N）。また、YC処理はlncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによって誘導されるアポトーシスを抑制し（Figure 5O, P）、caspase-3活性を低下させ（Figure 5Q）、Bax発現を減少させ、Bcl-2発現を増加させ、さらに活性型caspase-3/caspase-3比を低下させた（Figure 5R, S）。対照的に、QKI-5の過剰発現はYCの抗アポトーシス効果を減弱させた。これらの結果は、YCがlncRNA NONMMUT031883.2をアップレギュレートし、そのQKI-5への結合を促進することで、p38 MAPKパスウェイを抑制し、GC-1細胞におけるアポトーシスを抑制することを示している。すべての定量データはn = 6で得られた。

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図 5YCは精原細胞のアポトーシスを抑制する 〜経由で lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路。(A) 養精 capsule (YC) 含有血清に6、12、および24時間曝露した後のGC-1細胞の生存率に関するCCK-8解析。 (B) YC処理24時間後のGC-1細胞におけるlncRNA NONMMUT031883.2発現のqRT-PCR解析。 (C, D) YC処理後のlncRNA NONMMUT031883.2とQKI-5の結合に関するRNAプルダウン解析。 (E, F) YC処理後のQKI-5、p-p38、およびp38発現のウェスタンブロット解析。 (G, H) YC処理後のGC-1細胞のアポトーシスのフローサイトメトリー分析 (I) YC処理後のカスパーゼ-3活性。 (J, K) YC処理後のBcl-2、Bax、caspase-3、および切断型caspase-3の発現に関するウェスタンブロット解析。 (L, M) OE-NCまたはOE-QKI-5のトランスフェクション後におけるQKI-5発現のウェスタンブロット解析。 (N) GC-1細胞の生存率に関するCCK-8解析。 (O, P) QKI-5過剰発現後のGC-1細胞におけるアポトーシスのフローサイトメトリー解析 (Q) QKI-5過剰発現後のカスパーゼ-3活性。 (R, S) QKI-5の過剰発現後のBax、Bcl-2、caspase-3、および切断caspase-3の発現に関するウェスタンブロット解析。データは平均値として提示されている。 ± 標準偏差; n = 6. ***p < 対照群に対して0.001；###p < 0.001 対 sh-lncRNA； &&&p < 0.001 対 sh-lncRNA + H-YC + OE-NC。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

YCはマウスにおけるCP誘発性精子形成不全を改善する
精子形成不全マウスを用いてYCの保護効果を評価した。CP群のマウスの精巣および精巣上体では、著しい萎縮、体積の減少、および光沢の消失が認められた。異なる用量のYCを投与したところ、生殖器官の形態、充満度、および色が徐々に改善した（図 6A）。精巣および精巣上体の相対重量は有意に増加し、800 mg/kg YC投与群で最大の効果が観察された（図 6B, C）。

CP群では精子の奇形率が有意に上昇し、頭部の歪み、尾部の巻曲、構造的損傷などの異常が頻繁に認められた。また、精子数および運動率も著しく減少した。YC投与後、精子の形態が改善し(Figure 6D)、精子数が増加し(Figure 6E)、精子運動率が有意に向上した(Figure 6F)。交配実験では、CP群において受胎率および産子数が著しく減少したが、YC投与により受胎率が改善した(Figure 6G)。血清中のテストステロン、卵胞刺激ホルモン、および黄体形成ホルモンの値も、CP群で著しく減少したが、YC投与後に上昇した(Figure 6H-J)。これらの結果は、YCが精子形成不全マウスにおいて、生殖器の萎縮、精子の質、受胎率、および性ホルモンの分泌を改善することを示している。Figure 6Gの定量データはn = 9で得られ、その他の定量データはn = 6で得られた。

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図 6: YCはマウスにおけるCP誘発性精子形成不全を改善する。(A-C) 対照群、シクロホスファミド (CP) 群、およびYC投与群における生殖器官の形態 (A)、精巣指数 (B)、および精巣上体指数 (C)。(D-F) 精子の形態 (D) (40×; スケールバー, 50 µm)、精子密度 (E)、および精子運動率 (F)。 (G) 交配試験による雄の生殖能の評価 (n = 9)。 (H-J) 酵素結合免疫吸着法 (ELISA) キットを用いて測定した血清中の卵胞刺激ホルモン (FSH)、テストステロン、および黄体形成ホルモン (LH) 濃度。データは平均値 ± 標準偏差で示されている; n = 6. ***p < 0.001 対照群比; #p < 0.05, ##p < 0.01, および ###p < 0.001 CP群比。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

YCは精子形成不全マウスにおける精巣の組織病理学的損傷を改善する
YCの精巣組織損傷に対する修復効果を組織染色により評価した。ヘマトキシリン・エオシン染色では、対照群において、損なわれていない組織構造、明確な細胞層、および十分な細胞数が認められた。対照的に、CP群では、著明な精細管の萎縮と構造的乱れ、細胞数の減少、および副精巣管腔の虚脱が認められた。YC投与後、精巣および副精巣の損傷は軽減し、精細管の構造は徐々に回復し、細胞はより整列し、その数も増加した（図 7A, B）。

精巣組織におけるTUNEL陽性細胞の割合は、CP群で有意に増加し、YC投与後に有意に減少した (Figure 7C, D)。Baxの発現および切断型caspase-3/caspase-3比はCP群で著しく増加したが、Bcl-2の発現は減少した。YC投与により、これらの発現パターンは回復した (Figure 7E, F)。免疫蛍光分析の結果、Ki67の蛍光強度はCP群で著しく低下し、YC投与後に有意に増加したことから、精子形成細胞の増殖が回復したことが示唆された (Figure 7G, H)。これらの知見は、YCがCPによって誘発される精巣および精管の組織病理学的損傷を軽減し、過剰なアポトーシスを抑制し、精子形成細胞の増殖を促進することを示唆している。すべての定量データはn = 6で得られた。

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図 7: YCはマウス精巣組織におけるCP誘導性の組織病理学的損傷を改善する。(A, B) YC投与後の精巣 (A) および精巣上体 (B) のヘマトキシリン・エオジン (HE) 染色 (20×; スケールバー, 100 µm)。 (C, D) マウス精巣組織におけるアポトーシスのTUNEL解析 (40×; スケールバー, 50 µm)。 (E, F) YC投与後の精巣組織におけるBax、Bcl-2、caspase-3、およびcleaved caspase-3発現のウェスタンブロット解析。 (G, H) マウス精巣組織におけるKi67発現の免疫蛍光解析 (40×; スケールバー, 50 µm)。データは平均値 ± 標準偏差で示されている; n = 6. ***p < 0.001 versus control; p < 0.001 versus CP. こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

YCはマウスにおける精子形成機能不全および精巣の病理学的損傷を改善する 経由で lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路
YCの効果におけるlncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路の関与についてさらに評価した。CP群のマウス精巣組織では、lncRNA NONMMUT031883.2の発現が有意に減少していた一方で、QKI-5の発現およびp-p38/p38比は著しく増加していた（図8A-D）。YC処理後、lncRNA NONMMUT031883.2の発現は増加したが、一方でQKI-5の発現およびp-p38/p38比は減少した。

経路の特異性をさらに評価するため、sh-lncRNAを用いてマウスにおいてlncRNA NONMMUT031883.2をノックダウンした。lncRNA NONMMUT031883.2の発現レベルは有意に減少し、ノックダウンの成功が確認された（図 8E）。lncRNA NONMMUT031883.2をノックダウンした後、精巣組織におけるQKI-5レベルに有意な変化は見られなかったが、p-p38/p38レベルは有意に上昇した（図 8F, G）。sh-lncRNA投与は800 mg/kg YCの効果を減弱させ、その結果、精巣組織におけるlncRNA NONMMUT031883.2の発現が減少し（図 8H）、p-p38/p38レベルが上昇した（図 8I, J）。CP誘導後、YC投与により精子数と運動率が有意に増加したが、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンはこれらの効果を減弱させた（図 8K, L）。また、YC投与はCP群においてテストステロン、卵胞刺激ホルモン、および黄体形成ホルモンレベルを上昇させたが、lncRNAのノックダウンはこれらの効果を減弱させた（図 8M-O）。

ヘマトキシリン・エオジン染色により、YCが、精細管の萎縮や精原細胞の配列乱れを含むCP誘発性の精巣損傷を改善することが示されました。LncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンは、これらの保護効果を減弱させました（図 8P）。YC投与後、Baxの発現および活性型caspase-3/caspase-3比は低下し、一方でBcl-2の発現は上昇しました。LncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンは、これらのアポトーシス関連タンパク質への影響を反転させました（図 8Q、R）。これらの知見は、YCがlncRNA NONMMUT031883.2をアップレギュレートし、QKI-5をダウンレギュレートしてp38 MAPKパスウェイを抑制することにより、CP誘発後の精子品質を改善し、精巣組織の損傷を軽減することを示しています。すべての定量データは n = 6 で得られました。

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図8YCは精子形成を改善し、精巣の組織病理学的損傷を軽減する 〜経由で lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK経路。(A) マウス精巣組織におけるlncRNA NONMMUT031883.2発現のqRT-PCR解析。 (B-D) YC処理後のマウス精巣組織におけるQKI-5、p-p38、およびp38発現のウェスタンブロット解析。 （E） sh-lncRNA投与後のマウス精巣組織におけるlncRNA NONMMUT031883.2ノックダウンのqRT-PCRによる検証。 (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウン後におけるマウス精巣組織中のQKI-5およびp-p38/p38レベルのウェスタンブロット解析。 (H) YC処理およびsh-lncRNA投与後のマウス精巣組織におけるlncRNA NONMMUT031883.2発現のqRT-PCR解析 (I, J) マウス精巣組織におけるp-p38およびp38発現のウェスタンブロット解析。 (K, L) 精子数（K）および精子運動率 （左） 異なる処置群において。 (M-O) 血清中のFSH、テストステロン、およびLHレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて測定した。 (P) CP投与マウスにおける精巣組織のHE染色（20×スケールバー 100 µm). (Q, R) マウス精巣組織におけるBcl-2、Bax、切断型caspase-3、およびcaspase-3発現のウェスタンブロット解析。データは平均値として示す。 ± 標準偏差；n = 6。***p < コントロール群に対し0.001；p < 0.001 対 CP; p < 0.001 versus 800 mg/kg YC + sh-NC。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

データの可用性：
本研究の結果を裏付ける生データは、Supplementary File 1として提供されています。

補足ファイル1：オリジナルデータ図2〜8に示されている定量分析の根拠となる生の数値データが、このExcelファイルに含まれています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

化学療法による後天的な精子形成不全は、男性不妊の重要な原因である32,33,34。しかし、その具体的な分子メカニズムは十分に解明されていない。本研究の結果は、Yangjing Capsule (YC) が、シクロホスファミド (CP) によって誘発された雄マウスの性ホルモン異常、精巣の組織病理学的損傷、および生殖能低下を用量依存的に改善することを示している。これらの改善は、lncRNA NONMMUT031883.2 のアップレギュレーションおよび QKI-5/p38 MAPK パスウェイの抑制に関連しており、YC がこの軸を介して精原細胞の異常なアポトーシスを減少させる可能性が示唆された。

CPの生殖毒性は広く報告されている。その代謝物であるアクロレインは精巣組織に蓄積し、酸化ストレスやDNA損傷などの経路を通じて生殖細胞のアポトーシスを誘導する。精子形成の初期細胞である精原細胞は、CPの細胞毒性影響に対して特に敏感である。35,36. Cao 他 CP化学療法後の無精子症患者の精巣組織において、DNA損傷チェックポイントシグナリングが有意に濃縮されていた一方で、精子形成に関連する遺伝子は有意にダウンレギュレートされており、精細管の構造的完全性が損なわれていることが明らかになった。37Bcl-2は、ミトコンドリア膜の完全性を維持することで機能する抗アポトーシス蛋白である。38Baxはプロアポトーシス蛋白であり、その発現上昇はミトコンドリアから細胞質へのシトクロムcの放出を促進し、カスパーゼカスケードを活性化させ、アポトーシスを誘導し得る。39,40. Saleh 他 CPへの曝露がマウスの精細管萎縮および間質浮腫を引き起こし、それに伴いBcl-2のダウンレギュレーションとBaxのアップレギュレーションが生じ、最終的に精子数と運動率の低下を招くことが示された。41したがって、CPによって誘導される過剰な精原細胞のアポトーシスを抑制することは、化学療法後の生殖機能を保護するための重要な標的となる可能性がある。本研究において、YCの投与は、CPによって誘導された血清性ホルモン分泌の異常を用量依存的に軽減し、精細管の損傷を修復し、精子の運動性と雄の妊孕性を改善した。また、YCは精巣組織においてBcl-2の発現を増加させ、Baxの発現、切断型caspase-3/caspase-3比、およびTUNEL陽性細胞数を減少させた。 in vitroでは、 YC含有血清はGC-1細胞のアポトーシスを著しく減少させ、細胞生存率を上昇させた。このことは、精原細胞のアポトーシスに対する抑制効果をさらに裏付けるものである。

長鎖非コードRNA（lncRNA）は、精子形成や生殖細胞のアポトーシスを含む生理的および病理的プロセスにおいて重要な調節的役割を果たしています42,43。lncRNAの異常発現は、酸化ストレスやアポトーシス経路の調節を通じて精巣の精子形成機能を損なう可能性があり、男性不妊症の重要な分子メカニズムとなっています44。Wang et al.は、lncRNA DNM3OSがmiR-214-5p/E2F2軸を調節し、その結果、精原細胞の活性低下ならびにアポトーシスと細胞老化の増加を招き、最終的に非閉塞性無精子症に寄与することを見出しました45。また、先行研究では、精原細胞におけるlncRNA NONMMUT074098.2のノックダウンがアポトーシスを誘導することも示されています25。これらの研究は、lncRNAが精原細胞のアポトーシスおよび精子形成の重要な調節因子であることを示しています。本研究では、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンにより精原細胞のアポトーシスが誘導されました。CP誘導後のマウス精巣組織において、このlncRNAの発現は有意に低下しましたが、YCによる介入はこの発現を部分的に回復させました。さらに、YC介入はlncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによって誘導された異常な精原細胞アポトーシスを軽減させたことから、YCの保護効果はこのlncRNAの調節に関連している可能性が示唆されました。

QKI-5はSTARファミリーに属するRNA結合タンパク質であり、標的mRNAのスプライシング、安定性、および翻訳効率を調節することで、いくつかの生理的および病理的プロセスに関与している。46,47先行研究により、QKI-5は生殖系における重要な調節因子であり、その異常発現は下流のp38 MAPK経路の活性化を通じて、生殖細胞のアポトーシスを促進し、精子機能を損なう可能性があることが明らかにされている。25Li ら p38 MAPK経路の活性化を抑制することで、ラットにおけるCP誘発性の精巣組織損傷が軽減され、血液精巣関門機能が回復することが明らかになった。48これらの知見は、QKI-5/p38 MAPK軸が精原細胞のアポトーシスを調節する重要な経路であり、精子形成機能不全の治療における潜在的な標的となり得ることを示唆している。本研究において、CP誘導後のマウス精巣組織ではQKI-5の発現とp38のリン酸化が有意に増加したが、YCの介入によりQKI-5の発現およびp38 MAPK経路の活性化が抑制された。lncRNA NONMMUT031883.2はQKI-5に直接結合したが、QKI-5の発現はlncRNAの安定性に影響を与えなかったことから、lncRNA NONMMUT031883.2が直接的な相互作用を通じてQKI-5の機能を調節している可能性が示唆された。QKI-5のノックダウンは、lncRNA NONMMUT031883.2のノックダウンによって引き起こされたGC-1細胞への損傷を軽減したが、一方でQKI-5の過剰発現はYCがGC-1細胞に及ぼす保護効果を減弱させた。 他 lncRNA NONMMUT074098.2がQKI-5に結合することで、生殖細胞のアポトーシスを調節することが報告された。25本研究の結果は、lncRNA NONMMUT031883.2もまたQKI-5に結合し、精原細胞のアポトーシス調節に関与していることを示している。以上のデータを総合すると、YCはlncRNA NONMMUT031883.2をアップレギュレートし、QKI-5/p38 MAPK経路を抑制することで、精原細胞の異常なアポトーシスを減少させ、CP誘発性の精子形成能不全を軽減させる可能性が示唆される。ただし、YCは多成分からなる生薬処方であり、複数の標的に作用している可能性が高いことに留意すべきである。YC成分による直接的な抗酸化作用、他のシグナル伝達経路の調節、あるいはlncRNA-QKI-5軸に依存しないエピジェネティックな調節など、他のメカニズムが除外できず、それらが観察された保護効果に寄与している可能性がある。

いくつかの限界を認める必要がある。本研究はマウスモデルおよびGC-1細胞株のみで実施されており、不妊症患者からの臨床検体を用いた検証が不足していた。精子形成は複雑なプロセスであり、マウスの完全な精子形成サイクルは約35日間続く49,50。本研究で用いた30日間のYC投与レジメンは、完全な精子形成サイクルをカバーしていなかった。したがって、精子形成サイクル全体にわたるYCの治療効果を体系的に評価するためには、35日以上の介入プロトコルを採用した今後の研究が必要である。加えて、lncRNA NONMMUT031883.2がQKI-5に結合した後の正確な分子イベント、例えばQKI-5のスプライシング活性や細胞内局在の変化、および下流のスプライシングターゲットの認識と制御については、さらなる探索が必要である。さらに、YC治療によってlncRNA NONMMUT031883.2の発現が上昇したが、その上流の転写因子やエピジェネティックなメカニズムはまだ解明されていない。YC誘導性のlncRNA NONMMUT031883.2発現の分子基盤を明らかにするには、プロモーター解析やクロマチン免疫沈降アッセイを組み込んだ今後の研究が必要である。さらに、化学療法に伴う男性不妊症患者におけるYCの効果を評価し、精巣組織または精液中のlncRNA NONMMUT031883.2の発現を測定することで、診断または治療マーカーとしての潜在的な臨床的価値を判断することが今後の課題である。

結論として、YCはlncRNA NONMMUT031883.2をアップレギュレートし、QKI-5/p38 MAPKパスウェイの活性化を抑制することで、マウスにおける精原細胞のアポトーシスと精巣損傷を減少させ、精子形成機能不全を軽減する。これらの知見は、精子形成機能不全に対するYCの保護効果の根底にある分子メカニズムを明らかにし、精子形成の調節におけるlncRNA NONMMUT031883.2およびQKI-5/p38 MAPKパスウェイの役割に関する現在の理解を広げるものである。lncRNA NONMMUT031883.2およびQKI-5は、男性の精子形成機能不全における潜在的な治療標的となる可能性がある。

開示事項

著者らは、金銭的または非金銭的な利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（grant no. 82374257）、江蘇省中医院の第4回ピーク学術人材育成プログラム（grant no. k2026yrc74）、および江蘇省の中医学・中西医結合科学研究プロジェクト（grant no. CYTF2026019）の支援を受けて行われました。

材料

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名前会社カタログ番号コメント
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559RNA安定性アッセイに使用する転写阻害剤
AMV逆転写酵素Takara, Tokyo, Japan2621相補的DNA合成用酵素
Annexin V-APC/PI検出キットBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191アポトーシスのフローサイトメトリー解析用キット
抗退色封入剤MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042蛍光保存用封入剤
Bax一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAAF0120Bax検出用一次抗体
BCAキットMacklin, Shanghai, ChinaB917925タンパク質濃度決定用キット
Bcl-2一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Bcl-2検出用一次抗体
牛血清アルブミンBioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070ブロッキング剤
Calcein/PI検出キットBeyotime, Shanghai, ChinaC2015M生死細胞染色用キット
Caspase-3活性測定キットBioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866caspase-3活性測定用キット
Caspase-3一次抗体Abcam, MA, USAab184787caspase-3検出用一次抗体
CCK-8試薬MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301細胞生存率評価用試薬
切断型caspase-3一次抗体Abcam, MA, USAab32042切断型caspase-3検出用一次抗体
シクロヘキシミドMacklin, Shanghai, ChinaH823111タンパク質安定性アッセイに使用するタンパク質合成阻害剤
シクロホスファミドMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420精子形成不全の誘導に使用
DAPI試薬Beyotime, Shanghai, ChinaC1006核対比染色剤
DMEM培地Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302GC-1細胞用細胞培養培地
ECL作業溶液Solarbio, Beijing, ChinaSW2030タンパク質バンド検出用化学発光基質
エトポシドMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629アポトーシス誘導剤
フローサイトメーターBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburアポトーシス解析用装置
FlowJoソフトウェアBD Biosciences, CA, USAv10.8フローサイトメトリーデータ解析用ソフトウェア
蛍光顕微鏡Leica, Heidelberg, GermanyDM3000蛍光イメージング用装置
蛍光標識二次抗体IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303免疫蛍光検出用二次抗体
卵胞刺激ホルモンELISAキットHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871m血清卵胞刺激ホルモン測定用キット
GAPDH一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAT0004ウェスタンブロッティング用ローディングコントロール抗体
GC-1細胞Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302マウス精原細胞株
ゲルイメージングシステムJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880ゲルおよびブロット可視化用イメージングシステム
ゲルイメージングシステムInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500ウェスタンブロット用化学発光イメージングシステム
ヤギ抗ウサギIgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303ウェスタンブロッティング用二次抗体
ヘマトキシリン溶液BioLab Technology, Beijing, ChinaYT165組織学的解析用核染色剤
塩酸エタノール分化溶液Beyotime, Shanghai, ChinaC0163Sヘマトキシリン染色用分化試薬
ImageJソフトウェアNational Institutes of Health, USA1.54h画像定量化用ソフトウェア
IP細胞溶解バッファーBeyotime, Shanghai, ChinaP0013免疫沈降およびタンパク質抽出用溶解バッファー
Ki67一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Ki67検出用一次抗体
LDH細胞毒性アッセイキットBeyotime, Shanghai, ChinaC0016乳酸脱水素酵素放出および細胞損傷測定用キット
光学顕微鏡Olympus, Tokyo, JapanCKX53精子数計測および形態観察に使用
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001トランスフェクション試薬
マイクロプレートリーダーMolecular Devices, CA, USASpectraMax Mini吸光度測定用装置
マウス黄体形成ホルモンELISAキットHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770m血清黄体形成ホルモン測定用キット
マウステストステロンELISAキットHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101m血清テストステロン測定用キット
中性ゴムBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253組織切片用封入剤
p38一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAAF6456全p38検出用一次抗体
パラホルムアルデヒドMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333細胞および組織用固定剤
PARISキットInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921核および細胞質RNA分画用キット
PCRシステムABI, CA, USAABI PRISM 7300リアルタイムPCR装置
p-p38一次抗体Affinity Biosciences, OH, USAAF3455リン酸化p38検出用一次抗体
プロテイナーゼK溶液Beyotime, Shanghai, ChinaST532TUNEL染色前の組織透過処理用試薬
PVDF膜Millipore, MA, USAISEQ00010ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜
QKI-5一次抗体Abcam, MA, USAab126742QKI-5検出用一次抗体
RNA結合バッファーInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DRNA-タンパク質結合反応用バッファー
SDSローディングバッファーBeyotime, Shanghai, ChinaP0286SDS-PAGE用試料負荷バッファー
ストレプトアビジン磁気ビーズMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208ビオチン標識RNAプローブ捕捉用磁気ビーズ
TB Green FAST qPCRキットTakara, Tokyo, JapanCN830S定量PCR用試薬キット
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275透過処理試薬
TRIzol試薬Invitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CN全RNA抽出用試薬
TUNEL検出溶液Beyotime, Shanghai, ChinaC1086DNA断片化検出用試薬
キシレンMacklin, Shanghai, ChinaX821391パラフィン除去および組織透明化用試薬

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