本研究では、葉酸依存性のギ酸クリアランスを低下させるよう設計された、メトトレキサート前処理済みのラットによるメタノール中毒モデルを用いて、エタノールとホメピゾールの腎保護効果を比較しました。腎臓のアウトカムは、腎機能指標、腎障害バイオマーカー、炎症マーカー、酸化還元関連バイオマーカー、および組織病理学的所見を用いて評価しました。
この記事について
サマリー
要約
メタノール中毒は、代謝性アシドーシス、臓器障害、および死を招き、腎障害は不良な転帰の予測因子となる。メトトレキサートで前処理したメタノール中毒ラットモデルを用いて、エタノールとフォメピゾールの比較を行った。30匹の雄性Wistarラットを、対照群、メトトレキサート（MTX）群、MTX + メタノール群、MTX + メタノール + フォメピゾール群、およびMTX + メタノール + エタノール群の5群に割り付けた（各群 n = 6）。MTXを1～7日目に0.3 mg/kg/dayで経口投与した。メタノール曝露の3群には、8日目に3 g/kgのメタノールを経口投与した。フォメピゾールは、メタノール投与の4時間後に15 mg/kgを腹腔内投与し、その後12、24、36時間後に10 mg/kgを投与した。エタノールは、メタノール投与の4時間後に0.5 g/kgを1回経口投与した。サンプルは10日目に採取した。事前の主要評価項目は設定しなかった。腎機能、腎ホモジネート中の損傷マーカー、炎症性バイオマーカー、血液由来のレドックス関連バイオマーカー、および組織病理学的所見を評価した。分散分析（ANOVA）の結果、腎ホモジネート中のシスタチンC（p = 0.003）、インターロイキン-6（IL-6; p = 0.013）、腎障害分子-1（KIM-1; p = 0.017）、血清尿素（p = 0.017）、および血清クレアチニン（p < 0.001）において、群間に有意差が認められた。Duncanのポストホック検定により、これらパラメータの値は、両解毒剤群ともにMTX + メタノール群よりも低いことが示された。2つの解毒剤群間に有意な生化学的差異は認められなかった。組織病理学的スコアは、解毒剤群でより低かった。フォメピゾールは記述的なパターンにおいてより良好な結果を示したが、今回の知見ではエタノールに対する優位性は確立されなかった。分散の不均一性、多重検定、解毒剤投与レジメンの不一致、毒性動態および酸塩基平衡測定の欠如、および追跡期間の短さが、結果の解釈を制限している。今後の研究では、メタノールおよびギ酸の直接測定、腎細胞質アルコール脱水素酵素活性の測定、腎生化学的アウトカムとの相関分析、より長い追跡期間、および比較可能な解毒剤レジメンを含めるべきである。
概要
メタノール（メチルアルコール）中毒は、世界的に高い罹患率と死亡率を伴う重大な毒性学的救急疾患であり、特に違法に製造されたアルコール飲料の摂取後に発生します。メタノール自体の毒性は比較的低いものの、主に肝臓においてアルコール脱水素酵素（ADH）によりホルムアルデヒドに代謝され、続いてギ酸へと代謝されます。その結果、ギ酸が蓄積することで、高アニオンギャップ性代謝性アシドーシス、視神経症、および多臓器不全が引き起こされる可能性があります1,2。ホルムアルデヒドは短寿命の中間体である一方、ギ酸の蓄積は、ミトコンドリアのシトクロムオキシダーゼ阻害、細胞低酸素症、および酸化ストレスを介して毒性に寄与する主要な要因と考えられています 3。早期診断、代謝性アシドーシスの補正、拮抗薬による治療、および血液透析が、死亡率を低下させるための主な治療アプローチとなります2。
メタノール中毒では、通常、潜伏期間を経て臨床症状が現れます。悪心、嘔吐、腹痛、および軽度の中枢神経系抑制に続き、アニオンギャップ増大を伴う代謝性アシドーシス、呼吸困難、意識状態の変化、および視覚症状が現れることがあります1,2。視覚のぼやけ、光恐怖症、散瞳、視神経乳頭浮腫、そして重症例では永続的な失明が、ギ酸によるミトコンドリア・シトクロムオキシダーゼ阻害に関連する最も特徴的な毒性影響です1,2。現在の治療戦略には、支持療法、重曹による代謝性アシドーシスの補正、ホリニック酸または葉酸の投与、エタノールまたはフォメピゾールによるアルコール脱水素酵素の阻害、および選択的な重症例におけるメタノールとギ酸の除去を促進するための血液透析が含まれます3,4。フォメピゾールは、より予測可能な薬物動態、簡便な投与方法、および副作用のリスクが低いことから、第一選択の解毒剤としてますます重視されています。しかし、エタノールは入手しやすく低コストであるため、依然として重要な代替手段となっています4,5,6,7:
視神経および中枢神経系の損傷は、伝統的にメタノール毒性の主要な徴候であると考えられてきましたが、腎臓も臨床的に重要な標的臓器であることがますます認識されるようになっています8,9,10。メタノール特有のコホートにおいて、急性腎障害（AKI）は、より深刻な代謝性アシドーシス、呼吸不全、多臓器不全、人工呼吸器管理、体外治療、入院期間の長期化、および院内死亡率の上昇と関連していました。また、脱水、敗血症、横紋筋融解症、および急性膵炎も、AKI発症に関連する因子として特定されています8,10。Changらによって報告されたコホートでは、多変量解析においてAKIが院内死亡率と独立して関連し続けていましたが、回顧的な観察研究のデザインであるため、AKI自体が死亡の原因となったことは立証されていません8。したがって、メタノール中毒におけるAKIは、疾患の重症度が高く、予後が悪いことを示すマーカーとして解釈されるべきです。対照的に、Wangらによる系統的レビューでは、主にメタノールおよびエチレングリコールを含む毒性アルコール中毒後の腎予後がより広範囲に評価されており、その結論はメタノールに特化したものではありません9。同レビューでは、相当数の短期死亡が確認された一方、長期的な腎機能回復、継続的な透析、および標準化された腎予後報告に関する重要なエビデンスの不足が指摘されました9。
メタノール毒性とAKI（急性腎障害）の関係は、多因子によるものであると考えられます。毒性代謝物の蓄積は、ミトコンドリア阻害、細胞低酸素症、重度の代謝性アシドーシス、およびレドックス不均衡を通じて寄与する可能性があり、一方で、容量減少、血行動態の悪化、横紋筋融解症、敗血症、呼吸不全、多臓器不全など、臨床コホートで記録されている全身的要因が、さらなる腎不全を誘発する可能性があります1,2,3,8,10。これらの経路は、メタノール中毒と腎障害の間に、生物学的および臨床的に妥当な関連性を示しています。腎臓の代謝異常は、血中ギ酸への曝露、ミトコンドリア阻害、代謝性アシドーシス、および全身的な血行動態ストレスに起因する可能性があります。しかし、本研究ではメタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸の濃度、腎臓でのADH活性、およびミトコンドリア機能が直接的に評価されていないため、腎組織内におけるアルコールおよびアルデヒド代謝の具体的な寄与については不明なままです。
メタノール毒性の実験的研究における主要な手法上の課題は、ラットがヒトよりもギ酸を速く代謝することです。ヒトにおけるメタノール毒性の主因はギ酸の蓄積ですが、ラットは葉酸依存性のギ酸代謝効率が非常に高いため、同等の蓄積とそれに伴う臓器障害を再現させることは困難です。そのため、メタノール毒性の実験モデルでは、葉酸代謝を抑制する薬剤が頻繁に使用されます11,12。本研究では、ラットにおける葉酸依存性のギ酸クリアランスを低下させ、メタノール毒性への感受性を高めるために、メトトレキサート（MTX）による前処理を行いました11,12。メトトレキサート自体がメタノール毒性を誘発することはありませんが、得られるモデルがヒトのメタノール中毒のあらゆる側面を再現するわけではありません。メトトレキサートが腎機能、酸化ストレス、および炎症性の結果に独立して影響を及ぼす可能性があるため、前処理に関連する変化を特徴付けるためにMTXのみの投与群を設けました。これらの制限はあるものの、本モデルは、同一のメトトレキサート前処理およびメタノール曝露プロトコルを受けた実験群間で腎機能の結果のパターンを比較し、それらの結果を生化学的、炎症性、酸化ストレス、および組織病理学的レベルで評価するための、制御された前臨床プラットフォームを提供します。
アルコール脱水素酵素（ADH）の阻害は、メタノール中毒に対する解毒治療の根幹をなします。臨床現場でこの目的にもっとも一般的に使用される2つの薬剤は、エタノールとホメピゾール（4-メチルピラゾール）です。エタノールは、メタノールよりもADHへの親和性が高いため、競合的に毒性代謝物の生成を抑制します。一方、強力かつ選択的なADH阻害剤であるホメピゾールは、メタノールからホルムアルデヒドおよびギ酸への変換を直接的に防止します5,6。しかし、これら2つの解毒剤の臨床的有効性、安全性、投与の簡便性、および臓器保護効果の比較については、完全な合意が得られていません。ホメピゾールは、投与量が標準化されており、血清濃度のモニタリングが不要で、中枢神経系抑制がなく、薬物動態特性がより予測可能であるため、多くの施設で有利であると考えられています。対してエタノール療法は、低血糖、肝毒性、意識状態の変化、および集中モニタリングの必要性などの潜在的なデメリットを伴います6,7。逆に、大規模な臨床比較では、死亡率および臨床結果に対するこれら2つの解毒剤の効果は同等である可能性が示唆されています。集団中毒症例を評価したZakharovらによる研究では、ホメピゾールとエタノールの間で生存率に有意な差は認められませんでした5。
メタノール中毒におけるAKIの予後的な重要性にもかかわらず8,9,10、腎損傷は眼毒性や神経毒性に比べて大幅に注目されておらず、エタノールとフォメピゾールの比較的な腎影響については依然として十分に特性解析されていません。したがって、2つの解毒戦略が異なる腎予後パターンに関連しているかどうかを判断するために、従来の腎機能検査、早期尿細管損傷バイオマーカー、炎症性サイトカイン、酸化還元関連パラメータ、および組織病理学を組み込んだ腎臓中心の評価が必要です。さらに、この対照的なメトトレキサート前処置ラットモデルは、定義された実験条件下で、候補となる解毒剤、腎臓標的治療、および支持療法の前臨床評価を促進する可能性があります。本モデルの研究価値は、ヒトのメタノール中毒における臨床的および代謝的な複雑さを直接的に再現することではなく、急性実験設定における比較評価にあると考えられます。
齧歯類とヒトの間でメタノール代謝に差があること、および葉酸依存性のギ酸クリアランスを減少させるために薬理学的前処理を用いることは、依然として重要な手法上の限界となっている。さらに、実験条件下で誘発される急性毒性は、臨床現場で遭遇する多様な曝露期間や併存疾患を完全に反映していない可能性がある。したがって、この動物モデルから得られた知見は予備的な前臨床エビデンスとみなされるべきであり、ヒトにおける治療決定を直接的に支持するために使用すべきではない。臨床的な推論を行う前に、適切に設計された臨床研究による確認が必要である。このような背景から、本研究における主要な知識のギャップは、メトトレキサート前処理ラットモデルにおいて、エタノールとホメピゾールが、従来の腎機能指標、尿細管傷害バイオマーカー、炎症性サイトカイン、レドックス関連パラメータ、および組織病理学的所見という異なる腎予後パターンに関連しているかである。研究の仮説は、エタノールまたはホメピゾールのいずれかによるアルコール脱水素酵素の阻害が腎傷害の軽減に関連し、評価した予後領域間で治療間に潜在的な差があるということであった。腎保護作用は、MTX + Methanol群よりも良好な腎予後パターンを示すことと操作的に定義した。このパターンには、血清尿素およびクレアチニン濃度の低下、腎臓におけるkidney injury molecule-1 (KIM-1)、シスタチンC、腫瘍壊死因子α (TNF-α)、インターロイキン-6 (IL-6)、およびインターロイキン-1β (IL-1β) レベルの低下、血清マロンジアルデヒド (MDA) 濃度の低下、血清スーパーオキシドディスムターゼ (SOD) 活性、血液還元型グルタチオン (GSH) レベル、および血液カタラーゼ (CAT) 活性の上昇、ならびに尿細管変性、尿細管壊死、糸球体傷害、血管うっ血、間質性炎症、および線維化に対する組織病理学的スコアの低下が含まれる。腎保護作用は単一の複合スコアとして算出せず、個々の予後をこれらの相補的な領域にわたって総合的に評価した。したがって、本研究は、このモデルにおける腎機能、尿細管傷害、炎症、レドックス状態、および腎組織病理学に対するエタノールとホメピゾールの効果を比較することを目的とした。
プロトコル
すべての実験手順は、Kırşehir Ahi Evran University動物実験局所倫理委員会の承認（承認決定番号1、会議番号12、承認日：2025年6月12日）を得ており、実験動物の飼育および使用に関する国内および国際的なガイドラインに従って実施されました。研究全体を通じて、痛みと苦痛を最小限に抑え、必要最小限の動物数を使用するための措置が講じられました。
化学薬品の調製
実験的なメタノール毒性モデルの構築を促進するための前処理剤として、メトトレキサートを使用した。ラットではヒトよりも葉酸依存性のギ酸酸化が効率的であるため、ギ酸のクリアランスを減少させ、メタノール毒性への感受性を高めるためにメトトレキサートによる前処理を行った。これはメタノール曝露の代用としてではなく、モデルの感度を高めるための介入として使用した11,12。メトトレキサートは500 mg/5 mLの製剤として提供され、これはストック濃度100 mg/mLに相当する。この製剤を滅菌0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈し、最終的な作業濃度を0.06 mg/mLとした。この作業溶液を5 mL/kgの用量で経口投与し、これはMTX投与量0.3 mg/kgに相当する。試験開始時に体重200–220 gのラットの場合、1日あたりの投与量は1匹あたり1.00～1.10 mLの範囲となり、試験開始時に記録した体重を用いて個別に算出した。7日間のMTX前処理期間中に体重の再測定は行わなかった。メトトレキサートを1日1回、7日間連続して投与し（試験1〜7日目）、MTX前処理プロトコルの完了後、試験8日目にメタノールを投与した。このレジメンは、既報の経口投与によるMTX前処理モデルと一致している13。
メタノール（純度≥99.8%）を、投与当日に滅菌蒸留水で希釈し、20% (v/v) 水溶液として調製した。この作業溶液は、メタノール1量分に滅菌蒸留水4量分を混合して調製した。既報のメタトレキサート前処理メタノール中毒ラットモデルに従い、試験8日目にグループ3〜5に対してメタノールを3 g/kgの用量で単回経口投与した。メタノール投与前の食事および飲水の制限は行わなかった。必要な投与量は各個体の体重に基づいて個別に算出した。20%メタノール溶液の場合、投与量は約18.9 mL/kgであった。体重約220 gのラットでは、この用量はメタノール0.66 gに相当し、最終的な経口投与量は約4.2 mLであった。このメタノール曝露レジメンは、既報のメタトレキサート前処理急性メタノール毒性ラットモデル13,14,15との比較可能性を維持するために選択した。
フォメピゾールの調製液は、滅菌済みの0.9%塩化ナトリウム溶液を用いて最終濃度10 mg/mLで調製した。メタノール投与の4時間後に15 mg/kgを腹腔内投与（負荷量）し、その後12、24、36時間後に10 mg/kgを腹腔内投与（維持量）した。調製液濃度10 mg/mLにおける投与量は、負荷量で1.5 mL/kg、各維持量で1.0 mL/kgであった。試験開始時の体重が約220 gのラットの場合、これらの投与量は負荷量で約0.33 mL、各維持量で0.22 mLに相当した。すべての投与量は、試験開始時に記録した体重を用いて算出した。フォメピゾールの負荷量および維持量は、確立されたメタノール中毒の治療推奨事項1,6を参考にして設定した。
解毒剤の比較対照処置としてエタノールを使用した。無水エタノール（純度≥99.8%）を、無水エタノール1容量に対して滅菌蒸留水4容量の割合で混合して希釈し、最終濃度20% (v/v) の水性調製液を作製した。メタノール投与の4時間後に、エタノール0.5 g/kgを単回経口投与し、維持投与は行わなかった。投与量は約3.2 mL/kgであった。試験開始時の体重が約220 gのラットの場合、最終的な経口投与量は約0.70 mLに相当した。投与量は試験開始時に記録した体重を用いて算出した。エタノールの濃度、投与量、投与経路および投与タイミングは、エタノールを解毒剤の比較対照として用いた既報のメトトレキサート前処理ラットモデルに基づいて選択した13,14。
すべての溶液は投与当日に調製し、均一な外観であることおよび目視可能な粒子状物質が存在しないことを確認した。経口投与は、ステンレス製ガバージュカニューレを用いて行った。ガバージュの際、カニューレを口腔から食道へ慎重に挿入し、逆流、口腔内への漏出、誤嚥、および呼吸困難を回避した。腹腔内投与は、滅菌済みの使い捨て注射器と針を用い、無菌条件下で実施した。化学物質の調製および投与に関するすべての手順は、機関の実験室安全規定に従って行われた。
実験動物、飼育条件およびランダム化
体重 220 ± 20 g、週齢 8～12 週の成熟したオスWistar albinoラット計30 匹を、トルコ、クルシェヒールのAhi Evran University実験動物研究室より入手した。Wistarラットを選択した理由は、実験的毒性および腎保護研究で広く使用されており、既報の研究との比較が可能であるためである。動物は 24 ± 2 °C の環境下、12 時間明期/12 時間暗期のサイクルで飼育した。10 日間の実験期間を通じて、標準ペレット飼料と水道水を自由摂取させた。実験手順に先立ち、すべての動物に 7 日間の順化期間を設けた。
30匹のラットを、コンピューター支援によるランダム割り付け手順を用いて、1群あたり6匹を目標として5つの実験群に割り付けた。各ラットに対して1から5までのランダムな整数を生成し、対応する実験群に割り付けた。ある群が6匹に達した後は、その群が選ばれた場合の抽選を破棄し、空きのある群が選択されるまで新しい乱数を生成した。この手順を30匹すべてのラットに割り付けるまで繰り返し、結果として各群6匹となった。同一の研究者がランダム割り付けの生成と実施を行い、別の割り付け担当者は設けていない。第1群（対照群）には実験薬の投与は行わず、他の群と同様のスケジュールでエンドポイントサンプリングを実施した。第2群（MTX）には、メトトレキサートを0.3 mg/kgで7日間、経口投与した。第3群（MTX + メタノール）には、メトトレキサートを7日間投与し、その後、試験8日目にメタノールを3 g/kg投与した。第4群（MTX + メタノール + フォメピゾール）には、メトトレキサートによる前処置後にメタノールを投与し、その4時間後に4-メチルピラゾールの投与を開始した。第5群（MTX + メタノール + エタノール）には、メトトレキサートによる前処置後にメタノールを投与し、その4時間後にエタノールを投与した。
メタノール曝露の3つのグループすべてに同じMTX前処理およびメタノール投与プロトコルが適用され、曝露後の解毒治療のみが異なっていた。実験グループの割り当て、投与プロトコル、解毒治療のタイミング、および検体採取プロセスを図1にまとめた。5つの独立したグループを用いた固定効果の一元配置分散分析（one-way ANOVA）について、事前パワー分析を実施した。大きな標準化効果量（Cohen’s f = 0.70）、有意水準0.05、および統計的パワー80%と仮定し、必要最小限の総サンプルサイズを算出したところ、30匹（1グループあたり6匹）となった。総サンプルサイズ30における算出パワーは約80.9%であった。想定した効果量（Cohen’s f = 0.70）は、この急性毒性モデルにおいてグループ間に全体的に大きな効果があるという研究者の予測に基づき、実験前に規定した。この想定は、パイロットデータや特定の先行研究から導き出された推定値ではなく、研究者の判断に基づいたものである。本研究において、前向きに指定された単一の主要評価項目は存在せず、サンプルサイズの算出は、5つの実験グループ間のオムニバス比較における想定される大きな全体的効果に基づいている。事後的に主要評価項目を、前向きに規定されたエンドポイントとして指定することはできない。したがって、このサンプルサイズ算出は、個々の評価項目やペアワイズ比較に対して十分なパワーを提供するものではない。
メタノール中毒および解毒治療プロトコル
順化期間の後、グループ2〜5の動物にメトトレキサートを1日1回、7日間連続で投与した（研究日1〜7日目）。研究日8日目に、グループ3〜5の動物に20%メタノール溶液を3 g/kgの用量で経口投与した。メタノール投与前に絶食やその他の餌または水の制限は行わなかった。
MTX + Methanol + Fomepizole群では、メタノール投与の4時間後に15 mg/kgを腹腔内負荷投与し、その後、メタノール投与の12、24、36時間後に10 mg/kgを腹腔内維持投与した。MTX + Methanol + Ethanol群では、メタノール投与の4時間後に0.5 g/kgのエタノールを経口投与（gavage）し、エタノールの維持投与は行わなかった。これら2つの解毒剤投与レジメンは、確立されているフォメピゾールの投与推奨量および既報のエタノール対照プロトコル1,6,13,14を反映して選択した。これらのレジメンは、用量、投与経路、または曝露量を一致させた治療を提供することを目的として設計されたものではない。したがって、反復的な腹腔内フォメピゾール投与レジメンと単回経口エタノール投与は、薬理学的に不均等な比較となった。経口投与の成功は、処置中の逆流、口からの漏出、または呼吸困難がないことで確認した。腹腔内投与の成功は、注射部位に漏出、出血、または著明な腫脹がないことで確認した。
投与後、動物の全身状態、運動能、摂食量、姿勢、被毛の外観、および毒性徴候を定期的に観察した。治療スケジュールは、メタノールによる毒性代謝物の生成を開始させつつ、解毒剤の防御的および治療的効果を評価できるように設計した。
安楽死、人道的なエンドポイントおよび試料採取
実験期間中、すべての動物について、全身状態、摂餌量および摂水量、可動性、および行動変化を毎日評価した。人道的なエンドポイントの基準は、顕著な嗜眠、食物または水の摂取不能、深刻な体重減少、可動性の制限、異常姿勢、持続的な立毛、または明らかな苦痛の兆候としてあらかじめ定義した。これらの基準のいずれかに該当した動物は、人道的な安楽死処置を行う計画であったが、本研究期間中にあらかじめ定義した人道的なエンドポイント基準に達した動物は認められなかった。
5つの実験群のすべての動物を、試験10日目に安楽死させた。MTX + Methanol群、MTX + Methanol + Fomepizole群、およびMTX + Methanol + Ethanol群では、このエンドポイントは試験8日目の単回メタノール投与から48時間後に相当した。Control群は試験10日まで未処置のままとし、MTX単独群は7日間のMTX投与プロトコルの完了後、試験10日まで観察した。したがって、5つの群すべてが同一の総試験期間となり、同じ試験日に安楽死およびサンプル採取が行われた。
深い麻酔を導入するために、ケタミンとキシラジンを使用した。麻酔の深さは、足底逃避反射の消失により確認した。深い麻酔が導入された後、心腔穿刺により血液サンプルを採取した。適切なシリンジと針を用いて、約3–5 mLの血液を採取した。血清尿素およびクレアチニン濃度、血清SOD活性、および血清MDA濃度の測定に用いる血液は、抗凝固剤不含のチューブに移し、完全に凝固させた。GSHレベルおよびCAT活性の測定に用いる血液は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）含有チューブに別途採取し、凝固工程を経ずに処理した。完全に凝固した後、血清サンプルを4 °Cで3,000 × g、10–15分間遠心分離した。分離した血清は、分析まで−80 °Cで保存した。血清の分離が成功したことは、透明で溶血のない外観により確認した。採血後、深い麻酔下で放血により安楽死させた。その後、正中切開を施し、両腎臓を慎重に摘出した。周囲の脂肪および結合組織を除去した後、腎臓を冷生理食塩水で洗浄した。組織サンプルは、組織病理学的分析用と生化学的分析用に分けた。組織病理学的検査に割り当てたサンプルは、10%中性緩衝ホルムアルデヒドに浸漬した。生化学的分析に割り当てたサンプルは、適切にラベルを貼り、−80 °Cで保存した。
サンプルの収集、生化学的分析、および結果の評価は、実験群を伏せられた研究者によって行われました。解析から除外された動物はありませんでした。
生化学的分析
血清尿素濃度は、自動生化学分析装置を用い、酵素的なウレアーゼ-グルタミン酸脱水素酵素速度論的アッセイにより測定した。尿素はウレアーゼによって加水分解されてアンモニアが生成され、それがグルタミン酸脱水素酵素の存在下で2-オキソグルタリン酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH) と反応した。NADHの消費に起因する吸光度の減少を速度論的に測定した。血清クレアチニン濃度は、同じ自動生化学分析装置を用い、比色法により測定した。
血清スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）活性は、キサンチン-キサンチンオキシダーゼ系によるスーパーオキシドラジカルの生成と、それが2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chlorideと反応して有色のホルマザン生成物を形成することに基づいた比色法を用いて測定した。終点吸光度は505 nmで測定した。血清マロンジアルデヒド（MDA）濃度は、チオバルビツール酸反応を用いて測定した。血清試料に冷トリクロロ酢酸を混合してタンパク質を沈殿させ、4 °Cで5分間、7,500 × gで遠心分離した。得られた上清に等量のチオバルビツール酸を混合し、90 °Cで60分間インキュベートした。その後、反応チューブを冷水浴で10分間冷却し、532 nmで吸光度を測定した。MDA濃度は、対応する検量線から算出した。還元型グルタチオン（GSH）は、EDTA抗凝固血を用いて改変エルマン法により測定した。トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿後、脱タンパク試料をpH 8.2の500 mM Tris緩衝液中で5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)と反応させ、412 nmで吸光度を測定した。カタラーゼ（CAT）活性は、EDTA抗凝固血を用いて2段階比色法により測定した。試料を既知量の過酸化水素とともにインキュベートし、酵素反応を停止させた後、残存する過酸化水素を発色試薬を用いて405 nmで測定した。
SOD活性およびMDA濃度は血清で測定され、GSHレベルおよびCAT活性は腎組織ホモジネートではなくEDTA抗凝固血液で測定されたため、これらの酸化還元関連パラメータの組織全タンパク質濃度による標準化は適用されませんでした。酸化還元関連バイオマーカープロファイルの解釈において、血清MDA濃度の高い値は脂質過酸化の亢進と一致すると見なし、血清SOD活性、血液GSHレベル、および血液CAT活性の低い値は抗酸化能の低下を示すものと見なしました。これとは逆方向の変化は、より好ましい酸化還元関連プロファイルとして解釈しました。
腎組織の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）による測定では、−80 °Cで保存した約50 mgの腎組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む500 µLのホモゲナイズ緩衝液中で氷上にてホモゲナイズし、組織と緩衝液の比率を1:10 (w/v)に固定した。ラット1匹につき、個別の動物特異的な腎組織ホモゲネートを1検体作成した。異なる動物からのサンプルは独立して処理し、いかなる段階においてもプールしなかった。ホモゲネートを4 °C、14,000 × gで10分間遠心分離し、各動物から得られた上清を個別に回収して、予定していた腎組織分析用に分注した。総タンパク質濃度の別途測定は行わなかったため、組織ELISAの結果についてタンパク質による標準化は行わなかった。対応するアッセイ固有の標準曲線から算出した最終濃度は、TNF-αおよびIL-6についてはng/L、IL-1β、KIM-1、およびcystatin Cについてはng/mLとして表記した。
腎障害バイオマーカーとしてKidney injury molecule-1 (KIM-1)およびシスタチンCを評価し、腎炎症マーカーとして腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、インターロイキン-6 (IL-6)、およびインターロイキン-1β (IL-1β)を評価した。これら5つの分析物は、すべてラット特異的ELISAキットを用い、製造元のプロトコルに従って腎組織ホモジネート中で測定した。各アッセイの分析感度および測定範囲は、TNF-αが2.51 ng/Lおよび5–1,000 ng/L、IL-6が0.052 ng/Lおよび0.1–40 ng/L、IL-1βが0.08 ng/mLおよび0.2–60 ng/mL、KIM-1が0.01 ng/mLおよび0.05–10 ng/mL、シスタチンCが0.25 ng/mLおよび0.5–100 ng/mLであった。分析前に、すべての試薬、標準品、および腎組織上清を室温に戻した。標準曲線は、製造元の推奨に従い、各アッセイの実行ごとに個別に作成した。抗体があらかじめコートされたウェルに標準品および腎組織上清を加え、次に corresponding なビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体を加えた。サンプルおよびELISA試薬を37 °Cで1時間インキュベートした。自動マイクロプレートウォッシャーを用いて5回洗浄した後、基質溶液AおよびBを加え、37 °Cで10分間インキュベートした。酸性停止液を用いて呈色反応を停止させ、450 nmで吸光度を測定した。各分析物について、ブランク補正後の吸光度値を、対応するアッセイ固有の標準曲線を用いて濃度に変換した。
すべての生化学的分析は標準化された条件下で実施され、すべてのサンプルは同一の手順で処理された。腎組織のELISA測定は2連（duplicate）で行った。各分析物について、2つのテクニカルレプリケートウェルの平均値を算出し、1匹の動物あたりの単一値とした。同一動物のホモジネートから得られたテクニカルレプリケートウェルおよび別々の分注分は、独立した観察値とはみなさなかった。個々の動物を実験単位とし、各パラメータについて1匹あたりの結果を統計解析に含めた。
組織病理学的処理および腎障害スコアリング
組織サンプルは、標準的な組織病理学的手法を用いて顕微鏡評価のために処理した。腎臓組織を10%中性緩衝ホルムアルデヒドを用い、室温で72 h固定した。固定後、組織を50%、70%、80%、96%、100%の段階的なエタノール濃度で脱水し、各濃度で1 h保持した。その後、2段階のキシレン処理により組織を透徹させ、パラフィンブロックに包埋した。回転式ミクロトームを用いて、パラフィンブロックから厚さ5 µmの切片を作成した。
ヘマトキシリン・エオシン染色では、切片を脱パラフィン化および再水和し、ヘマトキシリンで5分間染色した後、流水下で5分間洗浄した。酸性アルコールを用いて分化させ、その後、切片をアンモニア水に1分間浸漬させた。次に、エオシンで2分間対比染色を行った。その後、切片を昇順アルコール系列で脱水し、キシレンで透徹させ、適切な封入剤で封入した。
Massonのトリクローム染色では、切片を脱パラフィン化して再水和させた後、媒染液中で56 °C、60分間インキュベートし、流水で10分間洗浄した。次に、Weigert鉄ヘマトキシリンで10分間、Biebrichスカーレット-酸フクシンで15分間、リンタングステンの酸で10分間、そしてアニリンブルーで10分間、順次処理した。最後に、切片を1% 酢酸に5分間浸し、脱水、キシレンで透徹させた後、封入した。
明確な核染色の確認、細胞質コントラストの保持、腎臓の組織構造の維持、および結合組織構造の明瞭な可視化により、染色の成功が確認されました。すべての染色スライドは、デジタルイメージングシステムを備えた光学顕微鏡を用い、標準化された条件下で評価されました。
組織病理学的評価は、実験群を知らされていない、経験豊富な1名の病理医によって行われました。組織病理学的スコアリングは200倍で実施されました。× 拡大倍率。動物1頭および組織病理学的パラメータ1項目につき、ランダムに選択した10個の顕微鏡視野を観察した。評価対象のパラメータにおいて最も重篤な変化を示した視野に基づき、0～4段階の整数スケールでその動物の単一スコアを割り当てた。尿細管傷害は、尿細管拡張、尿細管腔内への蛋白性物質の蓄積、尿細管上皮変性、および尿細管壊死に従って評価した。糸球体傷害は、糸球体変性または萎縮、ボウマン嚢腔の拡大、および血管充血に従って評価した。間質傷害は、間質性炎症および線維化に基づいて評価した。組織病理学的評価には、各動物から得られた5μm厚のヘマトキシリン・エオジン染色およびマッソン・トリクローム染色を施した腎臓切片を用いた。代表的な顕微鏡写真は200倍で撮影した。× 倍率、および〜を示すスケールバー 100 µm動物1匹あたりに検査した個別の組織切片数は、研究記録から回収できなかったため、報告することができません。
Masson三色染色の所見は、青色の染色の強さのみではなく、コラーゲン沈着の局在と形態学的パターンを考慮して組織形態学的に解釈した。半定量的な間質性線維化スコアはこの組織形態学的評価に基づいており、コラーゲン陽性領域の割合は定量化しなかった。組織病理学的スコアリングは、既報の腎傷害評価基準16,17を用いて半定量的に行った。各動物に対し、各組織病理学的パラメータについて0〜4の整数スコアを割り当てた（0 = なし、1 = 極少、2 = 軽度、3 = 中等度、4 = 重度）。このグレーディングカテゴリーは、連続的な形態計測値ではなく、盲検化された病理学者が各病変の形態学的重症度を総合的に判断したものである。
安全上の注意事項および廃棄物管理
メタノール、ホルムアルデヒド、キシレン、生物学的試料、および動物組織を取り扱う際は、適切な個人用保護具を使用した。白衣、手袋、および眼の保護具を着用した。メタノールの全身毒性と揮発性を考慮し、すべての手順を慎重に実施した。ホルムアルデヒドおよびキシレンを使用する手順は、可能な限り化学用ドラフトチャンバー内で実施した。鋭利物は適切な廃棄容器に回収した。化学廃棄物および生物学的材料は、機関のバイオセーフティおよび有害廃棄物管理手順に従って廃棄した。
統計解析
連続的な生化学的変数、腎損傷バイオマーカー、炎症性変数、腎機能およびレドックス関連変数は、平均値 ± 標準偏差（mean ± SD）で表記した。データ分布の正規性はShapiro–Wilk検定を用いて評価し、分散の均一性はLevene検定を用いて評価した。生化学的アウトカムの群間比較には、一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。前提条件の確認により、血清クレアチニンの1群における正規性からの逸脱、および複数の生化学的アウトカムにおける分散の不均一性が認められた。元のANOVAの手法を維持したが、これらの逸脱が算出されたp-値の信頼性に影響を与えた可能性があるため、結果の解釈は慎重に行った。
ANOVAによって統計的に有意な差が検出された場合、Duncanのポストホック多重比較検定を用いて群間のペア比較を行った。各行内で同じ上付き文字を共有する値は、Duncanのポストホック検定において有意差がなかった。生化学的アウトカム全体にわたって、追加の多重性の調整は適用しなかった。Duncanの手法はファミリーワイズ型I誤り率を強力に制御するものではなく、複数のアウトカムを検定することで偽陽性の結果が出るリスクがさらに高まった。したがって、個々の有意な比較については慎重に解釈した。
生化学的アウトカムの全体的な効果量は、エータ二乗（η2）、以下のように算出される（F × df_between)/(F × df_between + df_error) であり、df_between = 4、df_error = 25 である。両側95%信頼区間は、非中心F分布を反転させ、非中心性の限界値を変換することで算出した（λ)を用いて λ/(λ + N)、ここでN = 30である。これらの補足計算は、科学計算環境を用いて行われた。推定値は、主要な統計解析から得られた四捨五入後のF統計量から導出されたため、近似値である。信頼区間はANOVAモデルの正規性と等分散性の仮定に基づいており、多重アウトカムに対する補正は行われていない。
組織病理学的スコアは順序尺度による半定量的な観察結果であり、群レベルでの平均的な病変負荷および個体間のばらつきを示すために、平均値 ± SDとして記述的にまとめられた。組織病理学的スコアに対して、推論統計学的な仮説検定や事後的なペア比較は行わなかった。したがって、ANOVA、Duncanの事後検定、およびp値の報告は、生化学的指標、腎傷害バイオマーカー、炎症、腎機能、およびレドックス関連の結果にのみ適用した。p値 < 0.05 を統計的に有意であるとみなした。
結果
すべての30匹の動物を解析に含めた。5つの実験群それぞれに6匹の動物が割り当てられた。5つの群に属するすべての動物は、研究開始後10日目に安楽死させられ、サンプルを採取した。メタノール曝露群の3群において、この時点はメタノール投与後48時間に相当した。したがって、全実験群において、研究の総期間およびサンプル採取時期は一致していた。腎臓損傷および炎症関連バイオマーカー、腎機能および酸化還元関連パラメータ、並びに組織病理学的所見は、以下に述べる通りに評価した。
生化学的所見：腎臓障害および炎症性バイオマーカー
腎臓組織のホモジネートで測定した腎障害および炎症性バイオマーカーの所見は、以下に示す。 表1一元配置分散分析（one-way ANOVA）の結果、5群間のシステアチンCに有意な全体差が認められた［F(4,25) = 5.329, p = 0.003]、IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013]、KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017]、TNF-α F(4,25) = 7.660、 p < 0.001］、およびIL-1β F(4,25) = 11.584, p < 0.001]。事後的な群間比較はDuncan法を用いて実施した。’多重範囲検定であり、群の割り当ては上付き文字のアルファベットで示した。 表1腎臓組織のホモジネート中におけるシステアチンC、IL-6およびKIM-1のレベルは、MTX＋メタノール群で最も高かったが、これらの変数に関しては、対照群、MTX単独群、MTX＋メタノール＋フォメピゾール群およびMTX＋メタノール＋エタノール群の間で有意差は認められなかった。腎臓組織のホモジネート中におけるTNF-αのレベルは、α およびIL-1β MTX＋メタノール群で最も高値を示した。MTX単独群ではTNF-αのレベルがより高かったα およびIL-1β 対照群よりも腎臓組織ホモジネートにおいて高い値を示したのに対し、解毒剤処理群は中間的な値を示した（表1).
腎機能および酸化還元関連パラメータ
血清腎機能指標および血液由来の酸化還元関連パラメータは次のように示された。 表2一元配置分散分析（one-way ANOVA）の結果、5群間の血清尿素濃度に有意な全体差が認められた［F(4,25) = 3.694, p = 0.017]、血清クレアチニン [F(4,25) = 12.988, p < 0.001]、血清SOD活性 [F(4,25) = 11.621, p < 0.001]、血液中のGSHレベル[F(4,25) = 10.164, p < 0.001]、血液CAT活性 [F(4,25) = 10.631, p < 0.001］、および血清MDA濃度［F（4,25）＝8.814、 p < 0.001]。事後グループ間比較はDuncan法を用いて実施した。’多重範囲検定であり、群の割り当ては上付き文字のアルファベットで示した。 表2.
血清尿素、血清クレアチニン、および血清MDA濃度は、MTX＋メタノール群で最も高値を示した。血清尿素および血清MDA濃度は、対照群、MTX単独群、MTX＋メタノール＋フォメピゾール群、およびMTX＋メタノール＋エタノール群の間で有意差を認めなかったが、血清クレアチニンは対照群で最も低値であった（表2).
MTX＋メタノール群は、血清SOD活性、血液GSH量、および血液CAT活性が最も低値を示した。MTX＋メタノール群と比較して、フォメピゾール投与群では血清SOD活性および血液CAT活性が有意に高かったのに対し、エタノール投与群における対応する上昇は統計学的に有意ではなかった。血液GSH量は、MTX単独群、MTX＋メタノール群および2種の解毒剤投与群間で有意な差は認められなかった。表2).
対照群と比較して、MTX単独投与群では腎臓組織ホモジネート中のTNFレベルが高かったα およびIL-1β 血清SOD活性、血液GSH量、および血液CAT活性が低下したが、腎臓組織ホモジネート中のシステアチンC、IL-6、KIM-1のレベルや、血清尿素、血清クレアチニン、血清MDA濃度に有意差は認められなかった。
組織病理学的所見および腎臓損傷スコア
腎臓組織の組織病理学的評価の結果は以下の通りである。 表3群間で、尿細管拡張、蛋白性物質の蓄積、尿細管上皮変性、尿細管壊死、糸球体変性、ボーマン嚢の拡大において形態学的変動が観察された。’空間、血管うっ血、間質性炎症、および間質線維化。
対照群では、腎組織は正常な組織学的構造を保持しており、糸球体または尿細管構造に明らかな病理学的変化は認められなかった。メトトレキサート群では、軽度の尿細管変性、血管うっ血、および間質性炎症が観察された。
MTX＋メタノール群は、評価された尿細管、糸球体、血管および間質の各パラメータにおいて、観察された損傷スコアが最も高かった。いずれの解毒剤投与群も、MTX＋メタノール群と比較して、記述的に低い観察スコアを示した。記述的な比較では、フォメピゾール投与群は、特に尿細管拡張、尿細管壊死、糸球体変性およびボーマン嚢の拡大を含む多くのパラメータにおいて、エタノール投与群と比較して低い観察スコアを示した。’虚血空間、血管うっ血、および間質線維化（表3）。これらの比較は記述的であり、組織病理学的スコアに対して統計的推論検定は実施しなかった。ヘマトキシリン・エオシンおよびマッソン’トリクローム染色の結果を示しています。 図2.
全体として、MTX＋メタノール群は最も高い腎臓障害および炎症性バイオマーカー値、最も好ましくない腎機能およびレドックスプロファイル、および最も高い組織病理学的損傷スコアを示した。アンチドート処置を行った両群は、MTX＋メタノール群と比較して、より好ましい腎臓予後パターンを示した。特にフオメピゾール処置群は、評価されたすべての領域で一貫してより好ましいパターンを示した。また、MTX単独群も、対照群と比較して、選択された炎症関連およびレドックス関連パラメータに変化を示した。
データ利用可能性：
生化学的、腎臓損傷バイオマーカー、炎症、腎機能および酸化還元関連の解析を裏付ける個体レベルの生データは、以下のとおりである。 補足ファイル1.
図1実験デザインおよび処置のタイムライン。 メタノール中毒の実験的ラットモデルの模式図。成体の雄性ウィスター系統アルビノラットを、対照群、メトトレキサート（MTX）単独群、MTX＋メタノール群、MTX＋メタノール＋フォメピゾール群、およびMTX＋メタノール＋エタノール群の5群に割り付けた（n＝6／群）。10日間の実験期間中、標準ペレット飼料および水道水を自由摂取可能とし、メタノール投与前後において断食やその他の食餌・水分制限は行わなかった。対照群には実験的処置を施さなかった。第2群の動物には–5例は、連続7日間（試験初日から7日目まで）1日1回経口強制給餌により0.3 mg/kgのMTXを投与された（研究日1–7）グループ3の動物–5群は、研究開始8日目に経口カニューレを用いて3 g/kgのメタノールを1回投与された。MTX＋メタノール＋フォメピゾール群では、メタノール投与後4時間に腹腔内投与によりフォメピゾールを15 mg/kgの初期投与量で投与し、その後12、24、および36時間に10 mg/kgの維持投与を行った。MTX＋メタノール＋エタノール群では、メタノール投与後4時間に経口カニューレを用いてエタノールを0.5 g/kgの1回投与を行った。すべての動物は研究開始10日目に安楽死させた。3群については–5は、メタノール投与後48時間に相当した。腎機能、腎臓損傷バイオマーカー、炎症性サイトカイン、酸化還元関連バイオマーカーおよび腎臓の組織病理学的解析のために、血液および腎臓試料を採取した。略語：MTX ＝ メトトレキサート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2：実験群の腎組織における代表的な組織病理学的所見。 対照群、MTX群、MTX＋メタノール群、MTX＋メタノール＋フォメピゾール群、およびMTX＋メタノール＋エタノール群の代表的な腎臓切片を示している。上段はヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色である。&E）染色であり、下段はマッソン’トリクローム染色。対照群では、正常な糸球体および尿細管形態を伴う腎臓組織構造が保たれていた。対照群の糸球体および尿細管基底膜、血管壁、および間質性結合組織に認められた青色に染まったコラーゲンは、病的線維化の所見ではなく、生理的なコラーゲンであると考えられた。MTX群では軽度の尿細管変性、血管うっ血および炎症性変化が認められた。MTX＋メタノール群では、より顕著な腎障害が観察され、尿細管変性（*）、血管うっ血（+）、ボーマン腔の拡張が特徴であった。’s空間（x）、尿細管壊死（↑）、間質性炎症（↕）、および組織形態学的線維化変化に一致する糸球体周囲のコラーゲン蓄積（‡）、マッソンで観察されたように’sトリクローム染色切片。フォメピゾール投与群は、MTX＋メタノール群と比較して、組織病理学的損傷スコアが低く、比較的保存された尿細管および糸球体構造、および壊死、炎症、血管うっ血、コラーゲン関連変化の範囲が小さかった。エタノール投与群もMTX＋メタノール群と比較して組織病理学的損傷スコアが低かったが、尿細管、糸球体および血管の残存する病変がフォメピゾール投与群に比べてより明確に認められた。顕微鏡写真は200倍で撮影した。× 倍率、スケールバーは100を表す µm. マッソン’マッソン・トリクローム染色は支持的な組織形態学的証拠として評価されたが、各パネル間の青色染色の強度の差異は、線維化の群間比較のための定量的指標としては用いられなかった。記号：* 小管変性；+ 血管うっ血；x ボーマン腔の拡大’s 空間； ↑ 尿細管壊死； ↕ 間質性炎症； ‡ 糸球体周囲のコラーゲン蓄積は、組織形態学的な線維化変化と一致している。MTX、メトトレキサート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 変数 | 対照群（n = 6） | MTX（n = 6） | MTX＋メタノール（n = 6） | MTX＋メタノール＋フォメピゾール（n = 6） | MTX＋メタノール＋エタノール（n = 6） | p | η² （95%信頼区間） |
| シスタチン C（ng/mL） | 26.07 ± 12.05a | 32.01 ± 1.86a | 45.23 ± 10.51b | 32.49 ± 1.60a | 31.27 ± 4.60a | 0.003 | 0.460 (0.084 – 0.597) |
| IL-6（ng/L） | 7.66 ± 1.38a | 8.72 ± 2.45a | 11.02 ± 0.83b | 7.96 ± 1.54a | 8.12 ± 1.77a | 0.013 | 0.385 (0.023 – 0.535) |
| KIM-1（ng/mL） | 2.21 ± 1.00a | 2.47 ± 0.24a | 3.45 ± 0.81b | 2.28 ± 0.58a | 2.32 ± 0.37a | 0.017 | 0.370 (0.013 – 0.522) |
| TNF-α （ng/L） | 118.66 ± 22.95a | 190.51 ± 5.84b | 238.29 ± 34.68c | 147.10 ± 24.31ab | 168.41 ± 75.41ab | <0.001 | 0.551 (0.181 – 0.668) |
| IL-1β （ng/mL） | 8.43 ± 0.59a | 12.53 ± 1.05c | 15.26 ± 1.46d | 10.05 ± 2.86ab | 11.17 ± 2.37bc | <0.001 | 0.650 (0.316 – 0.743) |
表1：実験群における腎臓損傷および炎症性バイオマーカー データは平均値として示している ± 標準偏差（SD）を用いて示し、各群6匹の動物で実施した。すべてのバイオマーカーは腎臓組織ホモジネート中で測定した。システアチンC、KIM-1、およびIL-1β 濃度は ng/mL で表される。IL-6 および TNF-α 濃度はng/Lで表されます。報告済み p 値は5群全体に対する一元配置分散分析（ANOVA）のオムニバス検定によるものである。オムニバス検定で有意差が認められた場合、事後比較としてダンカン法を用いた。’多重範囲検定。各行内で少なくとも1つの上付き文字が共通する群間では有意差は認められず、上付き文字が全く共通しない群間では0.05の有意水準で有意差が認められる。バイオマーカー間で多重性の追加補正は施されていない。いくつかのバイオマーカー間で分散の不均一性が認められたため、ANOVAおよびダンカン検定の結果は注意して解釈する必要がある。略語：MTX ＝ メトトレキサート；KIM-1 ＝ 腎臓損傷分子-1；IL-6 ＝ インターロイキン-6；TNF-α = チュモル壊死因子-α；IL-1β = インターロイキン-1β；SD = 標準偏差；ANOVA = 分散分析；CI = 信頼区間。 η2 5つの群全体の効果量を示している。両側95％信頼区間はモデルに基づいて算出されており、誤差が等分散の正規分布に従うことを仮定しているため、複数のアウトカムに対する補正は施されていない。したがって、これらの仮定が満たされていない場合には、信頼区間の解釈に注意を要する。
| 変数 | コントロール | MTX | MTX ＋ メタノール | MTX + メタノール + フォメピゾール | MTX + メタノール + エタノール | p | η² （95%信頼区間） |
| 血清尿素（mg/dL） | 39.64 ± 13.69a | 46.88 ± 9.49a | 98.75 ± 59.24b | 48.03 ± 19.64a | 60.44 ± 18.53a | 0.017 | 0.371 (0.014–0.523) |
| 血清クレアチニン（mg/dL） | 0.50 ± 0.10a | 0.54 ± 0.05ab | 0.72 ± 0.03c | 0.54 ± 0.03ab | 0.60 ± 0.05b | <0.001 | 0.675 (0.356–0.762) |
| 血清SOD活性（U/mL） | 470.40 ± 40.49d | 371.16 ± 17.64c | 219.29 ± 85.06a | 319.38 ± 107.20bc | 256.22 ± 67.89ab | <0.001 | 0.650 (0.317–0.743) |
| 血液中GSH（mmol/L） | 58.74 ± 31.90b | 26.36 ± 5.92a | 11.10 ± 3.73a | 19.56 ± 1.66a | 13.66 ± 5.32a | <0.001 | 0.619 (0.272–0.720) |
| 血液中のCAT活性（U/mL） | 220.82 ± 74.08c | 160.88 ± 55.18b | 68.90 ± 13.41a | 129.45 ± 7.49b | 110.14 ± 20.18ab | <0.001 | 0.630 (0.287–0.728) |
| 血清MDA（nmol/mL） | 13.17 ± 2.03a | 17.29 ± 6.36a | 31.83 ± 9.94b | 17.93 ± 2.04a | 19.34 ± 4.65a | <0.001 | 0.585 (0.225–0.694) |
表2：実験群における腎機能および酸化還元関連パラメーター。 データは平均値として示している ± 標準偏差（SD）を用いて示し、各群には6匹の動物が含まれた。血清尿素、血清クレアチニン、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）活性およびマロンジアルデヒド（MDA）濃度は血清中で測定したのに対し、還元型グルタチオン（GSH）量およびカタラーゼ（CAT）活性はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて抗凝固処理した血液中で測定した。血清尿素およびクレアチニン濃度はmg/dLで、SODおよびCAT活性はU/mLで、GSH量はmmol/Lで、MDA濃度はnmol/mLで表した。報告された値は、 p 値は5群全体に対する一元配置分散分析（ANOVA）のオムニバス検定によるものである。オムニバス検定で有意差が認められた場合、事後比較としてダンカン法を用いた。’多重範囲検定。各行内で少なくとも1つの上付き文字が共通する群間では有意差は認められず、上付き文字が共通しない群間では0.05の有意水準で有意差が認められる。バイオマーカー間で追加の多重性補正は施されていない。いくつかのアウトカムで分散の不均一性が認められたため、ANOVAおよびダネット検定の結果は慎重に解釈すべきである。酸化還元関連のバイオマーカーは間接的な指標であり、ミトコンドリア機能や損傷の分子メカニズムを直接測定したものではない。 η2 5つの群全体における効果量を示している。両側95％信頼区間はモデルに基づいて算出され、誤差が正規分布し等分散であることを仮定しており、複数のアウトカムに対する補正は施されていない。したがって、これらの仮定が満たされない場合には、信頼区間の解釈には注意を要する。略語：MTX ＝ メトトレキサート；SOD ＝ スーパーオキシドディスムターゼ；GSH ＝ 還元型グルタチオン；CAT ＝ カタラーゼ；MDA ＝ マロンジアルデヒド；EDTA ＝ エチレンジアミン四酢酸；SD ＝ 標準偏差；ANOVA ＝ 分散分析；CI ＝ 信頼区間。
| 変数 | コントロール | MTX | MTX ＋ メタノール | MTX ＋ メタノール ＋フオメピゾール | MTX＋メタノール＋エタノール |
| 管状拡張 | 0.16 ± 0.40 | 1.50 ± 0.54 | 3.50 ± 0.54 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 蛋白質性物質の蓄積 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.33 ± 0.51 |
| 細管上皮変性 | 0.16 ± 0.40 | 1.83 ± 0.40 | 3.83 ± 0.40 | 1.00 ± 0.00 | 2.00 ± 0.00 |
| 尿細管壊死 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.33 ± 0.51 | 0.83 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 |
| 糸球体変性 | 0.16 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 | 3.33 ± 0.51 | 1.00 ± 0.00 | 1.66 ± 0.51 |
| ボウマン's空間の拡大 | 0.00 ± 0.00 | 1.16 ± 0.40 | 3.00 ± 0.00 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 血管うっ血 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 間質性炎症 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.00 ± 0.63 | 0.83 ± 0.40 | 1.16 ± 0.40 |
| 間質線維症 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 2.83 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.16 ± 0.40 |
表3：実験群における記述的組織病理学的スコア データは平均値として記述的に示される ± 標準偏差（SD）、各群6匹の動物を使用。組織病理学的スコアは、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）で染色した腎臓切片から得た。&E）およびマッソン’s トリクローム；スコアは無次元である。各動物には、各組織病理学的パラメーターに対して0から始まる整数のスコアが1つ割り当てられた–4（0＝なし、1＝最小、2＝軽度、3＝中等度、4＝重度）。表に示す小数値は、各実験群の6匹の動物から得られた個々の整数スコアの算術平均値であり、個々の動物に割り当てられたスコアや連続的な評価体系を示しているわけではない。標準偏差は、各群内の個体間の変動性を表している。組織病理学的スコアに対して統計的推測検定や事後検定による対比較は行われていないため、群間の観察された傾向は、統計的に有意な差としてではなく、記述的なものとして解釈すべきである。組織病理学的評価項目には、尿細管拡張、蛋白性物質の蓄積、尿細管上皮の変性、尿細管壊死、糸球体の変性、ボーマン嚢の拡大が含まれる’空間、血管うっ血、間質性炎症、および間質線維化。
補足ファイル1：生化学的解析を裏付ける生データこのスプレッドシートには、論文で報告されている生化学的、腎臓損傷バイオマーカー、炎症関連および酸化還元関連の解析に使用された個体レベルの生データが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
本研究の主要な知見は、機能的、炎症性、酸化還元関連、および組織病理学的なアウトカムにおいて、MTX + Methanol群が最も不利な腎障害プロファイルを示したことである。この群では、血清尿素、血清クレアチニン、腎シスタチンC、KIM-1、TNF-α、IL-6、IL-1β、およびMDAの値が最も高く、SOD活性、GSHレベル、およびCAT活性が最も低く、同時に組織病理学的損傷スコアが最も高かった。いずれの解毒剤投与群も、MTX + Methanol群よりも良好な腎アウトカムパターンを示したが、fomepizole投与群では、評価した全領域においてより一貫して良好なパターンが見られた。しかし、これらの知見は、異なる解毒剤投与法（fomepizoleの反復腹腔内投与に対し、エタノールの単回経口投与）を用いた急性MTX前処理ラットモデルで得られたものである。投与経路と投与回数のこれらの違いは、腎保護有効性の直接的な比較を制限するものであり、観察されたアウトカムパターンは、エタノールに対するfomepizoleの優位性を立証するものではない。MTX単独群では、対照群よりもTNF-αおよびIL-1βレベルが高く、SOD活性、GSHレベル、およびCAT活性が低かったが、腎シスタチンC、IL-6、KIM-1、血清尿素、血清クレアチニン、およびMDAレベルは群間で統計的に同等であった。このパターンは、MTX前処理が背景となる炎症および酸化還元関連プロファイルに寄与したことを示している。したがって、MTX + Methanol群で観察されたさらなる変化は、MTX前処理された背景の下で起こったものであり、メタノールのみに起因するものとは言えない。メタノール単独群が含まれていなかったため、メタノールの独立した寄与および潜在的なMTX–メタノール相互作用を完全に分離して評価することはできなかった。
確立されたメタノール毒性学に基づくと、毒性代謝物の蓄積が腎損傷の妥当な要因であると考えられます。メタノールは主に肝臓においてADHによりホルムアルデヒドに代謝され、続いてギ酸へと代謝されます1,3,18,19,20。したがって、腎臓は広範な局所的なメタノール代謝よりも、血中のギ酸およびそれに起因する全身性の代謝異常によって主に影響を受けた可能性があります。しかし、メタノール、ホルムアルデヒド、およびギ酸の濃度ならびに腎臓におけるADH活性を測定していないため、腎組織におけるアルコールまたはアルデヒド代謝による寄与を排除することはできません。ギ酸はミトコンドリアのシトクロムcオキシダーゼを阻害し、それによって酸化的にリン酸化を損ない、ATP産生を減少させ、組織毒性低酸素症を誘発します。このプロセスは、乳酸アシドーシス、活性酸素種の生成増加、および膜損傷に至る可能性があります1,2,3,19,20。メタノール代謝の主座である肝臓と比較して、腎臓はギ酸の下流効果および全身性代謝異常に対して特に感受性が高い可能性があります。近位尿細管上皮細胞はエネルギー要求量が高く、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、および微小循環障害に対して特に脆弱です。その結果、ギ酸介在性の低酸素症、代謝性アシドーシス、および炎症が腎損傷に寄与している可能性があります2,8,9,21,22,23。急性腎不全と代謝性アシドーシス、呼吸不全、横紋筋融解症、敗血症、および多臓器不全との関連を示す臨床研究は、腎損傷が全身的な毒性負荷を反映している可能性を示唆しています8,9,10,21。ラットにおけるギ酸の葉酸依存性酸化がヒトよりも迅速であることは、実験モデルにおける重要な制限となりました1,11,12。したがって、メトトレキサートによる前処理は、ヒトのメタノール中毒の完全な臨床的および代謝的な特徴を再現するためではなく、ギ酸のクリアランスを低下させ、メタノール毒性への感受性を高めるために用いられました。
腎機能障害は、従来の生化学的パラメータと腎傷害バイオマーカーの複合的な評価によって実証されました。MTX + Methanol群における血清尿素およびクレアチニン濃度の低下は、腎濾過能および排泄能の低下を裏付けるものでした。腎臓におけるcystatin CおよびKIM-1レベルの上昇は、機能障害に伴い尿細管傷害が生じていることを示唆していました。KIM-1は近位尿細管傷害に関連していることから、この上昇は尿細管上皮の変性、拡張、および壊死と一致していました24,25。また、cystatin Cレベルの上昇も、腎機能障害の存在を支持するものでした26,27。fomepizole投与群およびエタノール投与群では、これらのバイオマーカーのレベルが低かったことから、腎傷害が軽減されたことが示唆され、特にfomepizole投与群でより一貫したパターンが観察されました。レドックス関連バイオマーカーのパターンは、確定的なメカニズムの証拠というよりは、酸化ストレスが腎傷害の寄与因子である可能性と一致していました。MDAは一般に脂質過酸化の指標として用いられ、GSHは細胞内のレドックス恒常性の維持に寄与します28,29。メタノール中毒およびメタノール関連視神経症の実験モデルにおいて、酸化ストレス、脂質過酸化、および抗酸化能の低下も組織傷害に関連していることが報告されています10,15,20。MTX + Methanol群における血清SOD活性の低下、血清MDA濃度の増加、および血液中のGSHレベルとCAT活性の低下は、抗酸化能の低下および脂質過酸化の増加と一致していましたが、これらの測定値によって根本的なミトコンドリアまたは分子メカニズムが確立されたわけではありません。解毒剤投与群における血清MDA濃度の低下、および血清SOD活性と血液CAT活性の部分的な回復は、より良好なレドックス関連バイオマーカープロファイルと適合しており、fomepizole投与群においてより一貫して良好なパターンが観察されました。
MTX + メタノール群におけるTNF-α、IL-6、およびIL-1βの高値は、炎症性の腎プロファイルと一致していました。これらのサイトカインは経路特異的ではなく、MTX自体が選択的な炎症マーカーの変化に関連していたため、これらの知見は、炎症が腎障害の確定したメカニズムではなく、寄与因子である可能性を支持するものでした。ギ酸によるミトコンドリア機能不全、細胞低酸素症、および酸化ストレスが炎症経路活性化の基盤となる可能性があり、したがって、メタノール毒性において酸化ストレスと炎症は相互に増強し合うプロセスとして進行すると考えられます1,2,3,15。メタノール中毒の実験モデルでは、メタノール曝露と炎症細胞浸潤、組織病理学的損傷、およびIL-1βやTNF-αなどの炎症性マーカーレベルの上昇との関連が報告されています13,15。これらの知見は、MTX + メタノール群で観察された炎症性サイトカインレベルの上昇、および間質性炎症、尿細管変性、尿細管壊死のスコア上昇と一致していました。総括すると、これらの結果は、毒性代謝物の影響、酸化ストレス、炎症、微小循環障害、および全身的な毒性負荷が関与する多因子的プロセスと矛盾しないものでしたが、これらの経路が直接的に評価されたわけではありません。解毒剤投与群でTNF-α、IL-6、およびIL-1βレベルが低かったことは、毒性代謝物の生成抑制が炎症反応を限定させた可能性を示唆しています。組織病理学的所見は、腎障害の組織レベルでの相関を示しており、MTX + メタノール群は尿細管、糸球体、血管、および間質のパラメータにおいて、観察された中で最も高い障害スコアを示しました。どちらの解毒剤投与群も、記述的に組織病理学的障害スコアが低く、また、ほとんどのパラメータにおいてフォメピゾール投与群はエタノール投与群よりも記述的に低いスコアを示しました。しかし、組織病理学的スコアに対して推測統計学的検定が行われなかったため、これらの観察結果は、いずれの解毒剤についても統計的に有意な組織病理学的保護作用や優越性を立証したものではありません16,17。
メタノール中毒におけるエタノールおよびフォメピゾールの解毒効果は、アルコール脱水素酵素による代謝を抑制し、それによってホルムアルデヒドおよびギ酸の生成を減少させることに基づいています。エタノールは競争的基質として作用し、一方フォメピゾールはアルコール脱水素酵素の直接的かつ強力な阻害剤として機能します1,3,4,6,7,30,31,32。両解毒剤投与群で観察された、より良好な腎予後のパターンは、アルコール脱水素酵素阻害による期待される効果と一致していました。それにもかかわらず、現在の文献では、エタノールに対するフォメピゾールの決定的な臨床的優位性は示されていません。投与の簡便さ、予測可能な薬物動態、および副作用プロファイルの低さからフォメピゾールが好まれることが多いものの、エタノールは依然として有効な代替手段です1,3,4,6,7,30,32。Zakharovらによって報告されたメタノール大量中毒のデータでは、死亡率、集中治療期間、または透析の必要性において、2つの解毒剤間に明確な差は認められませんでした。したがって、臨床的優位性に関する解釈には注意が必要です5。Duncanのポストホックテストを用いた生化学的アウトカムにおいて、フォメピゾール投与群とエタノール投与群の間に統計的に有意な直接的差は認められませんでした。さらに、フォメピゾールは反復投与されたのに対し、エタノールは単回投与されました。投与経路、投与頻度、または全身暴露量についてレジメンは統一されていませんでした。その結果、フォメピゾールに関連して記述的に見られたより良好なパターンは、解毒剤間の相違に加えて、投与スケジュール、投与経路、または薬物暴露量の違いを反映していた可能性があり、より高い生化学的有効性、臨床的優位性、または臨床的な治療上の優先順位を確立するものではありませんでした5,6,30,32。本研究の大きな強みは、相補的な機能的、尿細管的、炎症的、酸化還元関連、および構造的ドメインにわたって、血清尿素およびクレアチニン、シスタチンC、KIM-1、前炎症性サイトカイン、酸化還元関連バイオマーカー、および組織病理学的スコアを統合的に評価したことです。この腎障害に焦点を当てたモデルは、葉酸依存性のギ酸クリアランスが低下した条件下での解毒レジメン、補助的な腎保護介入、および腎障害バイオマーカーを評価するための有用な前臨床的枠組みを提供する可能性があります8,9,10,21。
いくつかの制限が結果の解釈に影響を及ぼした。実験動物モデルおよび種間での代謝の差により、臨床的なメタノール中毒への直接的な一般化は制限された。メトトレキサートは、腎機能、炎症および酸化ストレスの結果に独立して影響を及ぼす可能性があり33、メタノール単独群がなかったため、メタノールの影響をMTXとメタノールの相互作用の可能性から完全に分離することはできなかった。血清または組織中のメタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、エタノールおよびフォメピゾールの濃度は測定されず、粗腎細胞質画分におけるADH活性も評価されなかった。そのため、代謝的な感作、毒性代謝物の生成、解毒剤への曝露、およびメタノール代謝の阻害を直接的に検証することはできず、腎生化学的結果との相関分析も実施できなかった。pH、重炭酸塩、ベースエクセスおよびアニオンギャップを含む酸塩基平衡変数は測定されなかった。48時間の追跡期間では、急性腎不全の結果のみを評価することが可能であり、腎機能の回復、損傷の持続性または可逆性、あるいは慢性的構造変化を確定させることはできなかった。Massonのトリクローム染色は組織形態学的に評価され、コラーゲン陽性領域の定量的な測定は行われず、α-smooth muscle actin発現、コラーゲン含有量、4-hydroxyproline濃度などの分子または生化学的な線維化マーカーも評価されなかった。単一の盲検化された病理医による組織病理学的評価であったため、観察者間一致度の評価はできず、半定量的な病変グレード付けは観察者に依存した分類となる可能性が残った。解毒処置のレジメンは薬理学的に等価ではなく、腎組織のELISA濃度は総タンパク質濃度で標準化されていなかった。また、ミトコンドリア機能および細胞死経路の分子解析は実施されず、サンプルサイズが限定的であり、雄ラットのみが含まれていた。今後の研究では、メタノール単独群およびMTX単独群、比較可能な解毒レジメン、メタノール、ギ酸および解毒剤濃度の連続測定、腎ADH活性、酸塩基測定、定量的な線維化評価、より長期の追跡期間、および適切に設計された臨床的検証を組み込むべきである。結論として、このメトトレキサート前処理ラットモデルにおけるメタノール曝露は、腎機能の低下、腎損傷および炎症バイオマーカーの増加、不利なレドックス関連プロファイル、および組織病理学的損傷に関連していた。解毒剤投与群はともに、MTX + Methanol群よりも良好な腎機能結果のパターンを示した。フォメピゾールは、評価された各領域においてより一貫して良好な記述的パターンを示したが、解毒剤群間に有意な直接的生化学的差がなかったこと、組織病理学的比較が記述的性質であったこと、解毒レジメンが不均等であったこと、および毒性動態学的測定が行われなかったことから、エタノールに対する優越性に関する結論を導き出すことはできなかった。これらの知見はメトトレキサート前処理ラットモデルに限定されており、メトトレキサート前処理なしのメタノール曝露後や、ヒトのメタノール中毒における各解毒剤の腎効果を確定させるものではない。これらの知見の再現性とより広範な適用性を評価するには、直接的な毒性動態測定、機序評価、比較可能な解毒剤投与レジメン、およびより長期の追跡を含むさらなる研究が必要である。
開示事項
著者は競合する利益がないことを宣言します。本原稿の作成において、AI支援ツールは言語編集および文法修正のみに使用されました。データの生成、分析、解釈、ならびに図、表、グラフィカル要素の作成に人工知能ツールは使用されていません。著者は本原稿の内容について全責任を負います。
謝辞
本研究は、Kırşehir Ahi Evran Universityの科学研究プロジェクト調整ユニット（プロジェクト番号：TIP.A3.26.011）の支援を受けて実施されました。助成機関は、研究デザイン、データ収集、データ分析、データ解釈、または原稿の執筆において一切の役割を果たしていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10% 中性緩衝ホルマリン | Merck | 記録なし | 組織病理学的処理のための組織固定。 |
| 絶対エタノール (≥99.8%) | Sigma-Aldrich, USA | 記録なし | 滅菌蒸留水で希釈して最終濃度 20% (v/v) の溶液を調製し、メタノール投与の 4 h 後に 0.5 g/kg を単回経口投与した。 |
| ベンチトップ遠心機 | Nüve | NF048 | 試料調製および遠心分離。 |
| ビオチン標識抗体 | BT Lab ELISA Kit Components | キットに同梱 | 検出抗体 |
| CAT (カタラーゼ) キット | Otto Scientific | Otto3051 | EDTA抗凝固血液中におけるカタラーゼ (CAT) 活性の比色測定。 |
| cOmplete Mini EDTA-free プロテアーゼ阻害剤カクテル | Roche / Sigma-Aldrich | 11836170001 | ELISA分析用の腎組織ホモジネート調製時に、ホモジナイズ緩衝液に添加した。 |
| クレアチニン キット | Otto Scientific | OttoBC139 | 血清クレアチニン値の評価。 |
| デジタルホモジナイザー | Daihan Scientific | HG-15D | 組織のホモジナイズ |
| ELx50 Auto Strip Washer | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | ELISAの洗浄 |
| ELx800 マイクロプレートリーダー | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | ELISAおよび比色法の吸光度測定。ELISAの吸光度は 450 nm で測定した。 |
| エオシン Y (Yellowish) | Merck | 1.15935.0025 | 組織病理学的染色 |
| フォメピゾール (4-メチルピラゾール) | Hüsnü Arsan  A. ., Ankara, Türkiye | 記録なし | 滅菌 0.9% 塩化ナトリウム溶液を用いて最終濃度 10 mg/mL に調製した。メタノール投与の 4 h 後に 15 mg/kg を負荷量として腹腔内投与し、その後、メタノール投与から 12、24、36 h 後に 10 mg/kg を維持量として投与した。 |
| GSH (グルタチオン) キット | Otto Scientific | Otto3053 | EDTA抗凝固血液中における還元型グルタチオン (GSH) 値の比色測定。 |
| ハリス・ヘマトキシリン溶液 | BSLAB | BS-002 | 組織病理学的染色 |
| 塩酸 (HCl) | Merck | 7647-01-0 | pH調整 |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | IBM SPSS Statistics Version 29.0 | 統計解析。RRID:SCR_016479。 |
| 塩酸ケタミン (ケタラー) | Pfizer, USA | 記録なし | 血液および腎組織採取前の全身麻酔。 |
| 光学顕微鏡 | Nikon Eclipse | Ni-U | 組織病理学的検査 |
| マッソン・トリクローム染色キット | MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye) | BKMTO001 | 組織病理学的染色 |
| MDA (マロンジアルデヒド) キット | Otto Scientific | Otto1001 | 脂質過酸化の指標として血清中のマロンジアルデヒド (MDA) 値を比色測定した。 |
| メタノール (≥99.8%) | Sigma-Aldrich, USA | 322415 | 実験的なメタノール中毒を誘発するため、経口投与 (3 g/kg) した。 |
| メトトレキサート (Emthexate 500 mg/5 mL) | Teva Pharma Belgium | 記録なし | 市販の 100 mg/mL 製剤を滅菌 0.9% 塩化ナトリウム溶液で希釈して最終使用濃度 0.06 mg/mL とし、5 mL/kg (0.3 mg/kg に相当) を 7 日連続で 1 日 1 回経口投与した。 |
| Mindray 化学分析装置 | Mindray | BS-400 | 血清尿素およびクレアチニンの測定。 |
| パラフィンワックス (組織学グレード) | 記録なし | 記録なし | 組織包埋。 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Merck | P4417 | 組織のリンス/洗浄 |
| ラット Cystatin-C ELISA キット | BT Lab, China | E0145Ra | 腎組織ホモジネート中のシスタチン C 値の定量。分析感度 0.25 ng/mL、検出範囲 0.5–100 ng/mL。 |
| ラット IL-1β ELISA キット | BT Lab, China | E0119Ra | 腎組織ホモジネート中の IL-1β 値の定量。分析感度 0.08 ng/mL、検出範囲 0.2–60 ng/mL。 |
| ラット IL-6 ELISA キット | BT Lab, China | E0135Ra | 腎組織ホモジネート中の IL-6 値の定量。分析感度 0.052 ng/L、検出範囲 0.1–40 ng/L。 |
| ラット KIM-1 ELISA キット | BT Lab, China | E0549Ra | 腎組織ホモジネート中の KIM-1 値の定量。分析感度 0.01 ng/mL、検出範囲 0.05–10 ng/mL。 |
| ラット TNF-α ELISA キット | BT Lab, China | E0764Ra | 腎組織ホモジネート中の TNF-α 値の定量。分析感度 2.51 ng/L、検出範囲 5–1,000 ng/L。 |
| RIPA 溶解および抽出緩衝液 | Thermo Scientific | 89900 | ELISA分析のための腎組織のホモジナイズおよび溶解。 |
| SOD (スーパーオキシドディスムターゼ) キット | Otto Scientific | Otto3047 | 血清中のスーパーオキシドディスムターゼ (SOD) 活性の比色測定。 |
| クエン酸ナトリウム | Merck | 03-04-6132 | 緩衝液の調製 |
| 水酸化ナトリウム (NaOH) | Merck | 1310-73-2 | pH調整 |
| ステンレス製経口投与針 (22 G 経口投与カニューレ) | Instech Laboratories, USA | 記録なし | ラットの経口投与に使用した再利用可能なステンレス製カニューレ。 |
| 停止液 | BT Lab ELISA Kit Components | キットに同梱 | ELISA反応の停止 |
| ストレプトアビジンペルオキシダーゼ | Thermo Scientific | SHRP248-B | ELISA検出システム |
| TMB 基質溶液 | BT Lab ELISA Kit Components | キットに同梱 | 発色基質 |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | 緩衝液の調製 |
| 尿素 キット | Otto Scientific | OttoBC157 | 血清尿素値の測定。 |
| 洗浄緩衝液濃縮液 | BT Lab ELISA Kit Components | キットに同梱 | プレートの洗浄 |
| ウィスター白化ラット | Experimental Animal Research Laboratory of Ahi Evran University,  , Türkiye | 繁殖/生産ライセンス No. 184 | オス、8–12 週齢、体重 220 ± 20 g |
| 塩酸キシラジン (ロンポン) | Bayer, Germany | 記録なし | 血液および腎組織採取前の全身麻酔。 |
| キシレン (組織学グレード) | 記録なし | 記録なし | 組織学的な組織処理および透徹。 |
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