方法論記事

磁性粒子プロセッサーを用いたヒト糞便試料の採取および自動デオキシリボ核酸抽出の標準化ワークフロー

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2026年9月11日

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1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

この記事について

サマリー

本プロトコルの目的は、ヒト糞便サンプルの採取および、磁性粒子プロセッサーを用いたデオキシリボ核酸（DNA）の自動抽出を標準化することです。

要約

腸内マイクロバイオームのシーケンシングは、健康状態および疾患状態における微生物コミュニティの動態を調査するための重要なアプローチとなっています。微生物組成の変化は、糖尿病、白血病、神経変性疾患を含む、生活習慣や加齢に関連するいくつかの疾患と関連しています。微生物によって生理学的特性や環境要求が異なるため、サンプルの完全性を維持し、技術的なばらつきを最小限に抑えるには、糞便サンプルの採取、輸送、および処理の標準化が不可欠です。分析前の取り扱いやデオキシリボ核酸（DNA）抽出の段階で生じる変動は、後続のマイクロバイオーム解析に影響を及ぼし、データの解釈を左右する可能性があります。本プロトコルの目的は、MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit（核酸抽出キット）およびKingFisher Flex System（自動磁性粒子プロセッサー）を用いた、ヒト糞便サンプルの採取および自動DNA抽出のための標準化されたワークフローを提供することです。このワークフローでは、制御されたサンプルハンドリングと自動核酸抽出を統合することで、手作業によるばらつきを軽減し、手順の一貫性を向上させています。本プロトコルには、標準化された糞便サンプルの採取、保存、調製、自動抽出、および複雑な糞便マトリックスからの核酸回収が含まれます。代表的な結果により、16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子シーケンシングやショットガンメタゲノムシーケンシングなどの後続アプリケーションに適したDNAの回収に成功したことが示されています。この標準化されたワークフローは、再現性のあるサンプル処理をサポートし、マイクロバイオーム研究のスケールアップを容易にし、実験間の一貫性を高めます。本ビデオデモンストレーションでは、腸内マイクロバイオーム研究に向けた標準的な糞便サンプル処理および自動核酸抽出を実装するための実践的なガイダンスを提供します。

概要

腸内マイクロバイオームは、宿主の代謝、免疫、神経機能に影響を与える複雑な微生物エコシステムであり、代謝性疾患、パーキンソン病、癌、神経変性疾患を含む多様な疾患への関与がますます明らかになっています1,2。それは代謝、免疫機能、栄養吸収、および病原性微生物への耐性に影響を与えることで、宿主の生理的状態の維持に重要な役割を果たしています3,4。これらの関連性をメカニズムの解明や臨床応用へとつなげるためには、堅牢で再現性のあるマイクロバイオーム測定が不可欠です。次世代シーケンシング（NGS）技術の進歩により、胃腸管に生息する複雑な微生物群集に対する理解は劇的に変化しました。しかし、糞便サンプルの採取手順、保存条件、取り扱い、輸送、およびデオキシリボ核酸（DNA）抽出方法などの分析前変数は、微生物群集の構造、DNA収量、およびシーケンシング結果を選択的に変化させる可能性があります5,6。このような手法の不一致は、多くの場合、研究間での比較を困難にします。

重要な前分析ステップの中で、DNA抽出はマイクロバイオームデータの品質を決定付ける最も影響力のある要因の一つです7,8。理想的な抽出プロトコルは、多数のサンプルにおいて、汚染を最小限に抑えつつ、高品質で高分子量のDNAを一貫して生成できるものであるべきです。核酸抽出の自動化プラットフォームは、再現性の向上、手作業によるエラーの低減、汚染リスクの軽減、およびスループットの向上を可能にします。これらの自動抽出プラットフォームの性能は、サンプルの均質化、ビーズビート条件、ライシス化学、インキュベーション条件、および磁性ビーズのハンドリングなど、プロトコルのパラメータに大きく依存します9,10。したがって、均一な糞便サンプルの収集と自動DNA抽出を統合した標準的なワークフローを確立することは、信頼性と再現性のあるマイクロバイオームデータセットを生成するために不可欠です。

本稿では、前述の核酸抽出キットおよび自動磁性粒子プロセッサーを用いた、ヒト糞便サンプルの採取、取り扱い、および自動DNA抽出の標準化されたワークフローを提示します。本プロトコルでは、制御されたサンプル取り扱い、効果的な機械的および化学的溶解、阻害剤の除去、ならびに16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子アンプリコンシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、定量ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、およびショットガンメタゲノムシーケンシングを含む下流アプリケーションに適した品質管理措置を重視しています。視覚的なデモンストレーションにより、再現性と拡張性のある腸内マイクロバイオーム研究を支援するための、標準化された糞便サンプル処理および自動核酸抽出に関する実践的なガイダンスを提供します。

プロトコル

本研究は、SKAN Research Trust Institutional Ethics Committeeのガイドラインに従って実施され、同委員会によって承認されました（承認番号：SKAN/IEC/2025/04）。試料採取に先立ち、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得ました。

注：すべての試薬、消耗品、および機器は材料表に記載されています。

1. 糞便検体採取キットの準備

  1. 滅菌済み便キャッチャー、スパチュラ付きの滅菌済みねじ蓋付き回収チューブ（容量 30–50 mL）、安定化緩衝液が予め充填された回収チューブ、使い捨て手袋、吸収材、バイオハザードラベル付きの密閉可能な輸送袋、および説明書を含む糞便サンプル採取キットを準備する（図 1）。
  2. 油性マジックまたは印刷済みラベルを使用し、各回収チューブに固有のサンプル識別子、採取日、および採取時間を記載する。
  3. サンプルの採取手順、取り扱い上の注意、保存条件、および輸送要件を記載した説明書を同梱する。
    ​注：安定化緩衝液は、糞便採取キットの一部として糞便採取チューブに予め充填された状態で提供される。メーカーは安定化緩衝液の組成および容量を公開していない。メーカーの指示に従い、約 2–5 g の糞便を充填済み回収チューブに直接採取する。

手袋、チューブ、バイオハザード袋、キャッチャー、および分析用パンフレットを含む糞便検体採取キット。
図 1. 糞便検体採取キットの構成部品。 
糞便検体採取キットには、使い捨て手袋、滅菌済み糞便キャッチャー、スパチュラ付きの滅菌済みスクリューキャップ付き糞便採取チューブ、バイオハザードラベル付きの密封可能な輸送バッグ、および参加者に提供される糞便検体の採取、取り扱い、保存、輸送に関する説明パンフレットが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. サンプル採取のための被験者の準備

  1. 検体採取前に、参加者に手を洗うよう指示してください。
  2. 糞便検体への尿混入を避けるため、排便前に排尿を済ませるよう参加者に指示してください。

3. フェーカルキャッチャーを用いて糞便検体を採取する

  1. 便サンプルとトイレの水が接触するのを防ぐため、滅菌済みの便回収器を便座に取り付けます。
  2. 粘着式便回収器を使用する場合は、破れないように指定された端に沿って慎重にデバイスを広げます。便回収器に付属の製造者指示に従い、安定した回収面を形成するようにデバイスを便座の後方にしっかりと固定してください。
  3. 非粘着式便回収器を使用する場合は、製造者の指示に従い、安定して支持されるようにデバイスを便器に配置します。
  4. サンプル回収中に便回収器がトイレの水に接触しないようにしてください。
  5. 参加者に、便回収器に直接排便するように指示します。
  6. サンプルを扱う前に、回収キットに付属の使い捨て手袋を着用してください。
  7. 滅菌済み回収チューブを開け、付属のスパチュラを用いて、外表面と内部コアを含む、便の少なくとも4～5つの異なる領域から便を回収します。この方法により、通常、DNA抽出に十分な約 2–5 g の便が回収されます。
  8. 便回収器の端や外部表面に接触した便は回収しないでください。
  9. サンプル回収後、すぐに回収チューブをしっかりと密閉します。
  10. 密閉した回収チューブを手で激しく振り、サンプルが均一に懸濁し、大きな塊がなくなるまで、安定化バッファーと便サンプルを十分に混合します。
  11. 密封した回収チューブを、吸収材が入った漏れ防止のバイオハザード標識付き輸送バッグに入れます。
  12. 内容物をこぼさないように注意しながら、便回収器を便とともに慎重にトイレへ流します。トイレを洗浄し、便回収器と便を合わせて廃棄してください。

4. 便サンプルの保存および輸送

  1. 使用した安定化緩衝液の仕様に従ってサンプルを保存します。
  2. 安定化緩衝液が室温での保存に対応している場合は、サンプルを室温で保存します。あるいは、短期保存（≤24–48 h）の場合は4°Cで、長期保存の場合は−20°Cから−80°Cで保存します。
  3. 製造元の推奨事項に従ってサンプルを保存します。本研究で使用した安定化緩衝液を用いて採取したサンプルは、室温で最大2年間安定です。
  4. 漏出と汚染を防ぐため、吸収材を含む漏出防止バイオハザードバッグに入れてサンプルを輸送します。
  5. 輸送中は、推奨される温度条件を維持してください。必要に応じて断熱容器と冷却材を使用します。
  6. 生物学的試料の輸送に関する施設内のバイオセーフティガイドラインおよび適用される地域の規制を遵守してください。

5. サンプルの受領と記録

  1. ラボに届いた各検体を検査し、ラベル表示が適切であるか、チューブに破損がないか、および漏出の形跡がないかを確認する。
  2. 必要に応じてラボ固有の識別子を割り当て、採取日時、保存条件、および輸送時間を記録する。
  3. 漏出がある検体、ラベル表示が不適切な検体、または完全性が損なわれている検体は除外する。

6. プレートの調製

注意：抽出ワークフローを開始する前に、すべてのプレートを準備してください。試薬および生物学的試料を扱うすべてのステップは、白衣、手袋、保護メガネなどの適切な個人用保護具を着用し、清潔な環境で実施してください。図 2 は、自動磁性粒子プロセッサ（図 2A）、プレートロード位置（図 2B）、ディープウェルプレートアダプター（図 2C）、プレート対応遠心分離機（図 2D）、ビーズビーティング装置（図 2E）、クッションサポート（図 2F）、プレートホルダー（図 2G）、96ウェルビーズプレート（図 2H)、ディープウェルプレート（図 2I）、および溶出プレート（図 2J）を示しています。

遠心分離機や組織ライザーを含む、試料調製および分析用の実験器具のセットアップ。
図 2. 自動糞便デオキシリボ核酸（DNA）抽出に使用した装置および消耗品。 
(A) 自動磁気ビーズプロセッサー。(B) 自動磁気ビーズプロセッサー内のプレートロード位置。(C) 遠心分離用ディープウェルプレートアダプター。(D) プレート対応遠心分離機。(E) ビーズミルホモジナイザー。(F) ビーズビーティング中に使用するクッション支持台。(G) ビーズビーティング用ディープウェルプレートホルダー（アダプター）。(H) 核酸抽出キットに付属の96ウェルビーズプレート。(I) 96ウェルディープウェルプレート。(J) 96ウェル溶出プレート。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

  1. チップコームプレートをパッケージから取り出し、装置にロードできるように準備しておく。
  2. 核酸抽出キットに付属の溶出バッファーを96ウェルプレートの各ウェルに200 µLずつ分注し、溶出プレート（図 2J）を準備する。コンタミネーションを防ぐため、プレートを透明粘着フィルムで密封する。自動磁性粒子プロセッサーにロードするまで、プレートを密封したままにする。プレートに「溶出プレート」とラベルを貼る。
  3. ディープウェルプレートの各ウェルに80%エタノールを1 mLずつ分注し、洗浄プレート4を準備する。蒸発とコンタミネーションを防ぐため、プレートを粘着フィルムで密封する。
  4. 別のディープウェルプレートの各ウェルに、調製したばかりの80%エタノールを1 mLずつ分注し、洗浄プレート3を準備する。プレートを粘着フィルムで密封する。
  5. ディープウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーを1 mLずつ分注し、洗浄プレート2を準備する。プレートを粘着フィルムで密封する。
  6. ディープウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーを1 mLずつ分注し、洗浄プレート1を準備する。プレートを粘着フィルムで密封する。

7. 自動磁気粒子プロセッサーのセットアップ

  1. 自動磁性粒子プロセッサーの電源を入れます。正しい96深孔磁気ヘッドおよび96孔深孔加熱ブロックが装着されていることを確認してください。
  2. サンプルの処理前に、清潔なチップコームと適合する空のウェルプレートを使用して、適切な装置チェックプロトコル（例：Check_96dw_tipプロトコル）を実行します。
  3. 必要な抽出プログラムが自動磁性粒子プロセッサーで使用可能であることを確認します。
    注意：不適切な磁気ヘッドや加熱ブロックを使用すると、核酸の回収率が低下し、装置を損傷させる可能性があります。

8. サンプルの溶解を行う

  1. 96ウェルプレート内における各サンプルの位置を記録するためのプレートマップを作成する。
  2. プレート対応遠心機（Figure 2D）およびアダプター（Figure 2C）を用い、96ウェルビーズプレート（Figure 2H）を2,750 × gで10 s間遠心分離し、各ウェルの底にビーズを回収する。
    注：このステップは、プレートシールを取り外す際のビーズの損失を防ぐためである。
  3. ビーズを乱さないように注意しながら、プレートシールを慎重に取り除く。
  4. ビーズプレートの各ウェルに、溶解バッファーを800 µLずつ添加する。
  5. ピペッティング時にビーズを吸引しないように注意する。
  6. 凍結した糞便サンプルを、完全に解凍されるまで室温で解凍する。サンプルを静かに混ぜて均質化し、直ちにDNA抽出に進む。DNAの品質と収量が低下するため、凍結融解サイクルの繰り返しは避ける。
    注：新鮮なサンプルの場合は、サンプルの均質化を確実にするため、安定化溶液を含む各糞便サンプルチューブを5–10 s間ボルテックス処理する。
  7. 均質化した各サンプル200 µLを、ビーズプレートの対応するウェルに転送する。
  8. サンプルの転送には、滅菌フィルター付きのワイドボア（カット）ピペットチップを装着したシングルチャンネルピペットを使用する。ビーズの損失およびそれに伴うDNA収量の低下を最小限に抑えるため、繰り返しピペッティングを行うことは避ける。
  9. 粘着フィルムでプレートをしっかりと密封し、すべてのウェルとプレートの端が完全に密封されていることを確認する。

9. 機械的溶解（ビーズビーティング）を行う

  1. 適切なプレートホルダー(図 2G)とクッション支持材(図 2F)を使用し、密閉したプレートをビーズビーター(図 2E)に固定します。
  2. サンプルプレートの反対側に同重量のプレートを配置し、装置のバランスを調整します。
  3. 装置を 30 Hz、2 min に設定し、運転を開始します。
  4. 中断することなく運転を継続させます。
  5. 運転完了後、シールを乱さないように注意してプレートを取り出します。
    注意：ビーズビーティング中のプレートの破損を防ぐため、クッション支持材を使用してください。

10. ライシス後の処理を行う

  1. バランスを調整した状態で、プレートを室温で2,750 × g、5分間遠心分離する。
  2. 各ウェルから上清400 µLを、サンプルプレートとして指定した新しいディープウェルプレートに慎重に移す。
  3. このステップでは、ビーズを移さないように注意する。
    注：サンプルプレートにはビーズが含まれておらず、事前の遠心分離は不要である。
  4. すぐに次へ進まない場合は、サンプルプレートを密封する。
    注：必要に応じて、密封したライセートプレートを4°Cで一晩保存する。あるいは、密封したサンプルプレートを−20°Cで最大3か月間保存する。後続の処理の前に、サンプルを室温で解凍する。

11. 結合ビーズ混合液の調製

  1. 使用直前に、サンプル1検体あたり500 µLの核酸結合バッファーと20 µLの磁気ビーズを合わせて、結合ビーズ混合液を調製します。均一な懸濁液にするまで十分に混合してください。
  2. サンプル数に基づいて、必要な結合ビーズ混合液の総量を算出します。
  3. 96ウェルプレートをフルに使用する場合、滅菌コニカルチューブに48.00 mLの核酸結合バッファーと1.92 mLの磁気ビーズを加えて結合ビーズ混合液を調製します。十分に混合し、最終容量を49.92 mL（1ウェルあたり520 µL）にします。
    注：ピペッティングの誤差を補うため、1〜2ウェル分多めに調製してください。
  4. 結合ビーズ懸濁液を、均一になるまで転倒混和により緩やかに混ぜます。
  5. 結合ビーズ混合液を清潔なリザーバーに移します。
  6. 分注直前に、ビーズの沈殿を防ぐため、懸濁液を3〜4回ピペッティングして磁気ビーズを再懸濁させます。
  7. マルチチャンネルピペットを使用して、準備したサンプルプレートの各ウェルに結合ビーズ混合液を520 µLずつ分注します。
  8. 溶液に粘性があるため、気泡の形成を避けながらゆっくりとピペッティングしてください。すべてのウェルでビーズ分布を均一に保つため、分注ステップごとにリザーバー内の結合ビーズ混合液を緩やかに再懸濁させてください。

12. MagMAX_Microbiome_Stool_Flex装置プログラムの修正（修正済み抽出プログラム）

  1. メーカーの指示に従い、BindItソフトウェア（プロトコル編集ソフトウェア）をダウンロードし、インストールしてください。
  2. 製造元のウェブサイトから装置用プログラムをダウンロードしてください。
  3. プロトコル編集ソフトウェアを起動し、初期化が完了するまで待機します。
  4. [開く]をクリックし、ダウンロードした装置プログラムを選択します。
  5. 以下に記載されている通り、プロトコルのパラメータを変更してください。 表1.
  6. 変更したプロトコルを保存し、ソフトウェアを終了してください。
  7. USBまたはRS-232Cシリアルケーブルを使用して、コンピュータを自動磁性粒子プロセッサーに接続します。
    注：コンピュータを接続する前に、自動磁性粒子プロセッサーの電源がオフになっていることを確認してください。
  8. 自動磁性粒子プロセッサーの電源を入れ、初期化が完了するまで待ちます。
  9. プロトコル編集ソフトウェアを起動し、自動磁性粒子プロセッサが認識されていることを確認します。
  10. 修正済みの抽出プログラムを自動磁気ビーズプロセッサーに転送してください。
  11. 修正済みの抽出プログラムが正常に転送されたことを確認し、自動磁気ビーズプロセッサーの電源を切ってください。
ステップ操作パラメータ
1結合混合、回収 5サイクル、37°C
2ビーズの回収磁気回収 5サイクル
3洗浄 120 s × 3サイクルの混合、37°C
4洗浄 220 s × 3サイクルの混合、37°C
5洗浄 320 s × 2サイクルの混合、37°C
6洗浄 4混合、1サイクル、37°C
7乾燥2 minの間、風乾
8溶出75°C、混合 6サイクル、予熱有効
9ビーズの回収磁気回収 3サイクル
10溶出液の転送精製した核酸を溶出プレートに転送

表1：磁性粒子プロセッサー用自動抽出プログラム
デオキシリボ核酸（DNA）抽出時に自動磁性粒子プロセッサーによって実行される自動抽出プログラムの概要。このプログラムには、核酸の結合、磁性ビーズの回収、連続洗浄ステップ、風乾、溶出、および精製DNAの溶出プレートへの転送が含まれる。各自動ステップの動作パラメータが記載されている。

13. 自動核酸抽出を実施する

  1. メイン電源を入れ、次に装置の電源ボタンを押して、自動磁性粒子プロセッサー（図 2A）を起動します。システムの初期化が完了するまで待ちます。
  2. 装置のコントロールパネルを使用して、修正済みの抽出プログラムを選択し、ランを開始します。
  3. 指示が表示されたら、チップコームプレートをポジション 7 にロードし、Start を押して進みます。プレートのロードポジションについては、表 2（図 2B）を参照してください。
  4. 溶出プレートからシーリングフィルムを取り除き、正しい向き（ウェル A1 が指定の位置に揃っていること）を確認してポジション 6 にロードします。Start を押して進みます。
  5. 80% ethanol を含む洗浄プレート 4 からシーリングフィルムを取り除き、正しい向きでプレートをポジション 5 にロードして Start を押します。
  6. 80% ethanol を含む洗浄プレート 3 からシーリングフィルムを取り除き、プレートをポジション 4 にロードして Start を押します。
  7. 洗浄プレート 2 からシーリングフィルムを取り除き、プレートをポジション 3 にロードして Start を押します。
  8. 洗浄プレート 1 からシーリングフィルムを取り除き、プレートをポジション 2 にロードして Start を押します。
  9. 指示が表示されたら、サンプルプレートを正しい向きでポジション 1 にロードします。
  10. 装置の蓋を閉じ、Start を押して自動抽出ランを開始します。
  11. プログラムが完了するまで（約 35–40 min）、中断せずに実行させます。
    注：表 1 に、装置で実行される自動抽出プログラムの概要を示します。
プレート位置プレートの種類試薬1ウェルあたりの容量
サンプルプレート196深孔プレートサンプル溶解物と結合ビーズの混合液920 µL
洗浄プレート1296深孔プレート洗浄バッファー1,000 µL
洗浄プレート2396深孔プレート洗浄バッファー1,000 µL
洗浄プレート3496深孔プレート80%エタノール1,000 µL
洗浄プレート 4596ディープウェルプレート80%エタノール1,000 µL
溶出プレート696ウェルプレート溶出バッファー200 µL
チップコームプレート7標準ディープウェルプレート96ウェルディープウェルチップコーム提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストをご提示ください。

表2：自動核酸抽出のためのプレート配置構成。
磁性粒子プロセッサーを用いた自動DNA抽出に使用されるプレートの配置位置、プレートの種類、試薬、および試薬量。サンプルプレートには、サンプル溶菌液と結合ビーズの混合液が含まれる。N/Aは、チップコームプレートに液体試薬が添加されなかったことを示す。

​14. 核酸の溶出および保存

  1. ラン完了後に装置を開き、溶出液がこぼれないよう注意して溶出プレートを取り出します。
    注：溶出プレートに磁気ビーズのキャリーオーバーが目視で確認される場合は、溶出液を標準的な96ウェルプレートに移し、磁気スタンドに5–10分間静置してください。その後、マルチチャンネルピペットを用いて、清澄化した上清を新しい96ウェルプレートまたは適切にラベル付けしたチューブに移します。
  2. 溶出されたDNAを、適切にラベル付けしたチューブまたは保存プレートに移します。
  3. 溶出されたDNAは、短期間使用する場合は4°Cで、6か月まで保存する場合は−20°Cで、長期保存する場合は−80°Cで保存してください。

15. 実行後のクリーンアップを行う

  1. 自動磁性粒子プロセッサーから、使用済みのプレートおよびチップコームをすべて取り除きます。
  2. すべての消耗品を、機関のバイオセーフティおよび化学廃棄物処理ガイドラインに従って廃棄してください。
  3. こぼれた液体がある場合は、適切な実験室用消毒剤を使用して清掃します。
  4. 自動磁性粒子プロセッサーの電源を切り、続いて主電源を切ります。

結果

記載された採取ワークフローを用いて、7人の参加者から糞便検体の採取に成功し、後続の処理に十分な質量と適切な整合性を備えた検体が得られた。検体は採取後、室温で保存された。大部分の検体は均一な質感と色調を示しており、これは適切な採取および保存条件と一致していた。一方で、少数の検体において整合性にわずかな変動が見られたが、これは参加者間の生物学的変動を反映している可能性がある。輸送中に目に見える汚染や漏出は観察されず、すべての検体は採取キットの検証済み安定性期間内（室温で最大2年）に処理された。これにより、採取ワークフローの堅牢性と信頼性が裏付けられた（図1）。

自動DNA抽出ワークフローは、自動磁性粒子プロセッサー（図 2A）、プレートロード構成（図 2B）、ディープウェルプレートアダプター（図 2C）、プレート対応遠心機（図 2D）、ビーズビーティング装置（図 2E）、クッションサポート（図 2F）、プレートホルダー（図 2G）、ビーズプレート（図 2H）、ディープウェルプレート（図 2I）、および溶出プレート（図 2J）を用い、表 1に要約された自動抽出プログラムおよび表 2に示すプレートロード構成に従って実施した。代表的な糞便サンプルのDNA濃度と純度を評価し、その結果を表 3にまとめた。DNA濃度は、製造元の指示に従い、Qubitフルオロメーター（蛍光DNA定量装置）を用いてQubit double-stranded DNA High Sensitivity assay（蛍光DNA定量アッセイ）により測定した。サンプルを作動液と混合し、室温で2 min間インキュベートした後、2つのアッセイ標準試料と共に測定した。A260/A280およびA260/A230の吸光度比は、NanoDrop分光光度計（微量分光光度計）を用いて決定した。DNA濃度は36から87 ng/µLの範囲であり、すべてのサンプルを200 µLの一定量で溶出したため、調製間での全DNA回収量を直接比較することが可能であった（表 3）。

サンプルDNA濃度
(ng/µL)		A260/A280A260/A230溶出量
(µL)		総DNA収量
(ng)
サンプルA621.831.7120012,400
サンプルB361.891.512007,200
サンプルC871.921.8520017,400
サンプルD502.031.8720010,000
サンプルE551.971.8120011,000
サンプルF851.991.8820017,000
サンプルG442.011.512008,800
抽出ブランク0——2000

表3：ヒト糞便サンプルからの自動抽出後における代表的なDNA回収量および純度
ヒト糞便サンプルからDNAを自動抽出した後に測定された、代表的なDNA濃度、純度（A260/A280およびA260/A230の吸光度比）、溶出液量、および総DNA収量。DNA濃度は蛍光光度法を用いて決定した。抽出ブランクを陰性対照として使用し、検出可能なDNAは得られなかった。

代表的な結果から、サンプル間でDNA回収量にばらつきがあることが示されました。サンプルA（62 ng/µL）、サンプルF（85 ng/µL）、およびサンプルC（87 ng/µL）で高いDNA濃度が得られた一方、サンプルD（50 ng/µL）およびサンプルE（55 ng/µL）では中程度の濃度が観察されました。サンプルBおよびサンプルGでは、最も低いDNA濃度（それぞれ36 ng/µLおよび44 ng/µL）となりました。A260/A280吸光度比は1.83から2.03の範囲であり、A260/A230吸光度比は1.51から1.88の範囲でした（表3）。このような変動は糞便検体では予想されることであり、検体処理に伴う技術的な変動に加え、サンプルの組成の違いや生物学的な個体差を反映していると考えられます。抽出ブランクでは検出可能なDNAは得られず、抽出手順中に検出可能なコンタミネーションがなかったことが示されました。細菌の16S rRNA遺伝子のほぼ全長にわたる代表的な増幅の結果、糞便DNAサンプルにおいて期待通り約1.5 kbのPCR増幅産物が生成されましたが、テンプレートなしコントロール（no-template control）では増幅は見られませんでした（図3）。

ゲル電気泳動、16S rRNA PCR結果、DNAラダー、レーン分離プロセスの解析。
図3細菌の16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物のアガロースゲル電気泳動。 
ヒト糞便サンプルからDNA抽出後、ユニバーサルプライマー27Fおよび1525Rを用いて増幅させた、ほぼ全長（約1.5 kb）の細菌16S rRNA遺伝子を示す代表的なアガロースゲル電気泳動像。レーンM：100塩基対（bp）DNAラダー、レーン1：テンプレートなしコントロール（ブランク）、レーン2～8：期待される約1.5 kbのPCR増幅産物を示す代表的な糞便DNAサンプル。 この図の拡大表示はこちらをクリックしてください。

本プロトコルの正常な実施は、PCRベースのアッセイ、16S rRNA遺伝子シーケンシング、ショットガンメタゲノムシーケンシング、およびライブラリ調製を含む、下流の分子生物学的アプリケーションに適した測定可能なDNAの回収によって実証されます。これらの代表的な結果は、本プロトコルがヒト糞便サンプルから一貫してDNAを回収できることを示すとともに、生物学的検体間で生じ得る変動の範囲を明らかにしています。

ディスカッション

ここで述べるプロトコルは、マイクロバイオーム研究のためのヒト糞便サンプルの採取および自動DNA抽出に関する標準化されたワークフローを提供する。重要なステップには、便の複数の部位からの代表的なサンプリング、安定化バッファーを用いた十分な均質化、推奨条件下での適切な保存および輸送、効率的な機械的溶解、および自動抽出時の慎重な取り扱いが含まれる。これらのステップを厳格に遵守することで、技術的なばらつきを最小限に抑え、再現性のあるDNA回収が可能となる。先行研究においても同様に、サンプルの採取、保存条件、均質化、およびDNA抽出がマイクロバイオーム解析における主な変動要因であることが特定されており、再現性のある結果を得るための標準化されたワークフローの重要性が強調されている5,6,7,8。代表的な結果は、目に見える汚染や漏出のないサンプルの採取に成功し、すべてのテストサンプルにおいて測定可能なDNAが回収されたことを示している。

DNA回収に影響を与える可能性のあるいくつかの処置上の要因があり、実施時に考慮する必要があります。不十分な機械的または化学的溶解、不完全な均質化、効率の低い核酸結合、あるいは転送および洗浄ステップ中のサンプルの喪失により、DNA収量が低下することがあります。また、糞便組成、微生物バイオマス、およびサンプルの均質性のばらつきが、検体間のDNA回収率の差に寄与する場合もあります。したがって、一貫した結果を得るには、特にサンプルの均質化、ビーズビーティング、および自動抽出におけるプロトコルの慎重な遂行が重要です。トラブルシューティングでは、サンプルを処理する前に、試薬調製、装置の設定、プレートへの分注、および自動抽出プログラムの実行を確認することに重点を置くべきです。同様の推奨事項が、マイクロバイオーム解析ワークフローおよびDNA抽出手法を評価した研究で報告されています5,6,7,8,11.

本手法の主な制限は、生物学的検体間で観察されたDNA収量のばらつきである。代表的な結果で示されたように、DNA濃度の差は、糞便サンプルの固有の生物学的変動および検体処理中に導入された技術的変動の両方を反映している可能性がある。したがって、DNA濃度のみを抽出性能の唯一の指標として考えるべきではない。意図するダウンストリームアプリケーションに応じて、DNAの品質および適合性に関する追加の評価が必要となる場合がある。ダウンストリームの分子解析に対するDNAの品質と適合性をさらに評価するため、ユニバーサルプライマー27Fおよび1525Rを用いてPCRにより細菌16S rRNA遺伝子を増幅した。期待される約1.5 kbの16S rRNA遺伝子断片の増幅が成功したことがアガロースゲル電気泳動（図3）により確認され、抽出されたDNAがシーケンシングやその他の分子アッセイを含むダウンストリームアプリケーションに十分な品質であることが示された。同様に、過去のベンチマーキング研究においても、DNA収量が必ずしもダウンストリームのシーケンシング性能やマイクロバイオームプロファイリングの精度と相関しないことが示されている8,11。

手動の抽出ワークフローと比較して、自動磁性粒子プロセッサーは、手作業による処理を削減し、抽出条件を標準化し、オペレーターによるばらつきを最小限に抑えながら、ハイスループットなサンプル処理を可能にします9,10。しかし、便の硬さや微生物バイオマスの変動が、溶菌効率やDNA収量に影響を及ぼす可能性があります。加えて、細胞壁が強固な微生物は完全に溶菌されない場合があり、特定の分類群の代表性に影響を与える可能性があります。これらの制限はあるものの、自動抽出は大規模な腸内マイクロバイオーム研究において、堅牢で効率的なアプローチを提供します5,6,7,8,9,10。本プロトコルでは、標準化された糞便サンプルの採取と自動DNA抽出ワークフローを組み合わせることで、多数のサンプルを一定の条件で処理する必要があるマイクロバイオーム研究に対し、実用的かつ再現可能なアプローチを提供します。このような標準化された手法は、研究間の再現性を向上させ、マイクロバイオームプロファイリング、メタゲノムシーケンシング、およびその他のシーケンシングベースの解析を含む、下流の分子生物学的アプリケーションに適しています5,6,7,8,9,10。

開示事項

著者らは、金銭的または非金銭的な競合利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究を可能にするためのリソースと共同研究環境を提供してくださったSKAN Research Trust (India)に深く感謝いたします。また、事実確認および編集上のサポートをいただいたAnushree Kogje博士に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
80%エタノール（絶対エタノールから調製）MerckET00161000プロトコルに記載されている通り、絶対エタノールを用いて調製直後に使用してください。
吸収材Kimtech34256輸送バッグに同梱されています。
粘着式プレートシーリングフィルムApplied Biosystems4306311MicroAmp クリア粘着フィルム
自動磁性粒子プロセッサー（KingFisher Flex Purification System、96ディープウェルヘッド装着）Thermo Fisher Scientific5400630自動核酸抽出システム
バイオハザード標記付き密閉可能輸送バッグZymo ResearchR1180検体輸送用漏出防止輸送バッグ
BindIt ソフトウェアThermo Fisher Scientific5189009自動抽出プロトコルの変更および転送に使用したソフトウェア。
スパチュラ付き回収チューブ (30–50 mL)Zymo ResearchR1180滅菌済みのスクリューキャップ付き回収チューブ。
クッション支持QIAGEN69984TissueLyserアダプターセット（ビーズビーティング中の緩衝支持体として使用）。
ディープウェルプレート（96ウェル）Thermo Fisher Scientific95040460KingFisher ディープウェル 96ウェルプレート
使い捨て手袋Zymo ResearchR1180パウダーフリーを推奨。
溶出バッファーApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kitに付属しています。
糞便回収装置Zymo ResearchR1180滅菌済み採取装置
ヒーティングブロック（96ウェル ディープウェル）Thermo Fisher Scientific装置に付属KingFisher Flex精製システムの構成要素。
白衣現地サプライヤー該当なし個人用保護具
溶解バッファーApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kitに付属しています。
磁性ビーズApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kitに付属しています。
磁気ヘッド（96深井プレート用）Thermo Fisher Scientific5400630に同梱KingFisher Flexシステムに付属している96深孔磁気ヘッド。
マグネットスタンド（96ウェル）Thermo Fisher Scientific12332D磁気ビーズのキャリーオーバーが観察された場合にのみ必要。
マルチチャンネルピペットEppendorf312500005296ウェルプレートに対応。
NanoDrop分光光度計Thermo Fisher ScientificND-ONE-WA260/280およびA260/230比の測定に使用される。
核酸結合バッファーApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kitに付属しています。
油性マーカーシャーピー3002あるいは、事前印刷されたラベルを使用してください。
ピペットチップ、滅菌ろ過済み（10 µL)Tarsons528100滅菌済み目盛り付きフィルターチップ
ピペットチップ、滅菌ろ過済み（200 µL)Tarsons528104滅菌済み graduatd フィルターチップ
ピペットチップ、滅菌ろ過済み（1,000 µL)Tarsons529106滅菌フィルターチップ。プロトコルに指示がある場合は、先端をカットしてワイドボアチップを準備すること。
遠心機用プレートアダプターEppendorf5820710004ローター A-2-DWP-AT ディープウェルプレートアダプター
プレート対応遠心機Eppendorf5810Rotor A-2-DWP-AT アダプターに対応。
ビーズビーティング用プレートホルダーQIAGEN69984TissueLyser アダプターセット 2 × 96.
印字済みラベル（任意）ブレイディBBP12油性マジックの代替品。
Qubit dsDNA HS アッセイThermo Fisher ScientificQ33231DNA定量に使用される蛍光定量分析。
Qubit 蛍光光度計Thermo Fisher ScientificQ33327蛍光法によるDNA定量に使用される機器。
試薬リザーバーThermo Fisher Scientific8093マトリックス試薬リザーバー
サンプル安定化緩衝液Zymo ResearchR1180DNA/RNA Shield 糞便採取キット
滅菌済みコニカルチューブHiMediaTCP106H結合ビーズ混合物の調製に使用する。
TissueLyser III ビーズミルホモジナイザーQIAGEN9003240機械的破砕装置
チップコームプレートThermo Fisher Scientific97002534ディープウェルマグネット用KingFisher 96チップコーム
洗浄バッファーApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kitに付属しています。

参考文献

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