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方法論記事

オプトジェネティクスによる動的制御のためのLED埋込型32ウェルマイクロプレートの作製および利用

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DOI:

10.3791/73445

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2026年9月22日

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1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、微生物培養におけるハイスループットな光遺伝学的刺激と定量的な遺伝子発現測定を可能にするため、マイクロプレートリーダー内で使用する光遺伝学研究用32ウェルLED組み込みマイクロプレート（LEMOS 2.0）の作製、プログラミング、および操作方法について説明します。

要約

オプトジェネティクスによる制御は、光で作動する遺伝子発現の調節を可能にし、生細胞と電子システムの間にプログラム可能なインターフェースを提供します。しかし、オプトジェネティクス構成物の日常的なプロトタイピングは、依然としてインフラストラクチャによって制限されています。既存のクローズドループプラットフォームでは、ケモスタット、マイクロフルイディクス、ロボットハンドリング、またはカスタム光学センサーが必要となることが多く、これがコストの増加やアクセシビリティの低下、あるいは測定性能の制約につながる可能性があります。

ここでは、オプトジェネティクス研究向けに更新された発光ダイオード（LED）埋め込みマイクロプレートであるLEMOS 2.0を紹介します。これは、標準的なマイクロプレートリーダー内で光遺伝学的刺激および遺伝子回路の特性評価を行うための低コストなデバイスです。LEMOS 2.0は、オリジナルのLEMOSプラットフォームをベースにしており、マイクロウェルの数を16個から32個に増やしてスループットを向上させ、隣接するマイクロウェル間の光漏れを低減させることで、追加の照明状態として暗条件を実現しました。本デバイスは、3Dプリントされたフレーム、各マイクロウェルの隣に配置された個別に制御可能なLED、充電式バッテリー、およびBluetoothベースのワイヤレス通信用のオンボードマイクロコントローラで構成されています。生体適合性のあるポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロウェルは、レプリカ成形によってデバイス内に直接鋳造されており、透明なモールドを通じて細菌培養物の刺激を可能にします。本デバイスは標準的なプレートリーダーに適合するため、 吸光度および蛍光測定が可能です。

本プロトコルでは、デバイスの作製、回路の組み立て、Arduinoのプログラミング、PDMSマイクロウェルのキャスティング、プレートリーダーの設定、菌株および培養液の調製、自動実験の実行、デバイスの洗浄、ならびに蛍光/OD60データの解析を含む、LEMOS 2.0の全ワークフローについて説明します。デモンストレーションとして、緑色光でsfGFPの発現が活性化され、赤色光で抑制されるCcaSRオプトジェネティクスシステムを用います。LEMOS 2.0は、ウェットラボのユーザーがオプトジェネティクスによる摂動や遺伝子発現の特性評価をより容易に行えるようにすることを目的としており、専門的なバイオリアクターやマイクロ流体インフラを必要とせずに、設計・構築・テスト・学習（design-build-test-learn）のサイクルを高速化することを可能にします。

概要

オプトジェネティクス（光遺伝学）は、生細胞と電子制御システムとの間にプログラム可能なインターフェースを提供します。光を用いて遺伝子発現を調節することで、培養培地への摂動を最小限に抑えつつ、時間的な精度と可逆性を持って細胞挙動を作動させることができます1。蛍光または発光レポーターと組み合わせることで、オプトジェネティックシステムにより生物学的状態を電子的に測定し、フィードバックを通じて制御することが可能になります1。この双方向の光学インターフェースにより、遺伝子発現、細胞増殖、集団組成を含む細胞プロセスのサイバージェネティックな制御が実現しました2,3,4。しかし、成功している多くのクローズドループ・オプトジェネティックシステムには、特殊なケモスタット5、マイクロ流体デバイス4,6,7、またはロボットサンプリング2,3,8が必要であり、これがアクセシビリティを制限し、日常的な「設計・構築・試験・学習（design-build-test-learn）」サイクルを妨げる要因となっています。

マイクロプレートリーダーは、微生物の増殖や遺伝子発現ダイナミクスの測定に最も広く利用されている装置の一つである。これらは多くのサンプルにわたって信頼性の高い光学密度および蛍光測定を提供し、環境制御をサポートしており、すでに標準的な合成生物学のワークフローに組み込まれている9。しかし、標準的な市販のプレートリーダーの照明経路は光学測定用に設計されており、培養増殖中のプログラム可能でウェル特定のオプトジェネティクスによる作動向けには設計されていない。その結果、オプトジェネティクスの実験では、個別の照明装置10,1,12,13,14や、刺激プラットフォームと測定プラットフォーム間のロボットによる移送8,15、あるいはカスタムの読み出しハードウェア5,16,17が必要となることが多い。これらの追加ステップは時間分解能を低下させ、ハンドリングのばらつきを導入し、クローズドループ制御を複雑にする。

光遺伝学研究用LED内蔵マイクロプレート（LEMOS）は、この課題を解決するために開発されました18。LEMOSは、培養マイクロウェルの周囲に個別に制御可能なLEDを配置した、マイクロプレートリーダー互換のデバイスです。このデバイスは実験の間、市販のマイクロプレートリーダー内に設置されたままとなるため、同一プラットフォーム上で光刺激および蛍光測定、または60 nmにおける光学密度（OD60）の測定を行うことができます。当初の仕様では、LEMOSは16個の培養マイクロウェルをサポートしており、バッチ培養におけるオープンループ光遺伝学刺激および遺伝子発現のクローズドループフィードバック制御の実証に使用されました18。このデバイスは外部コンピュータと同期されており、測定時間中にLED照明を消灯させることで、蛍光および光学密度の読み取りへの直接的な干渉を最小限に抑えることが可能です。

本プロトコルでは、改良版デバイスであるLEMOS 2.0と、微生物培養における光遺伝学実験へのその活用について説明します。LEMOS 2.0は、個別に制御可能な培養マイクロウェルの数を16個から32個に増やすよう再設計されており、これにより実験のスループットが向上し、1回のランでより多くの条件、反復、またはコントローラ設計をテストすることが可能になりました。また、光照射されるマイクロウェルから隣接する暗所マイクロウェルへの漏れ光を低減するようにデバイス設計が変更されており、ダークコントロールおよび空間的にパターン化された刺激実験の信頼性が向上しています。これらの変更により、本プラットフォームは、比較光遺伝学的特性評価、多条件コントローラテスト、およびマイクロプレートリーダーをすでに導入している研究室での日常的なプロトコルとしての採用に、より適したものとなっています。

LEMOS 2.0は、プログラム可能な赤、緑、青、または暗状態の照明を用いて、OD60および蛍光測定を繰り返し行う必要がある微生物バッチ培養実験向けに設計されています。プレートリーダーは、キネティックOD60および蛍光測定、温度制御、振盪、32個のLEMOSマイクロウェルに対するカスタムプレートレイアウト定義、およびPython制御スクリプトによって監視されるフォルダへの測定ファイルの自動エクスポートをサポートしている必要があります。現在の実装は、BioTek Gen5 v3.14を搭載したBioTek Synergy H1マイクロプレートリーダーを用いて検証されています。他のプレートリーダーソフトウェアで実装する場合は、エクスポート形式、ファイルパーサー、および画面オートメーションの手順に適宜修正を加える必要があります。本デバイスは、放出ピークが620–630 nm、515–525 nm、および465–475 nmのLEDを使用しているため、ユーザーは、作動および読み出しスペクトルがこれらのチャンネルと互換性のある光遺伝学的アクチュエータおよび蛍光レポーターを選択する必要があります19,20。新しい宿主株、レポーター、光遺伝学システム、培地、生育温度、サンプリング間隔、またはコントローラー設計を導入する場合、LED強度、デューティサイクルの範囲、ブランク補正、蛍光正規化、およびコントローラーパラメータの再キャリブレーションが必要になると考えられます。

本プロトコルでは、デバイス作製、回路の組み立て、Arduinoのプログラミング、ポリジメチルシロキサン（PDMS）によるマイクロウェルのキャスティング、プレートリーダーの設定、菌株および培養液の調製、自動実験の実行、デバイスの洗浄、そして蛍光およびOD60データの解析まで、LEMOS 2.0のワークフロー全体について解説します。例示しているワークフローは細菌の光遺伝学的遺伝子発現制御に焦点を当てていますが、同様のフレームワークを他の微生物株、蛍光レポーター、光遺伝学的アクチュエータシステム、および制御アルゴリズムにも適用することが可能です。プログラム可能な照明と標準的なプレートリーダー測定を組み合わせることで、アップデートされたLEMOS 2.0プラットフォームは、バッチ培養におけるハイスループットな光遺伝学的摂動およびフィードバック制御実験への容易なアプローチを提供します。

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プロトコル

実験動物を用いるすべての実験手順は、 Escherichia coli 株MG1655  指定されたバイオセーフティレベル2（BSL-2）実験施設において、テキサスA&M大学。細菌の培養および操作は、標準的なバイオセーフティ・ガイドラインに従って、認定された第II級バイオセーフティキャビネット内で実施した。手順は、テキサスA&M機関の生物安全委員会（IBC）、許可番号IBC2023-044の下で実施。

1. LEMOS 2.0 フレームおよびLEDアレイの製作

注：LEMO S 2.0のフレームを3Dプリントし、デバイス本体にLEDストリップを配置することで、LEMO S 2.0の製作を開始する。目的は、各LEDが対応するマイクロウェルの隣に正確に位置する、機械的に安定したフレームを作製することである。この段階でのLEDの正確な配置は重要であり、位置ずれが刺激の均一性を低下させ、マイクロウェル間の光学的クロストークを増加させる可能性があるためである。

  1. GitHubリポジトリ（github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0）で提供されているSTLファイルを使用して、LEMOS 2.0の内側フレームおよびPDMSマイクロウェル用鋳型を3Dプリントする。印刷後にすべてのサポート材を取り除く。
    注：ポリ乳酸（PLA）フィラメントおよび積層造形法（FDM）プリンターを使用することを推奨する。印刷パラメータは、層厚0.2 mm、LEMOS 2.0フレームは内部充填率20％、鋳型は内部充填率40％とする。
  2. はんだ付けパッドの中央を切断して、LEDストリップを16個のLEDからなる2つのセットに分ける。各ストリップの端には、はんだ付け用に3つのはんだ付けパッドが確保されていることを確認する。詳細はセクション2で説明する。
  3. LEDストリップを半分に折り曲げ、LEDが外側を向くようにする（補足図1A、補足動画1).
  4. LEDストリップを装置の形状に手作業で合わせ、マイクロウェルの間に挿入します。+5 Vのはんだ付けパッドが下向きになるようにし、LEDストリップの矢印の向きに注意してください。補足図1A、補足動画1）。各LEDがスロットに正しく装着されるまで、ストリップの位置を繰り返し調整してから次に進む。

2. 電気回路の組み立てと検証

注：ワイヤレスデバイスの動作に必要な電源、充電、マイコン、スイッチ、LEDの接続をすべて組み立てる。組み立て後、LEMO S2.0デバイスはオンボードバッテリーから動作し、充電モジュールを通じて再充電可能となり、周辺のArduinoボードからLEDへの指令を受信できるようになる。誤った電圧の配線によりマイコンやLEDが損傷する可能性があるため、LEDストリップを接続する前に各電源接続を確実に確認すること。

注意：本プロトコルでは、はんだ付けに関する事前の熟練度が求められます。これには、適切な安全対策（例：煙吸収装置、保護眼鏡の使用および火傷防止法）、はんだごてのメンテナンス、および基本的なスルーホール／ワイヤーのはんだ付け技術が含まれます。これらの経験を有しない利用者は、本項の手順を実行する前に訓練を受けるべきです。

  1. 以下の電子部品をすべて用意する。 材料表 目に見える物理的損傷がないか点検する。配線図を確認する（補足ファイル1).
  2. ステップアップ電圧コンバーターを、デフォルトの12 Vではなく5 V出力に設定してください。基板背面の設定キーに従い、はんだごてで熱を加えてパッドAとBの接続を切断してください。
  3. Arduino Nano BLE Rev2（以下、BLE Nanoと呼称）のVINピンをステップアップコンバータのOUT+ピンに、BLE NanoのGNDピンをステップアップコンバータのOUT-ピンに半田接続する（補足図1B).
  4. ステップアップコンバーターINに半田付けする– バッテリー充電モジュールのマイナス（-）端子に接続します。
  5. 2本のワイヤーを分離する 'JST PH 2ピンケーブル – メス型コネクター、100 mm' 白いハウジングからバッテリー接続端子を取り外し、バッテリー接続部以外の端からそれぞれ約70 mmに切り揃えることで、デバイス内への適合性を向上させる。補足図1C).
  6. スイッチを改造する。まず、各隅の取り付けピンを外す。次に、すべてのピンをその長さの30％になるように切り詰める。その後、T1、T3、およびB3を完全に取り外す（表記法：Tはトップ、Bはボトムを意味し、スイッチを上にしてピンを正面から見たときに左から右へ1から4まで番号が振られている）補足図1D).
  7. 赤のJSTケーブルをB2に半田付けし、バッテリー接続用の端子はバッテリーに接続するために露出したままにしておく’s メスコネクタ後 (補足図1D).
  8. B1とB4の間に接続用のワイヤーをはんだ付けする。
  9. バッテリー充電モジュールのB+ピンをB1に半田付けする際、前の工程で接続した導線もB1に引き続き半田付けされているように注意すること（補足図1E).
  10. ステップアップコンバータのIN+ピンをT4に半田付けする。
  11. バッテリー充電モジュールの正極（+）ピンをT2に半田付けする。
  12. 黒のJSTケーブルをバッテリー充電モジュールのBに半田付けする– ピン。バッテリー接続端子側は、後でバッテリーに接続できるようにゆるんだままにしておく。’sメスコネクタ
  13. 通常のデバイス動作モードで接続を確認する。スイッチを中央（オフ）の位置にした状態で、はんだ付け工程で余らせたバッテリー接続用ワイヤーを介してリチウムイオン電池を回路に接続する。補足図1E).
  14. スイッチを左側／オンの位置に切り替えます（2本のピンが挿入されている側）。
  15. オンボードの電源LED（ラベル付き）を確認して、BLE Nanoへの電源供給を確認します。 ‘ON’、USBポートの隣）が緑色に点灯するはずです（補足図1E、補足動画1).
  16. 基板上のLEDが青色に点灯することを確認して、ブースターコンバータへの電源が供給されているかを検証する。
    注：LEDインジケータが点灯しない場合は、次に進む前にマルチメータを使用してすべての接続を確認してください。
  17. ステップ1.4で挿入した最初のLEDストリップを取り外し、VIN、DIN、GNDのパッド両方にワイヤーをはんだ付けする。その後、LEDストリップを再挿入し、ワイヤーをフレーム側面のポートを通して通す。補足図1F、補足動画1).
  18. 2番目のLEDストリップについても、以下に従って繰り返す。 補足ビデオ1.
  19. 最初のLEDストリップをBLE NanoのGNDピン、BLE NanoのD13ピン、およびBLE NanoのVINピンに半田付けする。
    注：VINピンへのはんだ付けは、同じArduinoピンに2本のワイヤーをはんだ付けする必要があります。1本のワイヤーはピン穴の内側にはんだ付けし、もう1本は ナノボードのピンホールの外側、くぼみの部分に。
  20. 2本のLEDストリップをはんだ付けする。
  21. マルチメータを導通モードに設定し、BLE NanoのVINピンと最後の半田付けされていないLEDパッドの+5Vパッドに probesを接触させることで、接続を確認する。GNDについても同様に繰り返す。
  22. ホットメルト接着剤でLEDストリップを固定する（補足図1F、補足動画1。ゆっくり作業を行い、接着剤が冷える間隔を設けながら、一度に1組または2組のLEDのみを接着する。必要に応じてピンセットを使用して、LEDの位置を固定する。

3. 中央および周辺Arduinoボードのプログラミング

注：無線通信およびLED制御に使用する2つのArduinoボードをプログラムしてください。中心となるArduino（Arduino Nano IOT 33）は実験中にコンピュータに接続されており、Pythonスクリプトからのコマンドを中継します。周辺のArduino（Arduino Nano 33 BLE Rev 2）はLEMOS 2.0装置内に設置され、LEDアレイを制御します。実験を開始する前に、両方のボードに適切なスケッチをあらかじめ書き込んでおく必要があります。Arduinoスクリプト内の記載された行のコメントを解除することで、他方のデバイスへの接続成功を視覚的に確認できます：中心 – 34行目–37、黄色LEDが点滅；周辺部 – 99行目–106、緑色LEDが点滅します。デバイス間の接続が正常に確立されたことを確認した後で、これらの行のコメントを再び解除してください。そうでない場合、デバイスがプレートリーダー内にある際にLEDが点滅する可能性があり、測定結果に影響を及ぼすことがあります。

  1. GitHubリポジトリからArduinoファイル（LEMO_Central.ino、LEMO_Peripheral.ino）をダウンロードする。Arduino統合開発環境（IDE）の最新版をhttp://www.arduino.cc/en/software からダウンロードしてインストールする。
  2. ボードマネージャーから最新版のボードパッケージをインストールします（ツール > ボード > ボードマネージャー) (補足図2A).
    中央：Arduino SAMDボード
    周辺機器：Arduino Mbed OS Nano Boards
  3. ライブラリマネージャーで以下のArduinoライブラリをインストールします（ツール > ライブラリの管理) (補足図2B): 'ArduinoBLE’ 周辺機器と中心機器の間でのBluetooth Low Energy通信のために、および ‘Adafruit_NeoPixel’ LEDプログラミング用。
  4. Arduino IDEでLEMO_Central.ino Arduinoファイルを開く。
  5. USBデータケーブルを使用して、対応する装置をコンピュータに接続する。
  6. 接続されたデバイスの正しいCOMポートを選択してください（ツール > ポート）。COMポートが明確でない場合は、デバイスを接続および切断した際に表示されたり消えたりするポートを確認してください。
  7. ボードメニューからArduino Nano 33 IoTボードを選択します（ツール > ボード).
  8. 装置にスクリプトをアップロードする。
  9. LEMOs_Peripheral.inoファイルと周辺機器（Arduino Nano 33 BLE Rev 2）についても同様に繰り返す。

4. レプリカ成形によるPDMSマイクロウェルの鋳造

注：LEMOS 2.0フレーム内にレプリカモールド法を用いて、光学的に透明なPDMSマイクロウェルを直接鋳造する。21PDMSマイクロウェルは、プレートリーダー実験中に細菌培養を保持するものであり、信頼性のあるOD測定を行うためには、透明で気泡のない底面を有している必要がある。600 および蛍光測定。ダスト、気泡、または硬化不完全はウェル間の変動を引き起こす可能性があるため、鋳造時に回避すべきである。PDMS内のダストや異物が光学的透明性を損ない、不均一なODとなるため、鋳造前にフード内の作業面を清潔に保つ必要がある。600 マイクロウェル全体の測定値。

注意：未硬化のPDMSを扱う際は、必ず換気櫓内で作業してください。硬化剤との皮膚接触を避けてください。

  1. LEMO S 2.0 フレーム内側のマイクロウェルを鋳造する部分を、LEDを除く電気部品に直接触れないよう注意しながら70％エタノールをスプレーして消毒する。PDMSマイクロウェルの鋳造前に、LEMO S 2.0 フレームを完全に乾燥させる。
    注意：LEDへのエタノールの暴露は安全ですが、その他のすべての電気部品を損傷する可能性があります。
  2. PDMSマイクロウェルの鋳型に離型剤をスプレーし、スプレーがプラスチック表面に定着するまで10分間待機する。さらに10分後に再度スプレーを行うと離型性が向上する場合があるが、これは任意である。
    注：離型剤（例：Ease Release 200）を使用することで、鋳型が疎水性となり、硬化したPDMSマイクロウェルから鋳型を容易に剥離できるようになる。
  3. 184シリコーンエラストマーの硬化剤とベースを、ベース：硬化剤＝10：1の質量比になるように使い捨てプラスチックカップ内で秤量し、混合する。
    注：1台のLEMO S 2.0装置に対して、硬化剤2.5 gとベース剤25 gを用いて合計27.5 gの混合液を使用することが推奨される。複数の装置を同時に鋳造する場合は、それに応じて量を比例増加させること。
  4. 使い捨てスパチュラまたは木製棒で少なくとも5分間強く攪拌し、カップの側面および底部をこそげ取りながら完全に混合する。
    注意：十分な混合が重要である。混合が不十分なPDMSは均一に硬化せず、ベースラインODが不均一になる。600 マイクロウェル間の測定値
  5. PDMS混合物を入れたカップを真空デシケーター内に置き、65 cmHg（25 inHg）以上の真空状態を45分間維持する。–60分間脱泡する。混合物から目に見える気泡がすべて取り除かれるまで続ける。気泡が表面に上昇するにつれてPDMSが膨張し、容器からあふれる可能性があるため、少なくとも3倍の容量を持つ容器を使用すること。× 混合物の体積。
    注意：硬化したPDMS内の残留気泡はマイクロウェル底部の光学的透過率に影響を与え、ODのベースラインが不均一になる可能性があります600 測定。
  6. 適切なサイズのバインダクリップを4辺すべてに使用して、LEMOS 2.0フレームを外側のシェルに固定する。
    注：バインダクリップを使用することで、外殻とLEMOS 2.0フレームの隙間に浸透するPDMSの量を最小限に抑えることができます。この隙間に過剰なPDMSが存在すると、装置全体の高さが増加し、LEMOS 2.0フレームが外殻内で水平に配置されなくなる可能性があります。マイクロウェルに隣接するLEMOS 2.0フレームの底部周辺にカプトンテープを貼ることで、さらに浸透を低減できます。
  7. 脱気したPDMSをLEMOS 2.0フレームに注意深く注ぎ込む。シリンジを用いてフレーム内の各マイクロウェルにPDMSを追加し、気泡が最小限になるように完全に充填する。
    注意：微小な気泡の発生は避けられないが、それらは最終的に表面に上昇して消滅する。脱気後のPDMSは、取り扱い中に気泡が再導入されるのを最小限に抑えるため、脱気直後にすぐに流し込むこと。
  8. 3Dプリントされた鋳型をPDMSで満たされたフレームに挿入する。鋳型を軽く均等に押しこみ、鋳型の円形突起がLEMOS 2.0フレームの穴に正しく嵌るようにする。この鋳型により、LEDに隣接して整列した正方形のマイクロウェルが形成される。余分にあふれたPDMSを、清潔な不繊維ワイプでふき取る。
  9. PDMSを室温（25℃）で硬化させる。 °C) 水平面に少なくとも30時間以上置く。必要に応じて、装置を37℃に設定した場所に置くことで硬化を促進する。 °PDMSから目に見える気泡がすべて除去された後、4時間、C。
    注意：LEMOS装置を37℃を超える温度にさらさないでください。 °C、これにより内蔵のリチウムイオン電池が過熱して破裂する恐れがあるため。
  10. PDMSマイクロウェルが硬化したら、エッジをつまんで一定の力で上に引き上げることにより鋳型を外す。PDMSマイクロウェルがフレーム内に残るように注意する。
  11. 各マイクロウェルを点検し、壁面が光学的に透明であり、底部に気泡がないことを確認する。新しくPDMSマイクロウェルを取り付けたLEMOS 2.0装置は、これで使用可能な状態になった。

5. マイクロプレートリーダーの設定とデータエクスポートのワークフロー

注：マイクロプレートリーダーを設定して、LEMOS 2.0に対応したキネティック測定およびデータ出力の自動化を可能にする。リーダーはカスタムのLEMOS 2.0マイクロウェル配置を認識し、ODを取得できなければならない600 所定の間隔で蛍光測定を行い、データファイルをPython制御スクリプトが監視するフォルダーにエクスポートする。PDMSマイクロウェルおよびプレートリーダーの設定が一貫した測定値を生成することを確認するために、生物学的実験に先立ち無菌培地を用いてベースライン測定を実施する。本プロトコルでは、BioTek Gen5ソフトウェアv3.14を用いて操作するBioTek Synergy H1 マイクロプレートリーダーを使用する。

  1. Gen5を起動します。
  2. 次へ移動する プレートの種類 および取り込み LEMOS 2.0.xml GitHubから、またはGen5でLEMOS 2.0用のカスタムプレート配置を設定することにより 補足ファイル2 （第1節）  および 補足ファイル3.
  3. LEMOS 2.0装置を用いてベースライン測定を行う（マイクロウェルに200 µ滅菌済みM9CA培地Lを医療用密封フィルム（例：Breathe-Easyフィルム）で覆ったもの）。ODを記録する600 32個のマイクロウェルの蛍光ベースライン値を測定し、標準的な96ウェルマイクロプレートから得られた値と比較する。大きな差異が見られた場合は、硬化したPDMS内に気泡や不純物が存在する可能性が高いため、PDMSマイクロウェルを再作製する。
    注意：Breathe-Easyフィルムは気体透過性があり、細胞成長のための好気的条件を維持する一方で、光学的に透明であるため、蛍光およびODの測定を妨害しません600 測定
  4. 実験手順を開く closed_loop_protocol.prt Gen5のGitHubリポジトリから
    注：利便性のため、GitHubリポジトリに事前に構成済みの実験ファイルテンプレート template.xpt が用意されています。ただし、設定内容については以下に詳細に記述しています。 補足ファイル2 （第2節） および 補足ファイル3 異なるバージョンのGen5を使用するユーザー向けのトラブルシューティングの参考情報を提供する。

6. LEMOS 2.0 実験用細菌培養の調製

注意：LEMOS 2.0光遺伝学的経時実験用に細菌培養物を調製する。培養物の調製には注意を要する。初期の細胞密度や実験前の光照射が、測定される遺子発現ダイナミクスに影響を与える可能性がある。本実験で用いるデモ用株は次のとおりである。 Escherichia coli (E. coli) pSR58.6 および pNO286-3 を保有する MG165522pSR58.6にはスーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（sfgfp) Pの下でcpcG2 構成的CcaR、クロラムフェニコール耐性、およびpColE1複製起点を含む。pNO286-3は構成的CcaS、スペクチノマイシン耐性、およびp15A複製起点を含む。これらのプラスミドを組み合わせることで、緑色光で誘導され赤色光で抑制される遺伝子発現システムが再構成される。pSR58.6およびpNO286-3は、化学的形質転換能を有する大腸菌に導入された E. coli 標準的な熱ショック法を用いたMG1655の形質転換23プレートは箱の中に入れて細胞を周囲の光から保護し、光遺伝学回路の過早な活性化を防いだ。

  1. CcaSRオプトジェネティクス株の単一コロニーと蛍光陰性対照株を、それぞれ2 mLのM9CAブイヨン（50 μg/mLのアンピシリンを添加）が入った14 mL丸底培養チューブに接種する µg/mL スペクチノマイシンおよび25 µg/mL クロラムフェニコール。この培地組成を実験中のその後のすべての培養工程に使用する。
  2. 各チューブをアルミホイルで覆い、一晩（14時間–16 時間）37℃ °220 rpmで振とうしながら
    注意：アルミホイルでラップすることで暗条件を維持し、CcaSRシステムの意図しない活性化を防ぐことができる。あるいは、セクション2で記述したのと同じ電気配線を備えたLEDケース内にチューブを収容し、恒常的な赤色光下で培養を行うことも可能であり、この条件は実験前のシステムの抑制状態をより正確に模倣する。
  3. 100を移す µ前日の培養液をそれぞれ2 mLの新鮮な培地が入った新しいアルミホイルで包んだ培養チューブに移し、37℃で4時間培養する。 °220 rpmで振とうしながら
  4. ODを測定する600 4時間後にマイクロプレートリーダーを用いて各サブカルチャーの値を測定する。
    注意：培養液はODに達している必要がある600 0.4の–0.6.
  5. 各培養液をODに希釈する600 = 0.1の新鮮な培地に、ピペットで200 µLEMO S 2.0デバイスの各マイクロウェルに、ピペッティング時に気泡が生じないよう注意しながら100 µLずつ添加し、医療用シーリングフィルムでデバイスを密封する。

7. LEMOS 2.0を用いたオプトジェネティクス時間経過実験の開始

注：自動化されたLEMOS 2.0実験は、マイクロプレートリーダー、中央Arduino、およびPython制御スクリプトを連携させることで開始する。実行中は、コンピューターがプレートリーダーによる測定、データのエクスポート、Bluetooth通信、およびLEDの駆動を統合的に制御する。Pythonスクリプトは画面ベースの自動操作によりプレートリーダーソフトウェアと相互作用するため、Gen5のウィンドウを常に表示した状態にしておくことが不可欠である。実験が正常に開始されたことは、所定のフォルダーにデータファイルがエクスポートされていること、端末にBluetooth通信の確認メッセージが出力されていること、および各制御間隔でLED指令が更新されていることによって確認できる。

  1. LEMO S 2.0装置のスイッチを左にスライドして電源を入れます。LEMO S 2.0のLEDストリップの最初のLEDが緑色に点灯します。
  2. 中央のArduinoをUSBでコンピュータに接続し、Arduino IDEのドロップダウンメニューからそれを選択します（ツール > ボード).
  3. 開く 直列モニター LEMOS 2.0に設置された周辺Arduinoを中央Arduinoに接続する。
  4. LEDストリップのインジケータLEDを、文字を入力してオフにします 'o' シリアルモニターに。
  5. 実験ファイルを開く LEMOS-start-data.xpt Gen5で培養物のベースライン読み取りを行い、装置内のODを確認すること600 蛍光値は予想通りの範囲内である。実験ファイルを閉じる。
  6. 手順5.4で保存したプロトコルファイルをGen5で開き、実験として保存するには、以下の手順を参照してください。 補足ファイル2 （第3節） および 補足ファイル3.
  7. システムにPython 3.10 以降がインストールされていることを確認し、提供された requirements.txt ファイルを使用して必要なパッケージをインストールする。
  8. 開く control_duty_cyle.py （デューティーサイクル実験の場合）または control_pid.py （PID実験用）Visual Studio CodeやSpyderなどの適切なIDEで。
    注：Pythonスクリプトがすべて格納されているフォルダをワーキングディレクトリとして設定しておき、スクリプト実行時にインポートできるようにすること。IDEの選択は重要ではない。
  9. において、 メイン Pythonスクリプトのセクションを変更する ファイル 手順7.6でGen5実験ファイルに選択したファイル名と一致するように変数を設定する。
  10. 実験ファイルとPythonスクリプトを並べて設定する（図1).
  11. クリック 実行する Gen5実験で、キネティックステップが始まった時点で中止する。
    注：Pythonスクリプトは、 続ける クリック後にボタン 実行するただし、新しい実験ファイルでは、2回目の測定が行われるか、またはキネティック測定が中止されるまで、このボタンは表示されない。
  12. Pythonスクリプトを実行してください。実行中はGen5ウィンドウを最小化したり、他のウィンドウで覆ったりしないでください。
    注：Pythonスクリプトは画面ベースの自動化を使用しており、各キネティックサイクル後のデータエクスポートを処理するために、約20分ごとにGen5ウィンドウを検出できる必要があります。この期間中にウィンドウを遮ったり最小化したりすると、実験が中断される可能性があります。

8. デバイスの清掃、PDMSの除去、およびバッテリーの再充電

注意：実験後はLEMO S 2.0装置を清掃およびリセットしてください。細菌培養物および使用済みのPDMSマイクロウェルを取り外し、再利用可能なフレームとシェルを消毒し、次回の実験に備えてバッテリーを充電してください。清掃時には、LED以外の電子部品をエタノールや過度の機械的力にさらさないでください。

  1. LEMOS 2.0デバイスの上部にある医療用シーリングフィルムを静かにはがして捨ててください。
  2. 各マイクロウェルの細胞懸濁液をピペットを用いて吸引除去し、生物学的廃棄物処理手順に従って廃棄する。
  3. 外殻をLEMOS 2.0フレームから、一定で均一な力を加えて分離する。PLA製フレームを過度に曲げたりねじったりしないこと。こうした操作は割れや永久的な変形を引き起こす可能性がある。
  4. フレームの外側からバルクPDMS層を剥がし、ピンセットを用いてLEMOS 2.0フレームからPDMSマイクロウェルを慎重に取り除く。
  5. ステップ4.1で説明されているように、LEDを除くすべての電気部品に直接触れないよう注意しながら、LEMOS 2.0のフレームおよび外装を70％エタノールで消毒する。
  6. 次の実験のためにリチウムイオン電池を充電する：
    1. スライドスイッチを右（充電）位置にスライドさせる。
    2. USBを充電モジュールに接続する。
    3. オンボードLEDによる充電の確認。充電中はLEDが点滅します（補足図1E).

9. 蛍光および成長動態の解析

注：蛍光およびODを処理する600 LEMO 2.0実験中に取得されたデータ。解析ノートブックはエクスポートされたプレートリーダーのデータをインポートし、ブランクおよびネガティブコントロールの補正を適用、正規化蛍光値を算出し、時間経過プロットを生成する。ノートブックを実行する前に、マイクロウェルの割り当ておよび条件ラベルが実験設計と一致していることを確認すること。

  1. どちらかを開く FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb または FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    注：これは走行中に生成され、これらのファイルに保存された蛍光（FL）および光学密度（OD）データを使用します。 データファイル/fl.csv および データファイル/od.csvPID解析シートは、設定値からの発現誤差のうち、保存されているものも使用する。 Datafile/errors.csv.
  2. 条件名とウェルを含む条件変数を設定する。
  3. セット 陰性ウェル 陰性対照マイクロウェル名の角括弧で囲まれたリストと等しい。
  4. 設定する od_blank および fl_blank ブランクウェルを実施しなかった場合は、ブランクウェル間の平均値、または既知の値に補正する。
  5. 設定 図4の色 目的の色に（名前付き色の完全なリストは https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html で利用可能）。
  6. figsizeを、結果の図の希望の幅と高さ（インチ単位）に設定します。
  7. ファイル名が以下にリストされていることを確認する 定数.
  8. ノートブックを実行すると、図が.pngファイルとして生成されます。

10. トラブルシューティング

  1. LEDの配線中にLEDのはんだパッドが剥がれた場合、以下の点を検討してください：
    1. LEDストリップの端を曲げて、配線ポートにコードを通しやすくする。
    2. より硬い（固体）ワイヤーを使用した場合は、より柔軟性のある（より線）ワイヤーに交換する。
  2. スイッチがオンになるとともにBLE Nanoが'電源LEDが点灯しない場合、以下の点を確認してください。
    1. まず、バッテリーが充電されているか確認してください。スイッチを充電モードに設定し、充電モジュールを電源に接続します。充電されている場合、数分後にインジケータLEDの点滅が止まり、緑色の常灯になります。バッテリーが完全に放電している場合は、再試行前に完全に充電されるまでお待ちください。
    2. バッテリーが充電されていてもLEDが点灯しない場合は、マルチメータを使用してBLE Nanoの両端間の電圧を測定してください。's VINおよびGNDピン。
      1. 0 V：配線接続が切断されています。バッテリーに沿って各はんだ接合部を点検してください > スイッチ > 昇圧コンバータ > ナノパスを使用し、冷たそうまたは不完全に見えるすべての接合部を再加熱してリフローする。
      2. 5 V：Nanoに電源が正しく供給されているため、基板自体に損傷がある可能性があります。ケーブルでNanoに給電して確認してください。電源LEDが依然として点灯しない場合は、不良となったNanoを新しいNanoに置き換えるためにリワークし、はんだ付けを行ってください。
      3. 5 Vを超える場合：ステップアップコンバータが5 V出力に設定されていません。デバイスの組み立てセクションで説明されているように、ステップアップコンバータのパッドAおよびBが切断されていることを確認してください。
  3. Pythonスクリプトの実行に失敗した場合は、以下の点を検討してください。
    1. Pythonスクリプトがスタンドアロンのファイルとしてではなく、プロジェクトフォルダ内から開かれているかどうかを確認してください。control_duty_cycle.pyおよびcontrol_pid.pyは他のローカルモジュールに依存しており、個別に開いた場合にエラーが発生します。
    2. Arduino IDE が閉じていることを確認してください。Arduino は同時に1つのアクティブな接続しか持てないため、オペレーティングシステムは最初にポートを開いたプログラムにアクセスを許可します。
    3. Gen5プロトコルが正しく設定されていることを確認してください。特に、異なるソフトウェアを使用している場合は、参照してください。 補足ファイル2 （第2節）
    4. 必要なパッケージがインストールされていることを確認する。仮想環境を作成し、requirements.txtファイルに記載されているパッケージをインストールする。
  4. 実験が予期せず停止した場合は、以下の点を検討してください。
    1. 1回目のサイクル後に停止します：Gen5のデータエクスポートパスが正しく設定されていない可能性があります。エクスポート先が、Pythonスクリプトが読み取り元として想定するフォルダと一致しているか確認してください。 ファイル 変数
    2. 数サイクル後に停止する：PyAutoGUIは、画面解像度、ディスプレイの拡大縮小、またはウィンドウサイズが変更された後などに、画面上の要素を認識できない場合があります。スクリプトで使用される基準となるスクリーンショットを再取得し、実行中はGen5ウィンドウをアクティブにし、前面に保ちます。Python IDEのウィンドウは最小化しても構いません。
    3. Gen5がチャンバー温度が目標範囲外であると報告した場合は、継続する前にリーダーを平衡状態まで安定させる。温度警告を無視してはいけません。その操作により、手動で閉じる必要のある監査レポートウィンドウが起動し、自動化プロセスが中断される可能性があります。
  5. 異常に高いまたは不整合なODの場合600マイクロウェル全体の蛍光ベースライン値を観察する場合、以下の点を考慮してください。
    1. PDMSマイクロウェルに捕捉されたほこりやごみがないか点検する。これらは光を散乱し、測定値を過大評価させる原因となる。
    2. PDMSを鋳造または使用前には、長時間にわたり蓋をせずに大気中にさらさないように注意する。
  6. 実験を実施したにもかかわらず、細胞が光に対して明確な反応を示さない場合は、以下の点を検討してください。
    1. LEDを確認する "上" IDEのターミナル出力とBLE通信ログの両方を確認しながらコマンドが発行されている。
    2. コマンドが送信されているにもかかわらず光が見えない場合は、マルチメータを使用してLEDのはんだ接続を確認してください。

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結果

LEMOS 2.0は、プログラム可能な光遺伝学的刺激および定量的な遺伝子発現測定のための、32ウェル形式のマイクロプレートリーダー互換プラットフォームである24（図 2A、B）。各マイクロウェルには、個別に制御可能なWS2812B発光ダイオード（LED）が組み合わされており、Adafruit_NeoPixelライブラリを介してArduino Nano 3 BLE Sense Rev2により制御される。本デバイスはBluetoothを通じて外部コンピュータと通信し、実験中に照明コマンドを更新することが可能である。使用前に、レプリカ成形法によって新鮮なPDMSマイクロウェルがデバイス内に鋳造される（図 2C、D）。LEMOS 2.0を用いて30 °Cで定常的なLED照明下で培養したE. coli培養液は、マイクロウェル間で再現性のある増殖を示し、本デバイスが実験期間を通じて細菌培養およびプレ...

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ディスカッション

本プロトコルでは、標準的なマイクロプレートリーダー内での光遺伝学的刺激およびフィードバック制御実験のための、LED埋め込み型32ウェルマイクロプレートであるLEMOS 2.0の作製と操作について説明します。代表的な実験により、LEMOS 2.0は微生物の増殖をサポートし(Figure 2E)、照明下で有意な光毒性は観察されませんでした。さらに、LEMOS 2.0は隣接する暗条件マイクロウェルへの光漏れを低減し(Figure 3D)、これによりダークコントロールおよび空間的にパターン化された刺激実験の信頼性が向上します。加えて、LEMOS 2.0はデューティサイクルに基づく光遺伝学的作動を可能にし(Figure 3E)、バッチ培養における遺伝子発現のクローズドループPID制御を実現します(Figure 4B)。

光遺伝学の実験では、作動と蛍光読み出...

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開示事項

著者は開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者B.J.、T.S.B.、およびH.R.N.はテキサスA&M工学実験所

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 AWG 撚り線接続用電線 アマゾンASIN: B089CQ2N69電気回路を接続するための安価な電線。単線またはより線がいずれも使用可能である。
8ピン 3ポジション 2P3T DP3T スライドスイッチ サイドノブアマゾンASIN: B07Q9Y8YCスイッチとピンは、一般的によく見られる反対側ではなく、隣接する面に配置してください。
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX0071マイコン（マイクロコントローラ） – 薄型プロファイルとBLE機能は、周辺機器のニーズに適しています。
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX0027マイコン（マイクロコントローラ） – 中心装置として使用される。
BioTek Synergy H1 マイクロプレートリーダーAgilent (BioTek)—またはキネティックモードを備えた互換性のあるプレートリーダー
Breathe-Easy シーリングフィルムUSA Scientific9123-6100医療グレード密封フィルム、ガス透過性マイクロプレートシール
クロラムフェニコール（エタノール中 25 mg/mL ストック溶液）各種—作業濃度 25 µg/mL
E. coli MG165
Ease Release 20マン放出技術離型剤
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LB寒天培地プレートおよび適切な抗生物質院内での / 自社での / 学内での—これらはすでに存在しているものと想定されます。
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Nunc OmniTray シングルウェルプレートThermo Scientific242811外殻
pNO286-3Addgeneプラスミド #10746CcaSの構成的発現をコードする
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真空デシケーターおよびポンプ多様な—PDMSの脱気について
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