方法論記事

新規物体認識試験および海馬バイオマーカーを用いた、マウスにおける睡眠剥奪誘発性認識記憶障害モデル構築のための迅速なワークフロー

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DOI:

10.3791/73557

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2026年9月8日

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1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本記事では、ジェントルハンドリングによる睡眠剥奪、新規物体認識試験、および海馬バイオマーカー解析を同一個体に対して10日間のパイプラインの中で組み合わせることで、マウスにおける睡眠剥奪誘発性の認識記憶障害をモデル化する、迅速かつ再現性の高いワークフローを提示します。このワークフローには、構造化された介入ログの記録と、あらかじめ定義された品質管理基準が含まれています。

要約

睡眠不足は認知機能の低下を招き、神経変性プロセスを加速させる可能性があります。本記事では、マウスにおける睡眠不足誘発性の認識記憶欠損をモデル化し、行動結果を海馬の分子変化に結びつけるための、迅速かつ再現可能なワークフローを提示します。本プロトコルでは、標準化された10分間の新規物体認識（NOR）慣らしセッションの直後に、5時間のジェントルハンドリング（gentle-handling）による睡眠剥奪パラダイムを適用します。認識記憶の評価は、厳密に定義された5時間の保持間隔の後に行う5分間のNORテストを用いて実施し、その後、同一個体から直ちに海馬を採取して、インターロイキン-1ベータ（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）を含む前炎症性サイトカイン、およびスーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）、マロンジアルデヒド（MDA）を含む酸化ストレスマーカーの定量を行います。本手法の主要な進歩は、個々の行動学的または生化学的手法（これらは十分に確立されています）にあるのではなく、それらを一連の連携したワークフローとして運用的に標準化した点にあります。本プロトコルでは、ジェントルハンドリングによる介入の構造化および定量的なログ記録、トレーニングと睡眠剥奪の固定された概日時間への同期、NOR記録と組織サンプルの個体レベルでの紐付け、および品質管理と分析基準の事前定義が求められます。この手順は、身体的拘束と強制的な運動を最小限に抑えるように設計されており、短期間の実験ウィンドウ内で完了させることが可能です。また、独立した再現性の検証を前提として、個々の研究室が自身のジェントルハンドリング睡眠剥奪の実施状況をベンチマークするために利用できる、リファレンスワークフローの候補として提案します。

概要

睡眠は、脳機能、学習、および記憶の定着に不可欠な根本的な生理学的プロセスである1。睡眠不足は、認知機能障害、気分障害、および神経変性疾患の進行に関連している2。げっ歯類を用いた実験的な睡眠剥奪（SD）は、急性の睡眠喪失による神経生物学的な影響を調査するために広く利用されている。宣言的記憶および空間記憶の中心となる脳領域である海馬は、特に睡眠剥奪の影響を受けやすい3。

げっ歯類において睡眠不足を誘発するための手法はいくつか存在する。改良多プラットフォーム法はレム睡眠を効果的に減少させることができるが、相当なストレスや身体的疲労を伴う可能性がある4。対照的に、ジェントルハンドリング（GH）は、睡眠の兆候が現れた際に、ケージを叩く、床材を乱す、あるいは新しい巣材を提示するといった軽微な感覚刺激によって覚醒状態を維持させる手法である。学習直後に短時間のGHを行うことで、長期的な睡眠剥奪パラダイムに伴う多くの混同要因を避けつつ、海馬依存的な記憶定着を妨げることができる5。本プロトコルにおける介入は、EEGで確認されたREM検出ではなく、姿勢や行動上の覚醒手がかりによってトリガーされるため、ここで実施するGHはREM特異的な手法ではなく、確立された全睡眠剥奪法として構成されており、数十年にわたりこの形式で用いられてきた6。

新規物体認識（NOR）テストは、認識記憶の評価に広く用いられるアッセイである。このテストは、報酬や罰、あるいは広範なトレーニングを必要とせず、馴染みのない物体を馴染みのある物体よりも探索するという齧歯類の自然な傾向に基づいている7,8。急性睡眠剥奪（SD）は新規物体の識別能を低下させることが示されており、これにより記憶定着の阻害を効率的な行動指標として読み取ることができる9。分子レベルでは、睡眠不足は海馬の神経炎症や酸化ストレスを誘発し、抗酸化能の低下とともに、前炎症性サイトカインや脂質過酸化物のレベル上昇を引き起こす可能性がある10,11。

このモデルを適用する際の課題は、個々の要素の利用可能性ではなく、研究間における運用上の整合性の欠如にあります。穏やかなハンドリングが報告されていても、介入強度の構造化された記録がないことが多く、行動学的および分子生物学的なエンドポイントが別々のコホートで収集されることも頻繁にあります。また、探索行動の品質管理基準やサンプルサイズの計画が常に明確であるとは限りません。本記事の全体的な目的は、同一個体において行動学的結果と海馬の分子レベルの測定値を結びつけながら、睡眠剥奪誘発性の認識記憶欠損をモデル化するための標準化されたワークフローを提供することです。本手法では、トレーニング後5時間のGHウィンドウ、介入強度ログ、同一コホートでの行動試験および組織採取、そして事前定義された分析基準を単一の10日間パイプラインに統合することで、これらの再現性のギャップに対処しています（図 1）。GH実施における標準化の欠如については、睡眠研究の方法論に関する文献において以前から指摘されています6。

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図1。実験ワークフローの概略図。プロトコルは、ハンドリングと馴化を含む10日間に及び、その後、10分間のNOR慣習化フェーズ、5時間のGH睡眠剥奪、5分間のNORテスト、およびバイオマーカー分析のための同一個体からの海馬組織の即時採取を統合した重要なテスト日が行われる。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

プロトコル

すべての動物実験手順は、南京ドラムタワー病院（研究責任者：Yuan Liu）からの申請に基づき、適用される機関および国の規制に従って、AILIMO（浙江AILIMO生物技術有限公司）の実験動物福祉倫理委員会によって審査および承認されました（承認番号：AP CODE: ALM202605070、2026年5月7日承認、有効期間4年）。以下に述べるプロトコルでは、成体雄性C57BL/6Jマウス（8–12週齢）を使用してください。

1. 準備および動物の馴化

  1. 標準的な実験室条件下（温度 22°C ± 1°C、湿度 50%–60%、明暗サイクル 12時間/12時間、点灯 07:00をZT0と定義）でハウスマウスを飼育する。標準的な齧歯類用飼料と水を自由摂取させる。
  2. 試験前の少なくとも7日間、毎日3–5分間、各マウスのハンドリングを行う。
    注：この手順により、探索行動に影響を及ぼす可能性のあるハンドリング誘発性ストレスを最小限に抑える。
  3. 壁面が非反射性の、40 cm × 40 cm × 40 cm の正方形で不透明なNORアリーナを準備する。アリーナの色は、動物の被毛色とコントラストをなす色を使用する。
  4. 移動しない十分な重量があり、非多孔性材料で作られたNORオブジェクトを選択する。全体のサイズは同等でありながら、形状と質感が区別できるオブジェクトを使用する。
    注：図 2にトレーニングおよびテストの構成を示す。
  5. 8日目と9日目に、馴化の1時間前にマウスをテストルームへ移動させる。各マウスを空のアリーナに10分間入れ、その後、ホームケージに戻す。
  6. 動物の入れ替え時に、アリーナとオブジェクトを70%エタノールで拭く。次の動物を入れる前に、標準的な実験室の換気条件下でエタノールを約3–5分間自然乾燥させる。
    注意：エタノールは極めて引火性が高い。十分な換気を確保し、火気から遠ざけること。

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図2新規物体認識装置の概略図および実験デザイン。 慣習化の間、2つの同一の物体（AおよびA'）を配置し、′）をアリーナの対角線上の隅に配置する。5時間の保持期間後のテストフェーズにおいて、既知の物体1つを新しい物体（B）に置き換える。空間的なバイアスを最小限に抑えるため、新しい物体の配置位置（左側または右側）を個体間でカウンターバランスさせ、各グループの約半数の個体に対してそれぞれの位置に新しい物体を配置する。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. NORトレーニング（慣らし期間）

  1. 10日目のZT1（規定の明暗サイクルにおいて08:00）に、NORトレーニングを開始します。概日変動を最小限に抑えるため、すべてのコホートでこの開始時間を統一してください。
  2. トレーニングセッション開始の1時間前に、マウスをテスト室に移動させます。アリーナの対角にある隅に、壁から約10 cm離して2つの同一オブジェクト（AおよびA′）を配置します。
  3. 必要に応じて、オブジェクトを床に固定します。
  4. マウスをアリーナの中央に、オブジェクトとは反対方向を向かせて置きます。マウスに10分間、自由に探索させます。
  5. オーバーヘッドビデオトラッキングシステムを用いて行動を記録します。能動的な探索とは、鼻をオブジェクトに向けて距離が2 cm以下であること、オブジェクトを嗅ぐこと、または鼻でオブジェクトに触れることと定義します。
    注：能動的な嗅ぎ動作を伴わずにオブジェクトの上に座ったり登ったりした場合は、オブジェクト探索としてカウントしないでください。
  6. Basler acA1300-60gmオーバーヘッドカメラを備えたEthoVision XTバージョン17.5を使用して、NOR行動を記録しスコア化します。ステップ2.5で定義した基準に従い、各オブジェクトから2 cm以下の範囲に鼻先検出ゾーンを設定し、能動的な探索をスコア化するようにトラッキングソフトウェアを構成します。
  7. 10分間の慣らしセッションの終了後、直ちにマウスをアリーナから取り出します。
  8. 次の動物を導入する前に、アリーナとオブジェクトを70%エタノールで十分に洗浄します。

3. 穏やかなハンドリングによる睡眠剥奪

  1. 10日目のトレーニングセッションの前に、各動物に固有の識別コードを割り当ててください。行動記録および組織採取の間、この識別コードを維持してください。
  2. ExcelのRAND関数を用いて生成した乱数に基づき、動物をSD群とNSD群に1:1の比率で割り当てる。
  3. NORトレーニングの直後に、NSDマウスをホームケージに戻し、5時間安静にさせる。SD動物およびNSD動物は、同一の概日リズムの時間枠内において、一致した環境条件下で飼育・管理すること。
  4. NORトレーニングの直後に、SDマウスに対してGH睡眠剥奪を開始する。ホームケージ内で5時間連続して覚醒状態を維持させる。
  5. 動物を継続的に観察する。マウスが体を丸める、目を閉じる、あるいは持続的に不動状態になるといった睡眠関連の姿勢をとった場合に介入する。
  6. ケージを軽く叩くことから始め、段階的に刺激を与えます。必要に応じて、床材を軽くかき混ぜるか、紙管などの清潔で新しい物体を導入するか、あるいはソフトブラシで動物に軽く触れてください。
  7. 物理的な拘束、強制的な移動、および嫌悪刺激や疼痛刺激を避けてください。
  8. 介入ログへの記入を完了してください 表1 5時間のGH期間中、ケージごとに記録を行う。1時間あたりの介入のおおよその回数、主要な介入の種類、およびプロトコルからの逸脱やウェルフェア上の懸念事項を記録すること。
  9. コホート間で同一の介入ログテンプレートを使用してください。
    注意：身体的拘束、強制的な運動、または痛み刺激は、それ自体が記憶、ストレス、および炎症の結果に影響を及ぼす可能性があるため、使用しないでください。
ケージ/コホートIDH1H2H3H4H5主要な介入形態逸脱または福祉観察
レコードIDH1数を記録するH2数を記録するH3数を記録するH4数を記録するH5数を記録するタッピング / 床材 / 新規物体 / ソフトブラシ存在する場合に記録する

表1：低ストレスハンドリング介入ログテンプレート。 ケージまたはコホートID、5時間の睡眠剥奪期間（H1–H5）の各時間における低ストレスハンドリング介入回数、主要な介入タイプ、およびプロトコルの逸脱や福祉上の観察事項を記録する。

4. NORテスト相

  1. NORトレーニング完了から正確に5時間後に、5時間の固定保持間隔を維持するため、NORテスト相を開始する。
  2. アリーナに既知の物体（A）1つと新規の物体（B）1つを配置する。
  3. 新規物体の位置を左右交互に配置することで、各群の約半数の個体が左側に、残りの半数が右側に新規物体が配置されるように個体間でカウンターバランスをとる。
  4. マウスをアリーナの中央に置く。マウスに5分間自由に探索させる。
  5. 慣らしに使用したのと同じオーバーヘッドビデオトラッキングシステムを用いてセッションを記録する。ステップ2.5で規定した探索の定義を適用する。
  6. 個体ごとに、アリーナと物体を70%エタノールで洗浄する。

5. 同一コホートの組織採取および海馬の解剖

  1. NORテストの直後に、組織採取を行う個体を、行動テストを行った個体と照合して特定します。
  2. 麻酔剤が炎症およびリン酸化依存性バイオマーカーに及ぼす潜在的な攪乱影響を避けるため、承認された動物実験プロトコルに従い、麻酔なしの断頭により動物を安楽死させます。安楽死後、直ちに脳組織を採取します。
  3. 各分子試料がその個体のNOR結果に直接紐付けられたままとなるよう、すべてのサンプルチューブおよび記録に、動物固有の行動記録IDを記載します。
  4. 速やかに脳を摘出し、滅菌済みの氷冷した解剖面に置きます。
  5. 正中矢状断により左右の半球を分離します。冷却したマイクロスパチュラを用いて、各半球から海馬を摘出します。
  6. 摘出した海馬を液体窒素で急速凍結させます。分析までサンプルを−80°Cで保存します。
    注意：液体窒素は深刻な低温火傷を引き起こす可能性があります。適切な低温用個人保護具を着用してください。

6. 海馬バイオマーカーの定量

  1. 氷冷したRIPA溶解バッファーに、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを、1×の最終濃度（100×ストック溶液を溶解バッファー1 mLあたり10 µL）で添加する。
  2. 氷冷したRIPA溶解バッファーを用い、組織とバッファーの比率を1:10（w/v）として海馬組織をホモジナイズする（組織1 mgあたり溶解バッファー10 µL）。海馬組織の質量が片側あたり約25–30 mgの場合、片側あたり約250–300 µLの溶解バッファーを使用し、両側合わせて約50–60 mgの場合は約500–600 µLを使用する。
  3. RIPAホモジネートを4°Cで14,000 × g、15分間遠心分離し、上清を回収する。この上清を全タンパク質定量および3種類のサイトカインELISAに使用する。
    注：SOD、GPx、およびMDAアッセイでは、酵素活性を保持するため、製造元の推奨に従い、キット専用のホモジナイズバッファーを使用すること。
  4. SOD、GPx、およびMDAの測定用に、RIPA溶解バッファーではなく対応するキット専用のホモジナイズバッファーを用い、組織とバッファーの比率を1:9として、別途10%（w/v）の海馬ホモジネートを調製する。
  5. BCAタンパク質定量法を用いて全タンパク質濃度を決定する。
  6. 材料表（Table of Materials）に記載されている標的特異的なELISAまたは生化学的アッセイキットを用いて、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GPx、およびMDAを定量する。各アッセイについて、製造元の説明書に従うこと。
  7. 対応するアッセイバッファーで標準品を調製する。吸光度値が標準曲線の直線範囲内に収まるようにサンプルを希釈する。
  8. サイトカインELISAに使用する海馬サンプルは、対応するアッセイ希釈液で約1:5に希釈する。吸光度値が標準曲線の直線範囲内に収まるよう、必要に応じて1:2–1:10の範囲で希釈倍率を調整する。
  9. ステップ6.4で調製した10%（w/v）海馬ホモジネートの上清を、SOD、GPx、およびMDAアッセイに直接使用する。これら3つのアッセイには、ステップ6.8に記載したサイトカインELISAの希釈スキームを適用しない。
  10. IL-1β、IL-6、およびTNF-αのELISAでは、標準品または適切に希釈した海馬サンプルを1ウェルあたり100 µLずつ2連（duplicate）で加え、37°Cで90分間インキュベートする。その後、ビオチン化検出抗体を100 µL加え、37°Cで60分間インキュベートする。
  11. 各サイトカインELISAウェルにHRPコンジュゲートを100 µL加え、37°Cで30分間インキュベートする。TMB基質を用いて37°C、暗所で約15分間発色させる。
  12. SODアッセイでは、海馬ホモジネート上清20 µLを、酵素ワーキングソリューション20 µLおよび基質溶液200 µLと混合する。37°Cで20分間インキュベートし、450 nmで吸光度を測定する。
  13. GPxアッセイでは、海馬ホモジネート上清200 µLをGSH含有反応混合液と合わせ、37°Cで5分間インキュベートする。反応を停止させ、混合液を4°Cで3,500 × g、10分間遠心分離する。上清を約15分間発色させ、反応上清200 µLを用いて412 nmで吸光度を測定する。
  14. MDAアッセイでは、海馬ホモジネート上清100 µLをMDAワーキング試薬1.0 mLと混合し、95°Cの恒温水槽で40分間インキュベートする。混合液を冷却し、遠心分離する。上清約250 µLをマイクロプレートに移し、532 nmで吸光度を測定する。
  15. サイトカインELISAでは、キットで指定された波長（通常は450 nm）で吸光度を読み取る。参照波長補正が利用可能な場合はそれを用いる。
  16. 4パラメータロジスティック回帰などの適切なモデルを用いて標準曲線を作成する。各バイオマーカーの測定値を全タンパク質含量で標準化する。
  17. 選択したキットとの互換性に応じて、サイトカイン濃度をpg/mg protein、抗酸化酵素活性をU/mg protein、MDAをnmol/mg proteinとして報告する。

7. データ解析および品質管理

  1. NORテストフェーズにおける、既知物体への探索時間（Tfamiliar）および新規物体への探索時間（Tnovel）を抽出する。
  2. 識別指数（DI）を次のように算出する：
    figure-protocol-2。
    注：DIが0.5を上回る場合は、新規物体への嗜好性を示す。
  3. 総物体探索時間（Tnovel + Tfamiliar）が10 s未満の動物は、NOR解析から除外する。この基準はグループレベルの解析前に適用し、すべての除外例を報告すること。
  4. Shapiro–Wilk検定を用いて各グループの正規性を、Levene検定を用いて分散の均一性を評価する。各グループについて、両側1標本t検定を用いてDIをチャンスレベルの0.5と比較して評価する。正規性の仮定が満たされない場合は、代わりに0.5に対する1標本Wilcoxon符号付き順位検定を用いる。
  5. 特に指定のない限り、すべての統計検定のα値を0.05に設定する。
  6. 正規性と分散均一性の仮定が満たされる場合は、両側独立t検定を用いて、独立したNSD群とSD群の間でDIを比較する。それ以外の場合は、Mann–Whitney U検定を用いる。
  7. グループおよび物体タイプを要因として、二元配置反復測定分散分析を用いて、既知物体に対する探索時間と新規物体に対する探索時間を解析する。Sidak補正を用いたペアごとのポストホック比較を行い、すべてのグループ間比較の推定値とともに95%信頼区間を報告する。
  8. 正規性と分散均一性の仮定が満たされる場合は、両側独立t検定を用いて、独立したNSD群とSD群の間で各海馬バイオマーカーを比較する。それ以外の場合は、Mann–Whitney U検定を用いる。
  9. 同一コホートから複数のバイオマーカーを評価する場合、Benjamini–Hochberg法を用いてバイオマーカーパネル全体の偽発見率（FDR）を制御する。名目p値とFDR調整後p値の両方を報告すること。
  10. NOR識別指数を主要アウトカムとして、G*Power version 3.1を用いて両側独立標本比較のa prioriパワー分析を行う。期待される効果量は、学習後の睡眠剥奪による新規物体嗜好性の顕著な低下を示した既報の研究に基づく。
  11. 標準化効果量 Cohen’s d = 1.35、両側α = 0.05、検出力 80%、割り付け比 1:1としてa prioriパワー分析を行う。これらのパラメータから、算出された最小サンプルサイズは1グループあたり10匹となる。
    注：効果量は、既報の物体認識データ9から推定した。Palchykovaらは、訓練直後に睡眠剥奪を施したマウスと時間整合コントロール群（各群 n = 9）を比較し、テストフェーズにおける新規物体探索時間に有意なグループ効果（F(1,16) = 8.26, p < 0.007）を報告しており、これは Cohen’s d ≈ 1.36 に相当する。したがって、a prioriパワー分析には標準化効果量 d = 1.35 を採用した。
  12. あらかじめ規定した行動学的または技術的な除外を考慮し、計画サンプルサイズを20%増やして1グループあたり12匹（計24匹）とする。NORテスト中の総物体探索時間 <10 s、福祉関連の除外、使用不可能なビデオ録画、および組織・サンプルアッセイの技術的失敗を除外基準として事前に規定する。
  13. 観察された処置効果の方向性または大きさに基づいて動物を除外してはならない。
  14. 統計解析には、Python version 3.12を使用し、仮説検定と効果量算出には SciPy version 1.17、Benjamini–Hochberg偽発見率補正には statsmodels version 0.14 を使用する。
  15. 本プロトコルを用いて正式なデータセットを作成する場合、ステップ7.4〜7.9で指定したすべての統計検定について、p値とともに効果量（例：グループ比較のための Cohen's d）を報告すること。

結果

本プロトコルを適切に実施すれば、個々の読み取り値を単独で解釈することなく、一貫した行動・分子的な結果パターンが得られるはずです。完全な実験シーケンスを図1に、NOR装置および実験デザインを図2に示します。NSD群では、マウスは新しい物体に対して明確な好みをもち、それは0.5のチャンスレベルを上回るDIに反映されるはずです。トレーニング後5時間のGHプロトコルに曝露したマウスでは、新奇物体への好みが減弱し、NSDコントロール群よりも低いDIを示すはずです。総物体探索時間は群間で同等である必要があります。探索行動が全体的に減少している場合は、選択的な認識記憶の欠損ではなく、運動機能、不安、または手順上の混絡要因が示唆されます。本コホート（NSD、n = 12；SD、n = 12。そのうち1匹はステップ7.3で予め規定した総探索しきい値に従って除外されたため、NOR解析にはn = 11を使用。この除外は、以下に報告する識別指数および総探索時間の解析の両方に一貫して適用した）において、NSDマウスは平均DI 0.70 ± 0.05（平均 ± SD）を示し、これは0.5のチャンスレベルを有意に上回っていました（一標本t検定、t(11) = 15.21, p < 0.0001）。一方、SDマウスは平均DI 0.51 ± 0.05を示し、チャンスレベルと有意な差はありませんでした（t(10) = 0.49, p = 0.638）。DIは群間で有意に異なっていました（非対応t検定、t(21) = 9.28, p < 0.0001; Cohen's d = 3.87; 平均差 = 0.19, 95% CI [0.15, 0.23]）(図3A)。総探索時間は群間で有意な差はなく（NSD: 33.5 ± 8.7 s; SD: 29.9 ± 6.2 s; t(21) = 1.13, p = 0.272）(図3B)、これは探索行動の全般的な減少ではなく、認識記憶への選択的な影響と一致しています。

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図3新規物体認識能。 (A) NSDに対する識別指数（DI）(n = 12) および標準偏差（SD（n = 11；事前設定された総探索時間の閾値に基づき、1匹の個体を除外した）群。破線は確率0.5のレベルを示す。(B) テストフェーズにおけるNSD（n = 12) および標準偏差（SD（n = 11。パネルAと同様の除外基準を適用したグループ。バーは平均値を表す。 ± SEM。白抜き円は個々の動物を示す。****p < 0.0001; ns, 有意差なし（両側アンペアード） t-試験）。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

介入ログ（表1GH（一般的に家庭的な状態）が、拘束や強制的な移動ではなく、軽度で段階的な感覚介入によって維持されていたことを示す必要があります。コホート間で1時間あたりの介入回数に大きな差がある場合は、行動の差異を解釈する前に、ケージの状態、観察者の整合性、およびハンドリングの手技を確認してください。本研究で記録された12のコホートにおいて、5時間のGHウィンドウ中の1時間あたりの介入回数は1回から6回の範囲であり、主にケージへのタッピングや床材の乱しによるものでした。ソフトブラシや新規物体を用いた介入の頻度は低く、物理的な拘束や強制的な移動を必要としたケージはなく、福祉上の逸脱も観察されませんでした。

同一個体から採取した生化学的指標は、行動表現型の分子的な背景を提供するものである。成功したSDモデルでは、対照となるNSD群と比較して、海馬におけるプロ炎症性サイトカイン負荷の増加、抗酸化酵素活性の低下、および脂質過酸化マーカーの上昇という協調的なパターンが示されることが期待される。各組織サンプルを対応するNOR記録に紐付けることで、行動試験用と生化学分析用で個体群を分けた場合に生じるバッチ変動を避けつつ、個体レベルで行動と分子の整合性を評価することが可能となる。本コホート（NSD群 n = 12、SD群 n = 12）において、海馬の6つのバイオマーカーすべてが予測された方向に群間で有意に異なっており、6つのマーカーパネル全体でBenjamini–Hochberg FDR補正を行った後も、すべて有意であった：IL-1β (NSD 43.4) ± 7.5 ± SD 58.6 ± 5.3 pg/mg タンパク質； t(22) = −5.73, 公称値 p < 0.0001, FDR補正済み p < 0.0001, d = −2.34), IL-6 (57.8 ± 8.1 vs. 71.8 ± 7.4 pg/mg； t(22) = −4.42、公称値 p = 0.0002（FDR補正済み） p = 0.0002, d = −1.81)、TNF-α (40.5 ± 7.8 対 55.1 ± 7.8 pg/mg; t(22) = −4.60、公称値 p = 0.0001、FDR補正済み p = 0.0002, d = −1.88)、SOD (18.0 ± 2.0 対 14.0 ± 1.8 U/mg; t(22) = 5.16, 公称値 p < 0.0001, FDR補正済み p < 0.0001, d = 2.11)、GPx (13.2 ± 0.9 対 10.8 ± 1.4 U/mg； t(22) = 4.92, 公称値 p < 0.0001、FDR補正済み p < 0.0001, d = 2.01)、およびMDA (3.5 ± 0.3 対 4.9 ± 0.8 nmol/mg； t(22) = −5.59、公称値 p < 0.0001, FDR補正済み p < 0.0001, d = −2.28)。これらのデータは、以下に示されている。 図4に示されている個々のデータポイントは 図 3 および 図4 これらが本コホートで得られた実際の実験測定値であり、報告されたすべての平均値、効果量、p値、および信頼区間は、これら同一の基礎データから直接算出されたものである。

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図4NSDマウスおよびSDマウスにおける海馬バイオマーカー。 海馬におけるIL-1レベルβ、IL-6、およびTNF-αα NSDマウス（n = 12）およびSDマウス（n = 12）における（前炎症性サイトカイン）、SODおよびGPx（抗酸化酵素）、ならびにMDA（脂質過酸化マーカー）。棒グラフは平均値を示す ± SEM（標準誤差）。白抜き円は個々の動物を示す。有意性マーカーは、6つのマーカーパネル全体におけるBenjamini–Hochberg法でFDR調整されたp値を反映している。***p < 0.001 および ****p < FDR補正後 0.0001（両側非対応t検定）。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

NSDマウスが新規物体への好みを全く示さない場合、総探索時間が事前定義した閾値を下回った場合、あるいはバイオマーカーの分散が予想以上に大きい場合は、Table 2にまとめられている通り、コホートを繰り返す前に、馴化、物体の選択、介入の整合性、サンプルの識別、および組織処理のタイミングについてトラブルシューティングを行ってください。これらの結果は、解釈を行う前にトラブルシューティングを必要とする不適切な実験結果であると考えられます。今回のコホートでは、あらかじめ規定した総探索時間の閾値（8.7 s; Step 7.3）に基づき、1匹のSD動物（M19）がNOR解析から除外されました。これは本基準によって対処される不適切な結果の一例です。なお、本データセットにおいて、新規物体への好みを全く示さなかったNSD動物はなく、またコホートの繰り返しを必要とするほど予期せず大きなバイオマーカー分散を示したコホートもありませんでした。

問題考えられる原因溶液
NORにおける全体的な探索行動の低下不十分な馴化、高い不安レベル、または過度な環境的攪乱毎日のハンドリング時間を延長し、試験室が静穏で薄暗いことを確認してください。また、トレーニングの前にアリーナへの馴化を確認してください。
NSDコントロール群における新規物体嗜好性の消失対象に先天的な好みの差があるか、あるいは対象間の区別が不十分であるナイーブ動物を用いて対象物の事前スクリーニングを行い、サイズとアクセスしやすさが同等で、テクスチャーや形状が明らかに異なる対象物を使用すること。
GH介入回数の大きなばらつき観察者の閾値またはケージ条件の不一致同一の覚醒基準を用いて観察者をトレーニングし、同一の介入ログを使用し、敷材、ケージ内のエンリッチメント、および環境条件を標準化してください。
バイオマーカー測定における高い変動性解剖の遅延、サンプル識別情報の不一致、またはサンプルの分解行動とサンプルのIDを一致させて維持すること。解剖のタイミングを標準化すること。速やかに急速凍結させること。ホモジナイズ中はサンプルを氷上で保持すること。
SDマウスに顕著な苦痛が見られる過度な激しい操作緩やかな感覚介入のみを用い、苦痛が観察された場合は直ちに中断し、承認されたアニマルウェルフェアの手順に従ってください。

表 2：トラブルシューティング。NOR、低負荷睡眠剥奪、および海馬バイオマーカーのワークフローで発生しやすい一般的な問題と、その考えられる原因および推奨される解決策。

ディスカッション

本記事では、急性の睡眠剥奪によって誘発される認識記憶欠損および海馬の分子レベルの変化を研究するための、迅速かつ再現可能なフレームワークを提供する。標準化された10分間の学習フェーズの直後に5時間の穏やかなハンドリングを行うことで、本手順は定義された学習後の固定化ウィンドウを標的としており、長期的な剥奪モデルや強制運動に基づく手順に伴う身体的負荷を軽減するように設計されている4,5。ただし、本投稿には、後述のメソッドの制限で議論するように、生理的なストレス反応の低下を確認するための直接的なストレスホルモン測定は含まれていない。

最も重要な技術的要因は、馴化、一貫した物体の選択、5 hの保持間隔の固定、およびGH中の継続的かつ非嫌悪的なモニタリングである。NORは自発的な探索に依存するため、残留不安やアリーナへの馴化不足は、物体の探索を抑制し、記憶に関連する効果を不明瞭にする可能性がある8。あらかじめ規定された探索時間の除外基準と介入ログは、行動アッセイの失敗と真の記憶表現型を区別するのに役立つ実用的な品質管理手段となる。全体の探索量が少ない場合、NSDコントロール群で新奇物体への嗜好性が見られない場合、GH介入回数に大幅なばらつきがある場合、バイオマーカーの測定値に高い変動性が見られる場合、またはSDマウスに顕著な苦痛が見られる場合、研究者は実験を繰り返すか解釈する前に、Table 2の対応するトラブルシューティング手順を確認する必要がある。

本プロトコルの増分的な寄与は、単に既知の技術を連結させたことではなく、技術の利用可能性ではなく再現性に対処することを目的とした4つの具体的な運用要素にある。第一に、必須の介入ログ（Protocol ステップ 3 および Table 1）により、コホート間および研究間でGH強度を標準化するための、定量可能で比較可能な記録が導入される。この手法自体には確立された歴史があるが、本プロトコルではその実施における運用の標準化を強調している。これは、全睡眠剥奪法としてのGHの確立された歴史と、先行研究においてその実施の標準化が不足していたという指摘6と一致する。第二に、本プロトコルでは同一コホート設計を強制しており、10日間の単一パイプライン内で、個別に追跡された同一の動物から行動学的および分子生物学的エンドポイントを収集する。この設計は、別々のコホートで行動学的および生化学的エンドポイントを収集することに伴うばらつきを低減することを目的としている。第三に、本プロトコルではトレーニングおよび剥奪ウィンドウを定義されたサーカディアンアンカー（ZT1、Protocol ステップ 2）に固定し、NSDおよびSDコホートを一致した明期条件下で維持することを要求しており（Protocol ステップ 3）、これによりワークフロー内のサーカディアンタイミングを制御している。第四に、本プロトコルでは、最小探索時間の閾値（Protocol ステップ 7）、透明性のある除外報告、前向きなパワープランニング、0.5の偶然レベルに対するDIの検定、前提条件の検定、複数のバイオマーカー比較に対する補正、および効果量の報告を含む、事前の品質管理および分析基準を指定している。これらの要素を合わせることで、個別に確立された手法を明示的かつ転移可能なワークフローへと変換している。これは、特定の生物学的知見の報告としてではなく、独立した採用と再現を前提として、個々の研究室が自らの実施方法をベンチマークするための参照フレームワークの候補として提案されるものである。

本ワークフローにはいくつかの限界がある。GHは労働集約的であり、実験者の継続的な注意が必要であるため、スループットが制限される。また、GHは覚醒を維持させるが、それ自体で睡眠構造を定量化することはできない。今後の応用では、ワークフローを完全な実験コホートに適用する前に、パイロット的なEEG/EMG検証を取り入れ、覚醒状態を記録し、GH処置によって誘発される睡眠不足の程度を検証することが考えられる。また、介入によるストレス関連の影響を評価するために、コルチコステロン測定を組み込むことも考えられる。これらの測定は本プロトコルの範囲外であり、したがって本研究で実施された検証として解釈されるべきではない。NORは認識記憶に敏感であるが、空間ナビゲーションやワーキングメモリを包括的に評価するものではない。より広範な認知プロファイルが必要な場合は、Y迷路やバーンズ迷路、あるいはその他のシングルトライアルタスクなどの補完的なアッセイを追加することができる。改良型マルチプラットフォーム法は、実験的に睡眠不足を誘発するための代替アプローチであり、睡眠不足とその回復の定量化に使用されてきた4。対照的に、本GHワークフローは、強制的な移動を伴わない軽微な感覚介入を重視している。しかし、本プロトコルでは生理学的ストレスマーカーを直接測定していないため、GHが生理学的ストレス反応を低減させるという結論を導き出すことはできない。

したがって、本手法は睡眠不足によるあらゆる認知上の影響を完全にモデル化したものというよりも、標準化されたエントリープラットフォームとして捉えるのが最適である。本手法の価値は、制御された学習後のGH介入、強制移動パラダイムと比較して物理的なハンドリングを最小限に抑えるよう設計された行動読み出し、同一個体からの海馬採取、および透明性の高い品質管理との間の明確な連携にある。NORは、認識記憶を評価するための確立されたシングルトライアルアプローチを提供し7,8、睡眠剥奪は、物体認識の障害9、海馬の神経炎症性変化10、および海馬の酸化ストレスと記憶欠損11に関連することが以前に報告されている。したがって、この枠組みはコホート間の比較を容易にし、睡眠剥奪に関連する認知機能障害を軽減することを目的とした介入のスクリーニングやメカニズム研究のための実用的な基盤を提供できる。また、先行研究では、睡眠剥奪に関連する認知機能障害および神経炎症を標的とした介入についても調査されている12。この範囲に基づき、本投稿ではプロトコルの性能を示す代表的なデータを提供しつつ、再現可能なワークフローの確立と標準化に焦点を当てる。より包括的なデータセットおよび広範な生物学的解釈については、今後の研究で別途報告される可能性がある。

開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、南京鼓楼医院青年培養基金、中国国家自然科学基金（助成番号 82502706）、および江苏省基礎研究プログラム（助成番号 BK20250258）の支援を受けて行われました。原稿の作成および改訂にあたり、テキストの下書きと推敲、ならびに概略図の作成と修正を含むAI支援ツールが使用されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70% ethanolAny supplierN/ACleaning of NOR arena and objects
Adult male C57BL/6J mice (8–12 weeks)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.N/AExperimental animals
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Total protein determination and normalization
Behavior-analysis softwareNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT version 17.5NOR exploration scoring and analysis
Centrifuge capable of 14,000 × g at 4 °CEppendorfCentrifuge 5424 R; Cat. 5404000610Clarification of hippocampal homogenates
Clean paper tubesAny supplierN/AGentle-handling intervention
Cryogenic personal protective equipmentAny supplierN/ASafe handling of liquid nitrogen
Glutathione Peroxidase Assay KitAbcamab102530GPx quantification
Hippocampal tissue homogenizerIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Cat. 0003737000Homogenization of hippocampal tissue in lysis buffer
Liquid nitrogenAny supplierN/ASnap-freezing of dissected hippocampi
MDA Assay KitSigma-AldrichMAK085MDA quantification
Microplate readerAgilent Technologies / BioTekBioTek Epoch 2 Microplate SpectrophotometerAbsorbance measurement at kit-specified wavelengths
Micro-spatulasAny supplierN/AHippocampal dissection; used chilled
Mouse IL-1β ELISA KitR&D SystemsMLB00CIL-1β quantification
Mouse IL-6 ELISA KitR&D SystemsM6000BIL-6 quantification
Mouse TNF-α ELISA KitR&D SystemsMTA00BTNF-α quantification
Object sets A/A′ and BAny supplierN/ANOR familiarization and test phases
Opaque NOR arena (40 cm × 40 cm × 40 cm)Any supplierN/ABehavioral testing
Overhead video-recording systemBasler AGacA1300-60gmVideo recording of NOR familiarization and test sessions
Protease/Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440Added to lysis buffer at 1× working concentration (10 µL/mL from a 100× stock)
RIPA Lysis BufferThermo Fisher Scientific89900Hippocampal tissue homogenization
Sample tubes suitable for cryogenic storageThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1.8 mL; Cat. 375418Maintenance of animal-specific sample IDs and storage of dissected hippocampal tissue
Soft brushAny supplierN/AGentle-handling intervention
SOD Assay KitSigma-Aldrich19160SOD quantification
Statistical and power-analysis softwareG*Power; Python Software FoundationG*Power version 3.1; Python version 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)A priori power analysis and statistical analyses described in Protocol Section 7
Standard rodent chowJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Irradiated Rat/Mouse Maintenance Diet; XTI01WC-010Ad libitum animal feeding
−80 °C freezerHaier BiomedicalDW-86L626Long-term storage of snap-frozen hippocampal tissue

参考文献

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