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方法論記事

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製のための最適化プロトコル

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DOI:

10.3791/73561

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2026年9月3日

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、ヒト人工多能性幹細胞を用いて血管オルガノイドを作製する方法を紹介します。

要約

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）由来の血管オルガノイドは、血管の発達、疾患メカニズム、および薬物反応を研究するための強力な三次元モデルとして登場しました。現在の血管オルガノイド作製プロトコルでは、自己組織化する内皮細胞-ペリサイトネットワークの生成が可能ですが、バッチ間のばらつき、不均一なオルガノイド形成、および不十分なペリサイトの被覆が、再現性とスケーラビリティを損なう可能性があります。本研究では、再現性と構造的一貫性を向上させた、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からの血管オルガノイド生成のための最適化プロトコルを提示します。主な変更点には、胚様体形成条件の精緻化、中胚葉誘導および血管分化時における増殖因子の濃度とタイミングの最適化、ならびに堅牢なペリサイトの動員と内皮細胞-ペリサイト相互作用を促進する三次元培養条件の改善が含まれます。最適化されたオルガノイドは、PDGFR-β陽性ペリサイトによって一貫して包囲された、高度に分岐したCD31陽性内皮ネットワークを示し、元のプロトコルと比較してバッチ間のばらつきが大幅に減少しています。オルガノイドの生成、ホールマウント免疫蛍光染色による特性解析、および品質管理評価の詳細なステップバイステップの手順を提供します。この最適化された手法により、血管細胞の相互作用の研究、疾患モデルの構築、および化合物のスクリーニングに適した高品質な血管オルガノイドのスケールアップ生産が可能となり、このモデルシステムの導入を検討している研究室にとっての技術的ハードルが低くなります。

概要

3次元（3D）オルガノイドは、従来の2次元細胞培養モデルと比較して優れた構造的バイオミミクリー（生体模倣）と病態生理学的関連性を備えており、ヒトの器官形成や疾患をin vitroでモデル化するための強力なツールとして台頭しています1,2。近年、ヒト多能性幹細胞（hPSC）由来のオルガノイドが、腸3、脳4,5、腎臓6、肝臓7,8、および網膜9を含む複数の組織型において構築されています。しかし、オルガノイドを用いた研究における大きな課題は、長期培養中の血管新生が不十分なことであり、これが低酸素状態や壊死を引き起こし、オルガノイドの拡大と分化を妨げる要因となります10,11。この制限を克服するため、血管ネットワークの形成を促進させる内皮細胞や間葉系幹細胞を組み込むなど、さまざまな共培養戦略が導入されてきました12,13。しかし、従来の2次元培養や動物モデルではヒトの血管生物学を完全に再現することはできず、一方で共培養アプローチは実験的な複雑さを増大させます14。したがって、自律的に血管新生が可能な血管オルガノイドは、ヒトへの適合性が高い有望な代替手段となります15。

血管ネットワークの形成には、血管新生（Vasculogenesis）と血管新生（Angiogenesis）の両方が関与しており、これらは血管内皮細胞と、ペリサイトや血管平滑筋細胞などの壁細胞との相互作用を通じて調整され、VEGF（血管内皮増殖因子）、TGF-β（変換増殖因子-β）、PDGF（血小板由来増殖因子）、およびアンジオポエチンを含む複数のシグナル分子によって厳密に制御されています16。2019年、Wimmerらは、hPSCから直接自己組織化する3D血管オルガノイドを生成する方法を確立しました17,18。このシステムでは、血管内皮細胞とペリサイトが同時に生成され、管腔形成と基底膜被覆を伴う微小血管ネットワークが形成されます。このプラットフォームに基づき、高グルコースおよび炎症性サイトカイン（TNF-αおよびIL-6）刺激下での糖尿病性血管症のモデルとして血管オルガノイドが利用されており、これらのオルガノイドは糖尿病微小血管病変の特徴である基底膜の肥厚を再現しています17。さらに、このモデルは遺伝性血管疾患の研究や、血管毒性スクリーニングのプラットフォームとしても利用されています19。より最近では、いくつかの手法研究において血管オルガノイド生成の最適化が試みられています。例えば、シングルセルRNAシーケンシングの進展により、MECOMやLEF1などの主要な調節因子が特定され、ヒト血管オルガノイド形成を特性評価および最適化するための分子的な枠組みが提供されました。また、Xuらは、均一な胚様体形成を促進するためにマイクロウェルを導入し、細胞生存率を向上させるためにCEPTカクテルを組み込むことで、バッチ間のばらつきを効果的に減少させました20。

血管オルガノイド作製の均質性、再現性、およびスループットを向上させるため、Wimmerら17,18によって記述された元のプロトコルを、いくつかの主要な制限に対処するために体系的に最適化した。第一に、元のプロトコルでは、胚様体形成のために低接着プレートを用いた自然凝集を採用しており、これが凝集体のサイズに大きなバッチ間変動をもたらし、結果として分化効率の不均一性を招く可能性がある。最適化されたプロトコルでは、凝集体形成中にポリビニルアルコール（PVA）とオービタルシェーキングを組み合わせることで、均一な細胞凝集を促進し、胚様体サイズの整合性を向上させている。第二に、元のプロトコルでは、血管ネットワーク形成段階において培地を完全に交換しているが、これにより成長因子の濃度に大幅な変動が生じ、持続的な血管出芽やペリサイトの動員が損なわれる可能性がある。対照的に、最適化されたプロトコルでは、各培地交換時に条件付け培地の3分の1を保持することで、内因性の血管新生促進因子を維持し、培養環境を安定させている。第三に、元のプロトコルでは、オルガノイドの単離と成熟の間に複数回のプレート移替が必要であり、ハンドリングの負担が増え、オルガノイドを喪失するリスクが高まる。最適化されたプロトコルでは、単離したオルガノイドを96ウェル低接着プレートの各ウェルに個別に移送することでこれらのステップを省略し、手順を簡略化してスループットを向上させている。総合的に、この最適化されたプロトコルは、詳細なステップバイステップの手順と重要な品質管理チェックポイントを提供することで、このモデルシステムの導入における技術的な障壁を下げ、血管発達、疾患メカニズム、およびハイスループット薬物スクリーニングの研究における血管オルガノイドのより幅広い応用を促進するものである。

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プロトコル

本研究におけるhPSCsの使用は、安徽大学生物医学倫理委員会（BECAHU_2026-010）によって承認されました。

1. ヒト人工多能性幹細胞の維持管理

注：ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）をフィーダーフリー条件下で維持してください。すべての操作は、クラスII生物学的安全キャビネット内で無菌操作を用いて行ってください。

  1. 基底膜マトリックスコート培養プレートの調製
    1. −20 °Cから基底膜マトリックスのバイアルを取り出し、4 °Cで一晩（約12–16時間）解凍する。凍結・融解の繰り返しは避けること。
    2. 解凍した基底膜マトリックスを無菌条件下で十分に混合し、使い切り量ずつ分注する（例：1本あたり1 mL）。分注したアリコートは−20 °Cで最大2年間保存する。
      注：早期凝固を防ぐため、取り扱い中は基底膜マトリックス、ピペット、チップ、チューブを冷やしておく。気泡が入らないように注意する。
    3. 必要な基底膜マトリックスのアリコートを氷上で解凍する。基底膜マトリックスを、あらかじめ冷やしたDMEMで1:200に希釈する（DMEM 1 mLあたり5 µLの基底膜マトリックスを用い、最終濃度を約5 µg/mLとする）。
    4. 目に見える粒子がなくなるまで、ピペッティングで溶液を穏やかに混ぜる。
    5. 12ウェルプレートの各ウェルに、希釈した基底膜マトリックスを0.5 mLずつ加える。プレートをゆっくりと傾け、回転させて底面全体をコートする。
    6. コートしたプレートを、5% CO₂インキュベーター内で37 °Cで少なくとも2時間、または4 °Cで一晩インキュベートする。
      注：密閉したコート済みプレートは4 °Cで1–2週間保存可能である。使用直前にプレートを室温に戻し、コート溶液を吸引除去する。
  2. hiPSCの解凍
    1. 凍結hiPSCのクライオバイアルを液体窒素から取り出し、直ちに37 °Cのウォーターバスに入れる。バイアルを軽く揺らし、少量の氷結晶が残っている状態（1分以内）で取り出す。
      注：37 °Cでのジメチルスルホキシド（DMSO）への長時間曝露や不完全な解凍は、いずれも細胞生存率を低下させるため避けること。
    2. クライオバイアルの外側を70%エタノールで消毒し、生物安全キャビネット内で開封する。
    3. あらかじめ加温した化学的に定義されたhPSC維持培地、または同等の化学的に定義された維持培地3 mLを含む15 mLコニカルチューブに、細胞懸濁液をゆっくりと滴下して移す。転移中に穏やかに混ぜることで、DMSOを徐々に希釈し、浸透圧ストレスを最小限に抑える。
    4. スイングローターを用い、室温（22–24 °C）で300 × g、3分間遠心分離する。
    5. 細胞ペレットを乱さないように、上清を慎重に吸引除去する。ペレットをあらかじめ加温した化学的に定義されたhPSC維持培地1 mLで穏やかに再懸濁する。
      注：機械的せん断と気泡の形成を最小限にするため、P1000ピペットを用い、2–3回穏やかにピペッティングする。
  3. hiPSCの播種および培養
    1. プリコートした12ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、コート溶液を吸引除去する。ウェルは洗浄しない。
    2. 解凍後の通常の回復のため、1ウェルあたり約1 × 105–2 × 105個の生存細胞を播種する。hiPSCのラインや実験上の必要に応じて密度を調整する。
    3. ピペットチップでコート面を触れないように、各ウェルの壁に沿って細胞懸濁液をゆっくりと分注する。
    4. 解凍後の細胞の生存と接着を促進するため、最終濃度が5 µMとなるようにY-27632を加える。
      注：Y-27632は最初の播種培地のみに使用する。翌日には、Y-27632を含まない化学的に定義されたhPSC維持培地に交換する。
    5. 細胞を37 °C、5% CO₂、飽和湿度でインキュベートする。
    6. 約16–24時間後に細胞の接着と形態を確認する。培地を吸引除去し、Y-27632を含まない、あらかじめ加温した新鮮な化学的に定義されたhPSC維持培地と交換する。
    7. 継代または分化のために細胞が約70%–80%のコンフルエンシーに達するまで、毎日または1日おきに培地を交換する。
      注：毎日培養状態を確認する。境界が明確でコンパクトなコロニーであり、核細胞質比が高く、自発的分化が最小限であるものを使用する。

2. hiPSC凝集体の作製および分化

注：hiPSCsは、基底膜マトリックスでコーティングしたプレート上の化学的に定義されたhPSC維持培地を用い、フィーダーフリー条件下で維持すること。0.02% EDTAを用いて4〜5日ごとに細胞を継代する。血管分化効率を最大化するため、適切な播種密度とコロニーサイズを有し、自発的分化が最小限である培養細胞を使用すること。

  1. 単一細胞懸濁液の調製
    1. 化学的に定義されたhPSC維持培地を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルあたり0.5 mLのDMEMでhiPSCを洗浄する。
    2. DMEMを吸引し、1ウェルあたり0.5 mLの0.02% EDTAを加える。室温で2–4分間インキュベートし、細胞が丸まり始めるまで観察する。
    3. P1000ピペットを用いて細胞を剥離させる。2–3回穏やかにピペッティングし、凝集体を単一細胞懸濁液に分散させる。
    4. 細胞を5 mLの化学的に定義されたhPSC維持培地で再懸濁し、懸濁液を15 mLコニカルチューブに移す。
    5. 細胞懸濁液10 µLと0.1% Trypan blue溶液10 µLを混合する。混合液10 µLを計数器にロードし、生存細胞数を測定する。
    6. 1ウェルあたり5 × 105個の生存細胞を得るために必要な細胞懸濁液の量を算出する。
    7. 室温（22–23 °C）で300 × g、5分間、細胞を遠心分離する。上清を吸引する。
    8. 50 µM Y-27632を含む新鮮な化学的に定義されたhPSC維持培地を用い、1ウェルあたり3 mLの容量で細胞を再懸濁する。
  2. 凝集体の形成
    1. 低接着6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液3 mLを加える。最終濃度が0.25%となるようにPVAを加える。
    2. プレートをオービタルシェーカーに載せ、50 rpmで37 °Cにて1日間インキュベートする。
    3. 次へ進む前に、縁が滑らかで直径が約50–100 µm以上の凝集体が形成されていることを確認する。
    4. 注：凝集期間は個々のhiPSCラインに合わせて最適化すること。目的のサイズの凝集体を得るために必要な場合は、インキュベーションを2–3日間に延長する。
  3. 中胚葉への誘導
    1. 0日目に、滅菌済みの10 mL使い捨てピペットを用いて凝集体を15 mLコニカルチューブに移す。再播種用に元の低接着プレートを保管しておく。
    2. 凝集体を約15–20分間、重力で沈降させる。
    3. 注：物理的な損傷を最小限に抑えるため、凝集体は慎重に取り扱い、遠心分離ではなく重力沈降を用いること。
    4. 凝集体の沈降後、上清を注意深く吸引する。
    5. 12 µM CHIR99021および30 ng/mL BMP-4を添加したN2B27培地を用い、1ウェルあたり3 mLで凝集体を再懸濁する。
    6. 凝集体を低接着プレートに戻し、37 °Cでインキュベートする。
    7. 凝集体の過剰な融合を最小限に抑えるため、P1000ピペットで1日1回穏やかにピペッティングする。中胚葉への誘導を3日間継続する。
  4. 血管系への誘導
    1. 3日目に、凝集体を15 mLコニカルチューブに移し、重力で沈降させる。元の6ウェルプレートを保管しておく。
    2. 凝集体の沈降後、上清を注意深く吸引する。
    3. 100 ng/mL VEGF-Aおよび2 µM forskolinを添加したN2B27培地を用い、1ウェルあたり3 mLで凝集体を再懸濁する。
    4. 凝集体を低接着6ウェルプレートに戻し、さらに2日間インキュベートする。

3. 血管ネットワークおよびオルガノイドの作製

  1. コラーゲンI–基底膜マトリックスの調製
    1. 6ウェルプレート1枚で生成した凝集体を回収し、12ウェルプレート1枚に埋め込む。1ウェルあたり約40–60個の凝集体を使用する。
    2. 12ウェルプレートの各ウェルに0.5 mLの層を2回添加できるよう、十分な量のコラーゲンI–基底膜マトリックス混合液を調製する。
    3. 12ウェルプレート1枚分として12 mLのマトリックスを調製する。すべての構成成分を氷上で保持し、混合液は使用直前に調製し、気泡が混入しないように注意する。
    4. 12ウェルプレートの各ウェルに0.5 mLのマトリックスを添加する。プレートを静かに揺らし、マトリックスを均一に分散させる。
    5. プレートを37 °Cで2時間インキュベートし、第1層のマトリックスを凝固させる。
  2. 凝集体の埋め込み
    1. 滅菌済みの10 mL使い捨てピペットを用いて凝集体を15 mLコニカルチューブに移し、重力で沈降させる。
    2. 上清を吸引し、1 mLのN2B27培地で凝集体を2回洗浄する。最後の洗浄後、残存する培地を可能な限り除去する。
    3. 新鮮なコラーゲンI–基底膜マトリックス混合液を調製し、氷上で保持する。
    4. 洗浄した凝集体を、調製したばかりのマトリックスに静かに再懸濁させる。
    5. 第1層が凝固した12ウェルプレートをインキュベーターから取り出す。
    6. 凝集体を含むマトリックスを各ウェルに0.5 mLずつ添加する。
    7. プレートを1分以内で静かに揺らし、凝集体を均一に分散させる。
    8. 直ちにプレートを37 °Cで2時間インキュベートし、第2層を凝固させる。
  3. 血管出芽の誘導
    1. 15% FBS、100 ng/mL VEGF-A、および100 ng/mL FGF-2を添加したN2B27培地を37 °Cに予熱する。
    2. 予熱した添加済み培地を各ウェルに加え、血管分化を誘導する。
    3. その後1–3日間、血管出芽の状態を観察する。
    4. 注意：ゲルマトリックスの不安定化を最小限に抑えるため、培養系に添加する前に培地を37 °Cに予熱しておくこと。
  4. 培地交換および培養維持
    1. 埋め込みから3日後に最初の培地交換を行う。
    2. その後は、15% FBS、100 ng/mL VEGF-A、および100 ng/mL FGF-2を含む新鮮なN2B27培地を用いて、1日おきに培地を交換する。
    3. 培地交換の際、コンディショニング培地の3分の1を保持し、残りの3分の2を新鮮な添加済み培地と交換する。
  5. 10日目に血管オルガノイドの単離を行う。

4. 血管オルガノイドの構築および染色の準備

  1. 個々の血管ネットワークの分離
    1. 滅菌したスパチュラの丸い端をウェルの端に沿って挿入し、ゲルマトリックスを底面からそっと剥がします。
    2. ゲルマトリックス全体が自由に浮き上がるまで、スパチュラをウェルの端から中心に向かって移動させ続けます。
    3. 2本の滅菌済みニードルを使用して、ゲルから個々の血管ネットワークを切り出します。血管ネットワークを損傷しないように、可能な限り余分なマトリックスを取り除いてください。
  2. 分離したオルガノイドの培養
    1. 滅菌済みの使い捨てピペットを用いて、分離した各オルガノイドを低接着96ウェルプレートの個々のウェルに直接移します。
    2. 15% FBS、100 ng/mL VEGF-A、および100 ng/mL FGF-2を添加したN2B27培地を、各ウェルに100 µLずつ加えます。
    3. オルガノイドをさらに5日間インキュベートし、添加培地を毎日交換します。
    4. 成熟5日目までに、オルガノイドが丸く完全に包み込まれた形態を示していることを確認します。
  3. 血管オルガノイドの固定
    1. 形態的に成熟したオルガノイドを2 mLマイクロ遠心チューブに移します。1本あたりのチューブに処理するオルガノイド数は、およそ60個までとしてください。
    2. 培地を慎重に吸引し、PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド (PFA) を加えます。
    3. 室温で1時間、オルガノイドを固定します。
      注意：PFAは毒性があり、発がん性が疑われています。適切な個人用保護具を着用し、化学薬品用ドラフトチャンバー内でPFAを取り扱ってください。
    4. PFAを吸引し、PBSに置換します。
      一時停止ポイント：固定した血管オルガノイドは、PBS中で4 °Cで最大1か月間保存可能です。

5. 血管オルガノイドの染色および共焦点イメージング

  1. ブロッキングおよび透過処理
    1. 固定済みの血管オルガノイドを含む各チューブに、ブロッキングバッファーを 2 mL 加える。
    2. チューブをオービタルシェーカーに垂直に配置し、室温で 2 時間振盪培養して、オルガノイドのブロッキングと透過処理を行う。
  2. 一次抗体反応
    1. ブロッキングバッファーを吸引除去し、ブロッキングバッファーで 1:100 に希釈した一次抗体を 50–100 µL 加える。
    2. チューブをシェーカーに直立させて配置し、4 °C で一晩振盪培養する。
  3. 洗浄および二次抗体反応
    1. PBST で 1 回あたり 10–15 分間、サンプルを 3 回洗浄する。各洗浄中、チューブは垂直に配置して振盪させる。
    2. ブロッキングバッファーで 1:300 に希釈した蛍光二次抗体を加える。
    3. サンプルを室温で 2 時間インキュベートする。
  4. 核の対比染色および最終洗浄
    1. PBST で 1 回あたり 10–15 分間、サンプルを 2 回洗浄する。
    2. PBS で 1:5,000 に希釈した Hoechst 溶液を加え、室温で 10–15 分間インキュベートする。
    3. PBS で 10–15 分間、サンプルを洗浄する。
  5. 共焦点イメージング
    1. 染色したオルガノイドを共焦点イメージング用ディッシュに移す。
    2. 実験群間で一貫したイメージングパラメータを用いて、共焦点画像を取得する。
  6. 血管オルガノイドの定量的画像解析
    注：Fiji/ImageJ および AngioTool を用いて定量的画像解析を行う。すべての実験群で同一の顕微鏡撮影設定を維持すること。
    1. 凝集体の直径測定
      1. 校正済みスケールを備えた倒立顕微鏡を用いて、0日目の hiPSC 凝集体の明視野画像を取得する。十分に分離した凝集体を撮影し、スケールバーを含める。
      2. 各画像を Fiji/ImageJ にインポートする。直線ツールを用いてスケールバーに沿って線を引き、Analyze > Set Scale を選択する。
      3. 既知の距離と単位（例：100 µm）を入力し、Global を選択して、セッション内のすべての画像に校正を適用する。
      4. 直線ツールを用いて、各凝集体の最も広い直径に線を引く。Analyze > Measure を選択するか、Ctrl+M を押し、直径を µm で記録する。
      5. 1バッチにつき少なくとも 30 個の凝集体を測定する。
      6. 非球状の凝集体については、楕円または多角形選択ツールを用いて各凝集体の外縁を囲む。Analyze > Set Measurements > Feret's diameter を選択し、測定値を記録する。
      7. Results テーブルから測定値をエクスポートし、スプレッドシートにデータをまとめる。
      8. 各バッチについて、平均値、標準偏差（SD）、および変動係数（CV = SD/平均値 × 100%）を算出する。
    2. オルガノイドの直径測定
      1. 校正済みスケールを備えた倒立顕微鏡を用いて、15日目の成熟した血管オルガノイドの明視野画像を取得する。各画像にスケールバーを含める。
      2. 各画像を Fiji/ImageJ にインポートし、上述のステップに従ってスケールを校正する。
      3. 直線ツールを用いて、各オルガノイドの最も広い直径に線を引く。Analyze > Measure を選択するか、Ctrl+M を押し、直径を µm で記録する。
      4. 1バッチにつき少なくとも 30 個のオルガノイドを測定する。
      5. 不規則な形状のオルガノイドについては、最長径と最短径を測定してその平均を算出するか、ステップ 5.6.1.6 に記載の方法で Feret 直径を決定する。
      6. 測定値をエクスポートし、各バッチの平均値、SD、および CV を算出する。
    3. CD31 陽性血管領域の定量化
      1. CD31 で染色した 15日目のホールマウント・オルガノイドの共焦点 z-stack 画像を取得する。すべてのサンプルで同一のレーザー強度、ゲイン、オフセット、およびピンホール設定を使用する。
      2. 顕微鏡ソフトまたは Fiji/ImageJ を用いて、z-stack から最大強度投影画像（MIP）を作成する。
      3. 強度閾値を適用し、背景信号を除去しつつ CD31 陽性血管ネットワークをセグメント化する。
      4. Process > Noise > Remove Outliers を選択し、半径 2–5 ピクセルを指定して小さなアーティファクトを除去する。Process > Binary > Fill Holes を選択し、血管ネットワーク内の小さな隙間を埋める。
      5. Analyze > Set Measurements を選択し、Area と Area fraction を有効にする。Analyze > Measure を選択して、血管領域を決定する。
      6. オルガノイドの総面積に対する CD31 陽性血管領域の割合（%）を算出する。
      7. 3つの独立したバッチから、1バッチにつき少なくとも 3 個のオルガノイドを解析する。統計解析のために測定値をエクスポートする。
    4. PDGFR-β 陽性ペリサイト被覆率の定量化
      1. CD31 および PDGFR-β で染色した 15日目のホールマウント・オルガノイドの共焦点 z-stack 画像を取得する。z-stack から MIP を作成する。
      2. CD31 と PDGFR-β の MIP を Fiji/ImageJ にインポートし、画像の整合性を確認する。
      3. CD31 チャンネルに閾値を適用し、血管ネットワークを定義するバイナリマスクを作成する。
      4. 同様のセグメンテーション手法を PDGFR-β チャンネルに適用し、ペリサイト信号のバイナリマスクを作成する。
      5. Process > Image Calculator を選択し、CD31 と PDGFR-β のマスクに AND 演算を適用して、重なり合うピクセルを特定する。
      6. 重なり合う信号の領域を測定する。
      7. ペリサイト被覆率を（CD31 陽性血管内の PDGFR-β 陽性領域 / CD31 陽性血管の総面積）× 100% として算出する。
      8. 3つの独立したバッチから、1バッチにつき少なくとも 3 個のオルガノイドを解析する。統計解析のために測定値をエクスポートする。
    5. AngioTool を用いた分岐指数の解析
      1. CD31 で染色した 15日目のホールマウント・オルガノイドの共焦点 z-stack 画像を取得する。z-stack から MIP を作成する。
      2. AngioTool を起動し、MIP 画像をロードする。
      3. 画像内で観察される典型的な血管径に合わせて、vessel diameter を設定する。
      4. 強度閾値を調整し、背景信号を除去しつつ血管ネットワークをセグメント化する。小さなアーティファクトを除去するために、最小血管サイズ（minimum vessel size）を設定する。
      5. 解析を実行し、血管面積（vessel area）、血管密度（vessel density）、総血管長（total vessel length）、接合点数（number of junctions）、および分岐指数（branching index）を記録する。
      6. 出力画像を確認し、血管系が黄色で、血管骨格が赤色で表示され、分岐点が青い点でマークされていることを確認する。
      7. AngioTool から定量結果をエクスポートする。
      8. 3つの独立したバッチから、1バッチにつき少なくとも 3 つの視野を解析し、統計解析のためにデータをまとめる。

6. 血管オルガノイドの定量的リアルタイムPCR分析

注：すべてのRNA抽出およびその後の一連の手順は、RNaseフリーの条件下で行ってください。

  1. RNA抽出
    1. 1.5 mLのRNaseフリーマイクロ遠心チューブに、15日目の成熟血管オルガノイドを5–10個回収する。残存している培地を完全に除去する。
      注：十分な量のRNAを得るために、必要に応じて複数のオルガノイドをプールする。
    2. 1% β-mercaptoethanolを添加した溶解バッファーを350 µL加える。
    3. オルガノイドが完全に溶解するまで、ピペッティングを10–15回行う。
    4. 溶解物を、回収チューブにセットしたゲノムDNA除去スピンカラムに移す。室温で11,000 × g、30秒間遠心分離する。
    5. カラムを捨て、ろ液を回収する。
    6. ろ液に等量（約350 µL）の70%エタノールを加え、ピペッティングで十分に混ぜる。
    7. 混合液を最大700 µLまで、回収チューブにセットしたRNAスピンカラムに移す。11,000 × gで30秒間遠心分離し、ろ液を捨てる。
    8. カラムに洗浄バッファー1を350 µL加える。11,000 × gで30秒間遠心分離し、ろ液を捨てる。
    9. サンプル1つにつき、DNase I 10 µLとDNase消化バッファー70 µLを混合して、DNase I混合液を調製する。
    10. DNase I混合液80 µLをカラム膜に直接加え、室温で15分間インキュベートする。
    11. カラムに洗浄バッファー1を350 µL加える。11,000 × gで30秒間遠心分離し、ろ液を捨てる。
    12. カラムに洗浄バッファー2を500 µL加える。11,000 × gで30秒間遠心分離し、ろ液を捨てる。
    13. 洗浄バッファー2を500 µL用いて、洗浄を繰り返す。
    14. 空のカラムを11,000 × gで2分間遠心分離し、膜を乾燥させる。
    15. カラムを新しい1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心チューブに移す。RNaseフリー水を30–50 µL膜に直接加え、室温で1分間インキュベートする。
    16. 11,000 × gで1分間遠心分離してRNAを溶出させる。使用時までRNAを−80 °Cで保存する。
      注：分光光度法によりRNAの濃度と純度を評価する。A260/A280比が1.8–2.1の範囲であることを許容基準とする。
  2. cDNA合成
    1. 逆転写反応液を氷上で調製する。
    2. 600 ngの全RNAを、逆転写酵素、バッファー、dNTPs、およびランダムプライマーを含むRTマスターミックス4 µLと混合する。RNaseフリー水を加えて最終容量を20 µLにする。
    3. 反応液を37 °Cで15分間、続いて85 °Cで5秒間インキュベートする。
    4. 得られたcDNAを使用時まで−20 °Cで保存する。
  3. 定量的リアルタイムPCR
    1. 2× SYBR Greenマスターミックス5 µL、RNaseフリー水3 µL、および各10 µMに調製したフォワードおよびリバースプライマー混合液1 µLを混合し、1反応あたり9 µLのqPCRマスターミックスを調製する。
    2. 96ウェルqPCRプレートの各ウェルに、マスターミックスを9 µLずつ分注する。
    3. 各ウェルにcDNAを1 µL加え、最終反応容量を10 µLとする。
    4. プレートを光学用粘着フィルムで封印し、1,000 × gで1分間遠心分離する。
    5. 95 °Cで30秒間の初期変性を行う。
    6. 95 °Cで5秒間、続いて60 °Cで30秒間の増幅サイクルを40回行う。
    7. 融解曲線分析を行い、アンプリコンの特異性を確認する。
      注：各サンプルは2連または3連で測定する。
    8. 2−ΔΔCt法を用いて標的遺伝子の相対的発現量を算出する。Ct値をハウスキーピング遺伝子（例：GAPDH）で標準化し、未分化hiPSCサンプルに対して発現量を校正する。

7. 統計解析

  1. 定量的データは、条件ごとに少なくとも3つの独立した生物学的反復（n ≥ 3）から得られた平均値 ± 標準偏差（SD）として提示する。
  2. 凝集塊およびオルガノイド径の測定では、独立した各バッチを1つの生物学的反復として扱い、各バッチ内で測定した30個の個別の構造体の平均を算出して、バッチレベルの平均値を1つ得る。
  3. 血管領域、ペリサイト被覆率、および分枝指数の測定値は、各バッチ内の複数のオルガノイドまたは視野の平均を算出してバッチレベルの値を1つ得て、これらのバッチレベルの値を統計的比較に使用する。
  4. 最適化されたプロトコルと元のWimmerプロトコルを、非対応の両側Student's t-testを用いて比較する。
  5. 統計的有意性は p < 0.05 と定義する。有意水準は、適宜 p < 0.05、p < 0.01、および p < 0.001 として示す。
  6. すべての統計解析は、統計解析ソフトウェアバージョン10を使用して行う。

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結果

ここで述べる最適化されたプロトコルにより、段階的な分化戦略を用いることで、hiPSCから約15日間で成熟した血管オルガノイドを生成することが可能になります（図 1A）。簡潔に述べると、まずオービタルシェーカーを用い、0.25% PVAを添加した低接着プレート内でhiPSC凝集体を形成させました（Day −1）。Day 0に、CHIR99021 (12 µM)およびBMP-4 (30 ng/mL)を用いて3日間の中胚葉誘導を行い、続いてVEGF-A (100 ng/mL)およびforskolin (2 µM)を用いて2日間の血管系への分化誘導を行いました（Day 3–5）。Day 5に、凝集体をコラーゲンI・基底膜マトリックスに包埋し、血管出芽を促進させるため、VEGF-A (100 ng/mL)、FGF-2 (100 ng/mL)、および15% FBSを添加したN2B27培地で培養しました。Day 10に、個々の血管ネットワークをゲルから分離し、さらなる成熟させるため、低接着96ウェルプレートに1ウェルあたり1つのオルガノイドとして移しました。Day 15までに、丸みを帯びて完...

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ディスカッション

本稿で述べる最適化プロトコルでは、血管オルガノイド作製の均一性、再現性、および構造的完全性を向上させることを目的として、Wimmerら18によって当初確立された血管オルガノイド分化システムにいくつかの重要な改善を導入しています。元のプロトコルと比較して、最適化された手法では以下の側面において大幅な改善が図られています。第一に、凝集形成条件を最適化することで、胚様体の均一性が大幅に向上します。元のプロトコルでは、低接着6ウェルプレートを用いた自然凝集によりhiPSC凝集体を生成しており、NC8ラインでは1ウェルあたり2 × 105 cells、H9ラインでは1ウェルあたり5 × 105 cellsを播種し、重力による細胞凝集に依拠していました。この手法は、播種密度とインキュベーション時間の経験的な制御に大きく依存するため、凝集体のサイズにバッチ間のばらつきが生じていました。最適化プロトコルでは、凝集に低接着6ウェルプレートを継続して使用しつつ、凝集体の均一性を高めるために3つの変更を導入しました。(1) 安定した凝集に十分な細胞数を確保するため、1...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（NSFC）の若手科学者基金(C)（No. 32200655）および一般プログラム（No. 32270847）の支援を受けて行われました。また、著者らは安徽大学公共サービスプラットフォームの支援に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 μm ボトルトップフィルターNalgeneFPE204030培地および緩衝液の滅菌ろ過用
15 mL コニカルチューブSparkJadeGD0001滅菌済み
2 mL マイクロ遠心チューブEppendorf22363204滅菌済み
2-メルカプトエタノール (1000×)Gibco21985023ドラフトチャンバー内で使用
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 フラグメント ドンキー抗ウサギ IgG (H+L)LableadY1104二次抗体；1:300に希釈
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 フラグメント ドンキー抗ヤギ IgG (H+L)LableadY1007二次抗体；1:300に希釈
抗CD31抗体Cell Signaling3528s一次抗体；ブロッキング緩衝液で1:100に希釈
抗 PDGFR β 抗体Zenbio347269一次抗体；ブロッキング緩衝液で1:100に希釈
自動細胞カウンターLife TechnologiesCountess™ IIカウントチャンバースライドを含む
B27サプリメント (50×)Gibco17504044N2B27培地用；4ºCで解凍し、分注して −20ºCで保存。凍結融解を避けること
ベンチトップ遠心機ZonkiaSC-3610スイングバケットローター付き
生物安全キャビネット (クラスII)Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045滅菌 ddH2Oで 100 ng/μLに再構成し、分注して −20 °Cで保存
ウシ血清アルブミン (BSA)Biosharp9048-46-8ブロッキング緩衝液用
CHIR99021MCEHY-10182DMSOで 10 mM ストック溶液を調製し、−20ºCで最大1年間保存
CO2 インキュベーターFisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, 加湿
共焦点イメージングディッシュBiosharpBS-20-GJM染色後のイメージング用
共焦点顕微鏡LEICANA10×, 20×, 63× 対物レンズおよび ZEN ソフトウェアを搭載
DMEMVivacellC3113-0500Matrigel希釈およびコラーゲンI溶液用
DMEM/F-12, GlutaMAX サプリメントGibco10565018Matrigel希釈およびN2B27培地用
EDTA (0.5 M, pH 8.0)InvitrogenAM9260G継代用にPBSで0.02%に希釈
胎児ウシ血清 (FBS)Gibco10270-106N2B27完全分化培地用 (最終濃度 15%)
FGF-2NovoproteinC046滅菌PBSで 1 mg/mL ストック溶液を調製し、分注して −20ºCで保存
フォルスコリンR&D Systems1099DMSOで 10 mM ストック溶液を調製し、−20ºCで保存
HEPES (1M)Gibco15630080コラーゲンI溶液用
HoechstBeyotimeC1071S-4脱イオン水で 1 mg/mL ストック溶液を調製し、分注して −20ºCで保存
倒立顕微鏡LEICADMIL LED日常的な細胞観察用
Matrigel (成長因子低減)STEEMABM05分注後 −20ºCで保存し、凍結融解を避けること。氷上で操作すること
MEM 非必須アミノ酸溶液 (NEAA, 100×)Gibco11140035N2B27培地用
N2 サプリメント (100×)Gibco17502048N2B27培地用；遮光して −20ºCで保存
Neurobasal MediumGibco21103049N2B27培地用
ヌクレアーゼフリーウォーター (DNase/RNase フリー)LableadDoo55WJRNA/cDNA調製およびqPCR用
オービタルシェーカーJoan LabNA洗浄工程用
パラホルムアルデヒド (4% 溶液)ServicebioG1101PBSで4%に希釈して固定に使用；ドラフトチャンバー内で使用
ペニシリン-ストレプトマイシン (100×)Gibco15140122N2B27培地用
PGM1 MediumCellapyA1517001hiPSC拡大培地；遮光して 4ºCで保存、2週間安定
PGM1 サプリメント (25×)CellapyA1517101PGM1 基本培地と併用
ポリビニルアルコール (PVA)Sigma-AldrichP8136凝集を促進させるため、PGM1で 0.25% (w/v) に溶解
PureCol (ウシ I 型コラーゲン, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005コラーゲンI-Matrigel混合液用；バッチごとに重合能力をテストすること
qPCR サーマルサイクラーThermo FisherStepOnePlus™融解曲線解析機能付き；リアルタイムPCR検出用
逆転写キットAccurate BiologyAG11706全RNAからのcDNA合成用；逆転写酵素、緩衝液、dNTP、ランダムプライマーを含むRTマスターミックスを含む
RNA抽出キットYeasen19221ES50血管オルガノイドからの全RNA単離用；gDNA除去カラムおよび RNase-free DNase I を含む
重炭酸ナトリウム (7.5%)Gibco25080094コラーゲンI溶液用
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750ブロッキング緩衝液用に、脱イオン水で 1% (w/v) 溶液を調製
水酸化ナトリウム (1.0 N)Sigma-AldrichS2770コラーゲンI溶液の pH 調整用
滅菌使い捨てピペット (10 mL)Bkmamlab110205007個包装、滅菌済み
滅菌フィルター付きピペットチップ (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220滅菌済み、フィルター付き
滅菌針 (30 G)NANA血管ネットワークの解剖用
滅菌スパチュラ (丸型)Fisher Scientific21-401-5ステンレス製
SYBR Green マスターミックスAccurate BiologyAG11733qPCR用 2× 濃度；ホットスタートDNAポリメラーゼ、緩衝液、dNTP、およびSYBR Green染料を含む
組織培養処理済み 12ウェルプレートBD Falcon353043ゲル包埋および血管ネットワーク培養用
組織培養処理済み 6ウェルプレートEppendorf30720113標準 TC 処理済み
Triton X-100Sigma-AldrichT9084ブロッキング緩衝液用
トリパンブルー (0.4%)Thermo Fisher15250061細胞計数用
Tween 20Sigma-AldrichP79490.05% PBS-T 洗浄液用
超低接着 6ウェルプレートCorning3471凝集体の形成および分化用
超低接着 ラウンドボトム 96ウェルプレートBeyotimeFULA962-6pcs血管オルガノイドの浮遊培養用
VEGF-AProteintechHZ-1038滅菌PBSで 1 mg/mL ストック溶液を調製し、分注して −20ºCで保存
ウォーターバスBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071滅菌PBSまたはDMSOで 10 mM ストック溶液を調製し、−20ºCで保存。作業濃度：5 μM (解凍時)、50 μM (凝集体形成時)

参考文献

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