研究記事

潰瘍性大腸炎におけるフェロトーシスおよびクプロトーシスの標的化：包括的なバイオインフォマティクス解析と実験的検証による知見

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DOI:

10.3791/73656

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2026年8月25日

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1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

本研究では、統合的な機械学習、シングルセルRNAシーケンシング、および実験的検証を通じて、潰瘍性大腸炎における銅死（cuproptosis）およびフェロトーシス（ferroptosis）に関連する5つのバイオマーカーを同定し、臨床診断および標的免疫療法への知見を提供します。

要約

潰瘍性大腸炎（UC）は、病態生理が完全には解明されておらず、新興工業国において有病率と入院率が増加している持続的な腸管疾患である。UCでは、過剰な腸管上皮細胞死が粘膜バリアを破壊し、炎症反応を引き起こす。フェロトーシスとクプロトーシスは、近年報告された制御細胞死の2つの形態である。UCに関するほとんどの研究では、これらのプロセスが個別に検討されてきたが、UCの進行における両者の複合的な役割については十分に特徴付けられていない。UCの病態における相乗的な役割を調査するため、大規模なトランスクリプトームプロファイリングを用いて候補ターゲットを特定し、次にin vitroモデルで検証するという段階的なアプローチを採用した。変動発現遺伝子（DEGs）をフェロトーシス関連遺伝子（FRGs）およびクプロトーシス関連遺伝子（CRGs）と交差させた。重複するターゲットは、機械学習アルゴリズムのコンセンサスおよび加重遺伝子共発現ネットワーク分析（WGCNA）を用いて優先順位を付けた。その結果、5つのバイオマーカー（LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2、CD274）がUCで有意に上昇していた。シングルセル解析により、これらの異なる細胞型における発現を特徴付けたところ、LCN2とNOS2は主に上皮細胞に濃縮されていた。これらのマーカーのメカニズム的な関連性は、in vitroアッセイを通じてさらに評価された。フェロトーシスまたはクプロトーシス阻害剤による処理は、Caco-2細胞モデルにおいてUC関連の炎症を緩和し、バイオマーカーの発現を調節した。これらの知見は、UCの進行に関連する5つのバイオマーカーを特定し、臨床診断および治療的介入への応用の可能性を支持する実験的根拠を提供するものである。

概要

潰瘍性大腸炎（UC）は再発を繰り返す炎症性腸疾患であり、世界的な負担の増大と多額の長期治療コストが課題となっている1,2。アミノサリチル酸製剤、副腎皮質ステロイド、生物学的製剤、および低分子化合物治療によって治療選択肢は拡大したが、多くの患者にとって持続的な寛解を得ることは依然として困難である3,4。このような未充足の臨床的ニーズから、早期診断やメカニズムに基づいた治療を可能にする、再現性のある分子マーカーおよび解析可能なメカニズムを特定することの重要性が浮き彫りになっている5。

フェロトーシスは、脂質過酸化、グルタチオンの枯渇、およびGPX4活性の低下によって引き起こされる、鉄依存的な調節性細胞死の一形態である6。潰瘍性大腸炎（UC）における鉄およびマロンジアルデヒドレベルの上昇は、フェロトーシスによる上皮傷害と一致しており、一方でSLC7A11–GSH–GPX4軸の実験的な活性化やフェロトーシスの直接的な抑制は、腸管バリアを保護することができる7,8。

2022年に報告されたクプロプトーシス（Cuproptosis）は、銅がリポイル化されたミトコンドリアタンパク質に結合することで誘発され、その結果、タンパク質の凝集とプロテオトキシックストレスが引き起こされます9。腸管は銅の代謝において中心的な役割を担っているため、この経路の破綻が、潰瘍性大腸炎（UC）における酸化性および炎症性の上皮損傷を増幅させる可能性があります10。

フェロトーシスとクプロトーシスは、金属イオンの不均衡、ミトコンドリア代謝、グルタチオンの枯渇、および酸化ストレスを介して収束する可能性があります11。しかし、このクロストークがUCにおいて再現可能な分子シグネチャーを生成するかどうか、また、そのようなシグネチャーが経路特異的な阻害に反応するかどうかは、依然として未解決のままです。

本研究の仮説は、潰瘍性大腸炎（UC）におけるフェロトーシスとクプロトーシスのクロストークの調節不全が、バルクおよびシングルセルのトランスクリプトームデータセット全体で優先順位付け可能であり、かつ腸上皮傷害モデルにおけるパスウェイ特異的な阻害によって減弱させることができる、再現性のあるバイオマーカーシグネチャーに収束するというものである。したがって、マルチコホートのバイオインフォマティクス、機械学習、シングルセル解析、および標的としたCaco-2実験を統合し、候補バイオマーカーの特定および機能評価を行った（図 1）。

統合的な研究デザイン図：トランスクリプトーム解析による発見、バイオマーカーの評価、実験的検証。
図 1: 研究ワークフロー。マルチコホート・トランスクリプトームスクリーニング、機械学習およびネットワークに基づいたバイオマーカーの優先順位付け、シングルセル局在解析、およびCaco-2細胞を用いた阻害剤による検証の統合ワークフロー。UC: 潰瘍性大腸炎; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: 加重遺伝子共発現ネットワーク解析; PPI: タンパク質-タンパク質相互作用; ROC: 受信者動作特性; GSEA: 遺伝子セット濃縮解析。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

プロトコル

本研究では、公開データセットおよび市販のヒト細胞株を使用しました。ヒト被験者、新たに採取されたヒト組織、または脊椎動物は関与していないため、施設内倫理委員会の承認は不要でした。プロトコルで使用した研究ツール、ソフトウェア、およびオンラインリソースは、材料表に記載されています。

1. 差分発現解析のためのデータ処理

トランスクリプトームの探索および検証コホートを構築するため、Gene Expression Omnibus (GEO) データベースを「ulcerative colitis」という用語で検索した。GSE87466、GSE92415、GSE107499、GSE75214の4つのデータセットをトレーニングセットとして使用し、GSE47908を外部検証用として確保した。トレーニングデータセットはSangerbox 3.0のComBatを用いて正規化およびバッチ補正を行い、検証データセットは独立して処理した。

単一ソースによるバイアスを軽減するため、FerrDBから計583個のフェロトーシス関連遺伝子（FRG）を取得し、さらに文献で報告されている遺伝子を追加した12。また、既報の研究から96個のクプロトーシス関連遺伝子（CRG）のセットをまとめた12,13,14。差分的発現の解析にはlimmaを用い、閾値を|log₂ fold change| > 1およびBenjamini–Hochberg補正後のP < 0.05とした。正規化、バッチ補正、差分的発現、およびクラスタリングの診断プロットを付随図 1に提示する。サンプルの組成、プラットフォーム、およびコホートの割り当てを付随表 1に提示する。

2. UCにおけるCF-DEGの同定

共発現しているFRGおよびCRGを特定するため、閾値を|r| > 0.5およびP < 0.05としてピアソン相関分析を実施した。得られた遺伝子セットと発現変動遺伝子（DEG）との積集合を求め、クプロプトーシス・フェロプトーシス共発現発現変動遺伝子（CF-DEG）を特定した。

3. エンリッチメント解析

Gene Ontology (GO)およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)の濃縮分析を、clusterProfilerおよびBioinformatics.com.cnプラットフォームを用いて実施した。Benjamini–Hochberg法で補正された P < 有意水準は0.05とした。濃縮プロットは以下に示す。 補足図2.

4. 加重遺伝子共発現ネットワーク解析 (WGCNA)

遺伝子発現プロファイルの基礎となるモジュール構造を、加重遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA）を用いて解析した。階層的クラスタリングとgoodSamplesGenes関数を組み合わせて、異常サンプルの特定および除外を行った。その後、ネットワーク構築のためのスケールフリー・トポロジー基準を満たす適切なソフトしきい値指数（β）を決定した。

処理された発現データを用いて、遺伝子共発現解析のためのトポロジカルオーバーラップ行列（TOM）を構築しました。ダイナミックツリーカット法を用い、発現パターンが非常に一致している遺伝子を、それぞれ100個以上の遺伝子を含む遺伝子モジュールにまとめました。モジュール固有遺伝子（ME）と表現型の関連性を解析し、疾患プロセスに関連するモジュールを特定して、対応する遺伝子セットを抽出しました。WGCNAのスクリーニング診断結果は、補足図3に示しています。

5. バイオマーカーの選定

実験的なフォローアップの候補を優先的に決定するため、3つの機械学習アルゴリズムを並行して適用した15。特徴量選択にはLASSO（Least absolute shrinkage and selection operator）回帰を用い、遺伝子の重要度をランク付けするためにntree = 500のランダムフォレストを使用し、さらに、交差検証誤差が最小となる特徴量サブセットを特定するためにSVM-RFE（support vector machine–recursive feature elimination）を用いた。スクリーニングの完全な診断結果は補足図5に示されている。

遺伝子の重要性は、分類精度に対する個々の遺伝子の寄与度に基づいて評価され、上位にランクされた遺伝子を収集して予備的な遺伝子セットを作成しました16。SVM-RFEアルゴリズムは、反復的な特徴除去を通じて特徴量のスクリーニングとモデルの最適化を行い、分類に最適な特徴量サブセットの同定を可能にしました17。3つのアルゴリズム間で共通していた遺伝子を、機械学習によって同定された候補バイオマーカーと見なしました。

CF-DEGを用いてタンパク質相互作用（PPI）ネットワークを構築し、CytoHubbaを用いてコアノードのランキングを行いました。主要なWGCNAモジュール、3つの機械学習による出力、およびPPIコアセットの積集合から、5つの統合候補バイオマーカー（LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2、CD274）を定義しました。これらの遺伝子は、UC関連の診断候補として分類されました。その後の阻害剤を用いた実験により、LCN2、IDO1、CXCL2、およびNOS2はフェロトーシス阻害応答性マーカーとして、CD274はクプロトーシス阻害応答性マーカーとしてさらに分類されました。なお、これらの遺伝子は、いずれの経路においても証明済みのアップストリーム調節因子とは見なされませんでした。

6. 予測モデルの開発とマルチメソッド評価

同定された遺伝子シグネチャの臨床応用の可能性を評価するため、rmsパッケージを用いてノモグラムを構築し、診断能を評価した。モデルの性能は、キャリブレーション曲線、Hosmer–Lemeshow（HL）検定、およびHarrellの一致指数（C-index）を用いて評価した。

モデルのキャリブレーションは、HLテストおよび平均絶対誤差（MAE）を用いて評価した。許容可能なモデルの適合度および精度の閾値として、それぞれ P 値 > 0.05 および MAE < 0.1 と設定した。受信者動作特性（ROC）曲線を生成し、曲線下面積（AUC）を算出することで、UCに対するノモグラムの予測性能を評価した。また、独立したデータセットを用いて、モデルの汎用性と安定性を評価した。

7. 遺伝子セット濃縮解析 (GSEA)

トレーニングセットにおいて、各バイオマーカーと他のすべての遺伝子との間でSpearman相関分析を行った。相関結果を順位付けし、順序付けられた遺伝子セットを作成した。参照としてMolecular Signatures Database（MSigDB）のc2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols遺伝子セットを用いて、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を実施した。P < 0.05の生物学的パスウェイを有意に濃縮されているとみなした。

8. 免疫学的ランドスケープ解析

CIBERSORTツールとLM22シグネチャーマトリックスを用いて、発現データのデコンボリューション解析を行い、22種類の免疫細胞サブタイプの割合を推定した。続いて、5つのバイオマーカーと免疫細胞サブタイプの間の関連性を評価するために、Spearman相関分析を実施した。

9. 制御ネットワーク解析

遺伝子に関連する転写因子（TF）およびマイクロRNA（miRNA）の制御に関する情報は、NetworkAnalystプラットフォームを介して、統合されたChEA3およびTarBase 9.0データベースから取得した。少なくとも2つのノードに関連するmiRNAを制御ネットワークに組み込んだ。

10. 単一細胞RNA-seq

3つの健常サンプルと3つのUCサンプルで構成されるUCシングルセルデータセットGSE116222と、6つの健常サンプルと6つのUCサンプルで構成されるGSE214695を統合した。検出遺伝子数が200〜5,000個である細胞を保持した。 >1,000種類のユニーク分子識別子（UMI）、 < 30%のミトコンドリア転写産物、 < 3%のヘモグロビン転写産物、および < リボソーム転写産物を50%とした。正規化にはNormalizeData関数を用い、クラスタリングおよびアノテーションの前にHarmonyを用いてバッチ補正を行った。

フィルタリング後、NormalizeData関数を用いてデータの正規化を行った。サンプル間のバッチ効果を最小限に抑えるためにHarmonyを使用した。細胞集団内の局所的および全域的な構造を特徴づけるため、次元削減および細胞クラスタリングにUniform manifold approximation and projection（UMAP）およびt-distributed stochastic neighbor embedding（t-SNE）を用いた。最終的に、合計31,712個の高品質な細胞をさらなる解析のために保持した。細胞型は、標準的な細胞マーカー遺伝子に基づいてアノテーションを行った。

UC組織由来の上皮細胞および骨髄系細胞の状態変化を調査するため、Monocle 2を用いて擬時間（Pseudotime）解析を行った。細胞の発達軌跡および群間差を評価し、擬時間軌跡に沿ったバイオマーカーの発現パターンを可視化した。

上皮細胞と骨髄系細胞サブセット間の細胞間相互作用を評価するために、CellChatを用いた。サブポピュレーション固有の発現パターンを統合することで、上皮細胞と骨髄系細胞間の相互作用確率および主要なシグナル伝達経路を推定し、それらの潜在的な細胞間調節ネットワークを特徴付けた。

11. 細胞実験

ヒトCaco-2結腸腺癌細胞を、10%胎児ウシ血清、100 U/mLペニシリン、および100 µg/mLストレプトマイシンを含むDulbecco's modified Eagle mediumを用いて、37 °C、5% CO₂条件下で培養した。Caco-2細胞は、腸管バリアおよび炎症性損傷アッセイのための再現性のある上皮単層モデルとして選定したが、その悪性腫瘍由来という特性から、非悪性結腸上皮への直接的な一般化には制限がある。なお、アーカイブされた実験記録に継代数に関する情報は記載されていなかった。

細胞を1 µg/mLのリポポリサッカライド（LPS）に24時間曝露させることで、in vitro炎症傷害モデルを構築した。細胞を、ジメチルスルホキシド担体対照群、LPS単独群、LPS + 4 µM ferrostatin-1群、またはLPS + 40 µM tetrathiomolybdate群のいずれかに割り当て、最終溶媒濃度を統一した。LPS単独群を、阻害剤によるレスキュー比較のための陽性傷害/モデル対照とした。

  1. 細胞生存率
    製造元のプロトコルに従い、細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を評価した。37 °Cで約2時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmにおける吸光度を測定した。
  2. MDAおよびFe²⁺レベルの測定
    細胞内のマロンジアルデヒド（MDA）およびFe2⁺レベルを、製造元のプロトコルに従い、対応するアッセイキットを用いて測定した。総タンパク質量をビシンコニン酸アッセイを用いて定量し、各測定値を対応するサンプルのタンパク質含量で標準化した。
  3. 銅イオン蛍光プローブアッセイ
    培地を除去した後、Cu2⁺特異的蛍光プローブを最終濃度1 µMで添加し、37 °Cで30分間インキュベートした。洗浄せずに、倒立蛍光顕微鏡を用いて励起波長510 nm、蛍光波長578 nmで直ちに画像を撮影した。撮影設定は全群で一定とし、画像スケールバーは50 µmに校正した。
  4. RT-qPCR
    フェノール・グアニジニウムベースのRNA抽出試薬を用いて全RNAを単離した。第1ストランド相補的DNA合成キットを用い、1 µgのRNAから相補的DNAを合成し、リアルタイムPCRにはSYBR Greenベースの試薬を用いた。各反応はテクニカルリプリケートで3回ずつ行った。プライマー配列は付録表2に記載されており、メッセンジャーRNAの相対量を生殖2⁻ΔΔCt法を用いて算出した。

12. 統計解析

正規性と分散の均一性は、それぞれShapiro–Wilk検定および中央値基準のLevene検定を用いて評価した。両方の仮定を満たすデータは、独立2標本の両側t検定、または一元配置分散分析後に行うTukeyの公正有意差検定を用いて解析した。いずれかの仮定を満たさない場合は、Welchのt検定、またはWelchの分散分析後に行うGames–Howell検定を用いた。

結果は平均値 ± 標準偏差として提示します。実際の生物学的レプリケート数、正確な両側 P 値、および前提条件の確認結果は補足表3に記載しています。アーカイブされた図13のソースシートでは、パネルA（n = 4）、C（n = 4）、およびF（n = 2）のコントロールレプリケート数が少なくなっており、それ以外のすべてのパネル/グループの組み合わせは n = 6となっています。

計算解析は、Rおよびlimma、WGCNA、clusterProfiler、glmnet、randomForest、e1071、pROC、rms、Seurat v4、Harmony、Monocle 2、CellChat、Cytoscape/CytoHubbaのワークフローを用いて実施した。オンラインリソースには、FerrDB、GEO、STRING、ChEA3、TarBase 9.0、NetworkAnalyst、CIBERSORT/LM22、MSigDB、Bioinformatics.com.cn、およびSangerbox 3.0が含まれる。

結果

クプロプトーシスとフェロプトーシスの共発現遺伝子の同定および機能注釈

421例のUCサンプルと97例の健康対照群からなる4つのトレーニングデータセットを統合した。その結果、発現上昇した362遺伝子と発現低下した189遺伝子を含む、計551個の発現変動遺伝子が同定された。相関分析により444個のフェロトーシスおよびクプロトーシス相関遺伝子が抽出され、これを発現変動遺伝子と交差させたことで、32個のクプロトーシスおよびフェロトーシス共発現発現変動遺伝子（CF-DEGs）を導出した。

32個のCF-DEGは、傷害への反応、銅イオン、脂肪酸輸送、リポ多糖、炎症性腸疾患、NF-κBシグナリング、TNFシグナリング、およびフェロトーシスに濃縮されていた（付録表4）。

統合機械学習およびWGCNAによるコアバイオマーカーの優先順位付け

加重遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA）により、UCと最も強く関連するモジュールとしてMEpurple、MEbrown、およびMEblackが同定されました。選択されたこれらのモジュールには、合わせて1,426個の遺伝子が含まれていました（補足表5）。

Least absolute shrinkage and selection operator (LASSO)、support vector machine–recursive feature elimination (SVM-RFE)、およびランダムフォレストにより、それぞれ21個、32個、19個の特徴量が選択された。3つのモデルすべてに共通していた遺伝子は13個であった。機械学習のコンセンサス、CytoHubbaでランク付けされたタンパク質相互作用コア、および選択されたWGCNAモジュールを統合した結果、UCに関連する5つの候補バイオマーカー（LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2、CD274）が得られた。

バイオマーカーシグネチャの診断能評価およびパスウェイ濃縮解析

トレーニングコホートにおいて、5つの候補バイオマーカーすべてが正の相関を示し、UCでアップレギュレートされていた（図2A, B）。各マーカーにおいて、受信者動作特性曲線下面積（AUC）が得られた > トレーニングコホートでは0.80であり、 > 独立した検証コホートGSE47908において0.75（図2C–E).

5遺伝子ノモグラムは良好なキャリブレーションを示し、Hosmer–Lemeshow P > 0.05、平均絶対誤差 < 0.1であった。また、解析コホートにおける判別能は、曲線下面積および一致指数が0.945であり、一致指数の95%信頼区間は0.922–0.968であった（図 3）。

遺伝子セット濃縮解析により、5つの候補因子がJAK–STAT、インターフェロン–RIPK1/3、およびToll様受容体–NF-κBシグナル伝達経路に関連していることが示された（図 4）。

遺伝子発現解析チャート；UC（潰瘍性大腸炎）対健常者の比較における円グラフ、ROC曲線およびボックスプロット。
図2候補バイオマーカーの発現および診断能。 (A) 相関ヒートマップ (B, C) トレーニングコホートにおけるバイオマーカー発現および受信者動作特性曲線（ROC曲線）。 (D, E) GSE47908検証コホートにおけるバイオマーカー発現および受信者動作特性曲線。ROC：受信者動作特性 AUC：曲線下面積；UC：潰瘍性大腸炎 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

予測モデル評価のためのノモグラム図、検量線、およびROC解析。
図3UCノモグラムの開発および評価。 (A) 5遺伝子ノモグラム (B）較正曲線（C受信者動作特性曲線 ROC：受信者動作特性；UC：潰瘍性大腸炎；AUC：曲線下面積；C-index：コンコーダンス指数 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子セット濃縮解析グラフ。ランク vs 濃縮スコア。比較データセット。
図 4: 5つの候補バイオマーカーの遺伝子セット濃縮解析。 (A–E) LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2、およびCD274のそれぞれの遺伝子セット濃縮解析結果。 GSEA：遺伝子セット濃縮解析。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

免疫微小環境の景観および調節ネットワーク解析

UCサンプルでは、好中球、活性化メモリーCD4⁺ T細胞、M1マクロファージ、および活性化マスト細胞の割合が増加し、逆にM2マクロファージ、静止期マスト細胞、および静止期樹状細胞は減少していました。これらのパターンはバリデーションコホートにおいても再現されました（図 5A–E）。

これら5つの候補因子は、好中球、活性化記憶CD4⁺ T細胞、およびM1マクロファージと正の相関を示し、静止期マスト細胞およびM2マクロファージと負の相関を示した（Figure 5F–J）。遺伝子miRNAネットワークは98個のノードと146本のエッジで構成されていた。hsa-miR-34a-5pおよびhsa-miR-16-5pが最も高いバイオマーカー結合度を示し、一方、ARおよびRELAが最も結合度の高い転写因子であった（Figure 6）。

免疫細胞組成および相関ヒートマップ、遺伝子発現データを可視化した解析グラフ。
図5免疫浸潤解析 (A）免疫細胞組成。（B) 免疫細胞比率における群間差 (C) 免疫細胞相関ヒートマップ (D, E) トレーニングコホートおよび検証コホートにおける免疫細胞浸潤 (F–J) 候補バイオマーカーと免疫細胞集団との相関。 UC：潰瘍性大腸炎. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子ネットワーク相互作用図。タンパク質相互作用および制御経路解析を強調している。
図 6: 予測されたmiRNAおよび転写因子ネットワーク。 (A) 遺伝子–miRNAネットワーク。円は候補バイオマーカーを、正方形はmiRNAを示す。 (B) 転写因子–遺伝子ネットワーク。菱形は候補バイオマーカーを、逆三角形は転写因子を示す。 miRNA: microRNA; TF: transcription factor. こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

単一細胞解像度における時空間的な発現ダイナミクス

品質管理後、31,712個の細胞が22のクラスターを形成し、これらは9つの主要な細胞集団として注釈付けされた（Figure 7A–C）。UCでは上皮細胞と形質細胞の割合が高かった。LCN2およびNOS2は上皮細胞に、一方でIDO1、CXCL2、CD274は骨髄系細胞に濃縮されていた（Figure 7D–G）。

上皮細胞のサブクラスター解析により11のサブセットが特定され、その中で炎症性結腸細胞の拡大、およびLCN2とNOS2の濃縮が認められた（図 8）。骨髄系細胞のサブクラスター解析では7つのサブセットが特定され、単球の増加とマクロファージの減少、および単球におけるIDO1、CXCL2、CD274の濃縮が認められた（図 9）。

炎症性結腸細胞は上皮の分化軌跡の後半に蓄積し、LCN2およびNOS2の発現が増加していました（図 10）。単球はUCに関連した明確な軌跡を示し、IDO1、CXCL2、およびCD274の動的な発現が見られました（図 11）。

炎症性結腸細胞は最も強力な送出シグナリングを示し、単球との顕著なコミュニケーションが認められた。これらのサブセット間では、APP–CD74が主要なリガンド-受容体ペアであった（図12）。

細胞型の分布およびサンプル中の遺伝子発現を示すUMAPクラスタリング図およびドットプロット。
図7細胞集団における候補バイオマーカーの発現。 (A) 細胞クラスター (B) アノテーションマーカー (C) 注釈付きの9つの細胞集団 (D, E) 健康および潰瘍性大腸炎（UC）サンプルの細胞分布と割合。(F, GUMAPおよびバブルプロットにより可視化された候補バイオマーカーの発現。 UC：潰瘍性大腸炎；UMAP：一様多様体近似および投影 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

上皮細胞型のt-SNEクラスタリングおよび解析；データパターンを示すグラフおよびヒートマップ。
図8上皮細胞のサブクラスター化および候補遺伝子の発現。 (A) 初期の上皮細胞クラスター (B) アノテーションマーカー (C) 注釈付きの上皮細胞サブセット。 (D) 健康なサンプルおよび潰瘍性大腸炎（UC）サンプルにおけるサブセットの割合。 (E) 上皮細胞サブセットにおけるLCN2およびNOS2の発現。 t-SNE：t-分布確率的近傍埋め込み、UC：潰瘍性大腸炎 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

骨髄系クラスターのt-SNEクラスター解析および棒グラフ；免疫発現；シングルセルRNAシーケンシング。
図 9: 骨髄系細胞のサブクラスター化および候補因子の発現。 (A) 初期の骨髄系細胞クラスター。 (B) アノテーションマーカー。 (C) アノテーション済み骨髄系細胞サブセット。 (D) 健康群およびUCサンプルのサブセット比率。 (E) 骨髄系細胞サブセットにおけるIDO1、CXCL2、およびCD274の発現。 t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: 潰瘍性大腸炎。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

次元削減およびクラスタリングの結果。コンポーネントマッピングおよび擬時間解析グラフを示す。
図 10: 上皮細胞の擬時間解析。 (A) 擬時間の軌跡および状態の割り当て。(B) 軌跡に沿った正常上皮細胞およびUC上皮細胞の分布。(C) 擬時間に沿ったLCN2およびNOS2の発現ダイナミクス。UC: 潰瘍性大腸炎。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

スペクトルフィッティンググラフ。成分間関係のデータ解析。グローバル解析のフィッティング結果。
図 11: 骨髄系細胞の擬時間解析。 (A) 擬時間軌跡と状態の割り当て。 (B) 軌跡に沿った健康群およびUC骨髄系細胞の分布。 (C) 擬時間に沿ったIDO1、CXCL2、およびCD274の発現動態。 UC: 潰瘍性大腸炎。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

タンパク質相互作用ネットワークおよび相互作用強度。データ結果は散布図およびヒートマップで表示。
図12上皮細胞–骨髄系細胞間コミュニケーション (A) 相互作用数および強度 (B) 送信および受信信号強度。 (C) 炎症性結腸細胞が関与する相互作用 (D) 通信強度ヒートマップ。 (E炎症性結腸細胞が関与するリガンド-受容体ペア。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

In vitroにおけるフェロトーシスおよびクプロトーシス介入の実験的検証

リポポリサッカライド（LPS）への曝露により、Caco-2細胞の生存率が低下し、溶媒対照群と比較してIL-6およびIL-1βの発現が増加した（図 13A–C および付録図 5）。

LPSはFe2⁺、マロンジアルデヒド、およびLCN2、IDO1、CXCL2、NOS2のメッセンジャーRNA量を増加させたが、ferrostatin-1はこれらのLPSに関連する変化をそれぞれ消失させた（図 13D–I）。LPS群とLPS + ferrostatin-1群の比較において、各生物学的レプリケート内のテクニカルレプリケートを平均化した後の正確な両側P値は、9.45 × 10⁻5から0.0027の範囲であった。

LPSは生存率を低下させ、IL-6、IL-1β、FDX1/DLAT、CD274、および銅感受性蛍光を増加させたが、テトラチオモリブデン酸はこれらの変化を反転させた (Figure 14 A–E)。LPSとLPS + テトラチオモリブデン酸の比較において、正確な両側 P 値は < 1 × 10⁻15 から 0.0008 の範囲であった。

これらの解析を総合すると、UCに関連する5つの診断候補が同定され、それらの発現が上皮細胞および骨髄系細胞集団に局在していることが明らかになりました。また、Caco-2細胞において、LCN2、IDO1、CXCL2、およびNOS2はフェロトーシス抑制に反応した一方で、CD274は銅キレート剤に反応することが示されました。

コントロール、LPS、およびLPS+Fer処理を比較した細胞生存率およびmRNA発現の図。
図 13: Ferrostatin-1はCaco-2細胞におけるLPS関連の炎症およびフェロトーシス関連の変化を減衰させる。 (A) 細胞生存率。 (B, C) IL-6およびIL-1βのメッセンジャーRNA発現。 (D, E) 細胞内マロンジアルデヒドおよびFe2⁺レベル。 (F–I) LCN2、IDO1、CXCL2、およびNOS2のメッセンジャーRNA発現。 各独立した生物学的反復内でテクニカルトリプリケートの平均を算出。誤差棒は標準偏差を示す。利用可能な生物学的反復数は、AおよびCではControl n = 4、FではControl n = 2、その他のすべてのパネル/グループの組み合わせでは n = 6である。 正確な両側 P 値および前提条件の確認は補足表 5に記載されている。 Fer-1: ferrostatin-1; LPS: リポ多糖; MDA: マロンジアルデヒド。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

細胞生存率およびmRNA発現の棒グラフ、および銅プローブ分布を示す顕微鏡写真。
Figure 14: テトラチオモリブデンは、Caco-2細胞におけるLPS関連の炎症およびクプロトーシス関連の変化を減弱させる。 (A) 細胞生存率。 (B, C) IL-6およびIL-1βのメッセンジャーRNA発現。 (D) FDX1およびDLATのメッセンジャーRNA発現。 (E) CD274のメッセンジャーRNA発現。 (F) 細胞内Cu2⁺蛍光；スケールバー = 50 µm。 各群につき6回の独立した生物学的反復を行い、それぞれについてテクニカルトリプリケートの平均値を算出。エラーバーは標準偏差を示す。正確な両側P値および想定チェックはSupplementary Table 5に記載されている。TTM: tetrathiomolybdate; LPS: lipopolysaccharide. こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

未処理および処理済みのデータ、解析スクリプト、ならびに細胞実験のソーススプレッドシートは、https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720 で公開されています。

補足図1：データの前処理および差分的発現の診断。 (A–F) バッチ補正前 (A–C) および補正後 (D–F) のサンプルの分布。(G) 差分的発現遺伝子のボルケーノプロット。(H) 正規化された発現パターンのヒートマップ。DEGs: 差分的発現遺伝子; GEO: Gene Expression Omnibus。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図2：CF-DEGsの濃縮分析。 (A) 遺伝子オントロジー（Gene Ontology）濃縮分析。 (B) 京都遺伝子・ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）濃縮分析。 CF-DEGs：クプロトーシス・フェロトーシス共発現差分的発現遺伝子； GO：Gene Ontology、KEGG：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足図3：WGCNAスクリーニング診断。 (A) ソフトしきい値の選択。 (B) モジュール固有遺伝子（eigengene）のクラスタリング。 (C) 遺伝子モジュールのデンドログラム。 (D) モジュールと形質の関連性。 (E–G) パープル、ブラウン、およびブラックモジュールの遺伝子有意性とモジュールメンバーシップの関係。 WGCNA: weighted gene co-expression network analysis; UC: ulcerative colitis。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図4：多段階バイオマーカースクリーニング。 (A, B) LASSOによる特徴量選択。(C, D) SVM-RFEによる特徴量選択。(E, F) ランダムフォレストによる特徴量ランキング。(G) 3つのモデル間でのコンセンサス。(H, I) PPIネットワークおよびCytoHubbaコアノード。(J) 機械学習、WGCNA、およびPPI結果の統合。(K) 5つの候補因子の染色体上の位置。LASSO: least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE: support vector machine–recursive feature elimination; RF: random forest; PPI: protein–protein interaction; WGCNA: weighted gene co-expression network analysis。こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足図 5：Caco-2細胞におけるLPSモデルの検証。 (A) 細胞生存率。(B, C) IL-6およびIL-1βのメッセンジャーRNA発現。各群につき6つの独立した生物学的反復において、テクニカルトリプリケートの平均値を算出。エラーバーは標準偏差を示す。LPS：リポポリサッカライド。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表1：探索および検証に使用したGEOデータセット。探索および検証解析に含まれるGEOデータセットのアクセッション番号、プラットフォーム、サンプル組成、およびコホート割り当て。GEO：Gene Expression Omnibus。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表2：逆転写定量PCRプライマー配列。 本研究で評価した遺伝子の逆転写定量PCR解析に使用したプライマー配列。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表3：図13、14および補足図1の統計詳細。 指定された実験比較における生物学的レプリケート数、前提条件の確認、統計解析手法、および正確なP値。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表4：クプロプトーシスおよびフェロプトーシスの共発現変動遺伝子。フェロプトーシス・クプロプトーシス相関遺伝子と変動遺伝子の交差によって特定されたCF-DEGのリスト。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表5：バイオマーカースクリーニングのために選択されたWGCNAモジュール内の遺伝子。その後のバイオマーカースクリーニングのために選択されたWGCNAモジュールに含まれる遺伝子のリスト。WGCNA：加重遺伝子共発現ネットワーク解析。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、バルクトランスクリプトーム解析、機械学習、シングルセル解析、および標的細胞実験を統合し、潰瘍性大腸炎（UC）におけるフェロトーシスとクプロトーシスのクロストークを検討した。UCに関連する5つの診断候補因子が、探索コホートおよび検証コホートの両方で再現され、主に上皮および骨髄系コンパートメントに局在し、Caco-2細胞においてパスウェイ阻害に応じた発現を示した。これらの知見は、計算科学的な優先順位付けに基づいて集中的な生物学的検証を行う段階的なワークフローを支持するものである。なお、これら5つの遺伝子がフェロトーシスまたはクプロトーシスの確立された上流制御因子であるという強い主張は避けている。

CF-DEGは、リポポリサッカライドへの反応、銅のハンドリング、脂質輸送、NF-κB/TNFシグナリング、およびフェロトーシスにおいて濃縮されており、金属依存的な酸化ストレスと粘膜炎症との間に一貫した関連性があることが示された10,19。

これら5つの候補因子は、相補的な炎症および金属ストレスのコンテキストを占めています。LCN2は、鉄の隔離、微生物叢のディスバイオーシス、およびLCN2–ALOX15フェロトーシス軸を連結しています20,21,22,23。IDO1は、トリプトファン代謝、粘膜炎症、および鉄ハンドリングの異常を連結しています24,25,26。CXCL2は、IL-17/IL-22シグナリング、好中球の動員、および脂質過酸化を連結しています27,28,29,30。NOS2はコンテキスト依存的な影響を及ぼしますが、過剰に誘導されると酸化損傷とフェロトーシス感受性を増幅させることがあります31,32,33,34,35,36。CD274は免疫調節上の上皮マーカーであり、FDX1および銅イオン担体感受性との関係から、確立されたパスウェイの制御というよりもむしろクプロトーシスへの応答性を示唆しています37,38,39。阻害剤を用いた実験結果はこれらの分類と一致しており、ferrostatin-1はLCN2、IDO1、CXCL2、およびNOS2を減少させた一方で、tetrathiomolybdateはCD274を減少させました。

免疫分析により、候補シグネチャーとM1マクロファージ、好中球、活性化メモリーCD4⁺ T細胞、および活性化マスト細胞との関連がさらに明らかになり、これらすべてがサイトカイン、活性酸素種、およびバリア破壊シグナリングを通じて上皮損傷を維持し得ることが示された40,41,42,43,44。RELA、hsa-miR-34a-5p、およびhsa-miR-16-5pが妥当な上流調節因子として浮上したが、UCにおけるアンドロゲン受容体の直接的な役割を裏付ける証拠は限定的なままである45,46,47,48,49,50。これらの知見は、直接的な調節の証明ではなく、今後の摂動実験に向けたネットワークレベルの仮説として解釈されるべきである。

シングルセル解析により、LCN2およびNOS2は炎症性結腸細胞に、IDO1、CXCL2およびCD274は単球が豊富な骨髄系細胞集団に局在していることが明らかになりました。炎症性結腸細胞はコミュニケーションハブとして機能することが予測されており、上皮細胞・骨髄系細胞間の主要なリガンド・受容体ペアの一つにAPP–CD74が挙げられます51,52,53,54,55,56。この細胞型レベルでの解像度により、5つの候補を検証すべき生物学的コンテキストが絞り込まれ、次なる実験ステップとして共培養系やオルガノイド・免疫細胞系の利用が支持されます。

解釈を制限するいくつかの限界がある。Caco-2は大腸腺癌細胞株であり、非悪性の大腸上皮、患者の不均一性、間質・免疫相互作用、または慢性潰瘍性大腸炎（UC）を完全に再現しているわけではない。したがって、初代腸上皮細胞、患者由来オルガノイド、共培養系、およびin vivo大腸炎モデルでの検証が必要である。アーカイブされた図13のソーススプレッドシートでは、パネルA、C、およびFにおいて一部のコントロールの反復回数レコードが不足しており、これらの比較の精度が低下している。利用可能なすべての反復回数と正確なP値は、補足表5に開示されている。最後に、年齢、性別、治療への曝露、およびその他の臨床共変量は、公開コホート間で一様に利用可能ではなかった。診断的有用性と因果的役割を確立するためには、前向き多施設共同コホートおよび5つの候補因子の直接的な摂動が必要となる。これらの限界はあるものの、本研究は、金属依存性細胞死、上皮・骨髄系細胞間コミュニケーション、およびUCを関連付ける、透明性があり実験的に裏付けられた一連の仮説を提示している。前立腺癌における同様のネットワーク薬理学研究は、計算による標的優先順位付けの仮説生成価値を示しているが、UC特異的な検証を構成するものではない57。同様に、変形性関節症および骨変性におけるフェロトーシスの最近の議論は、フェロトーシス調節に対するより広範な治療的関心を反映しているが、疾患特異的なメカニズムをUCに直接外挿することはできない58。したがって、バイオインフォマティクス的な関連性を強化し、かつ過剰に主張しないために、外部コホートによる検証と阻害剤を用いた実験が行われた。

開示事項

著者に開示すべき事項はありません。

謝辞

本研究は、国家中薬管理局のYoung Qihuang Scholar Project（助成金番号：2022256）の支援を受けて行われました。また、技術的支援ならびにデータキュレーションおよびバイオインフォマティクス解析への貢献をいただいた、遼寧中医学大学および遼寧中医学大学第三附属病院の研究チームの全メンバーに感謝いたします。

改訂にあたり、英語の編集、文書のフォーマット調整、および図の品質確認を支援する目的のみでOpenAI Codex (OpenAI)を使用しました。すべての科学的内容、解析、引用、および最終的な提示内容は著者によって確認および検証されており、原稿に関する全責任は著者が負います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BCAタンパク質定量キットBeyotime Institute of BiotechnologyP0010標準化のためのタンパク質定量。
Bioinformatics.com.cnBioinformatics.com.cnオンラインプラットフォーム、2026年アクセスGO/KEGG視覚化および解析プラットフォーム。
Caco-2細胞株ATCCHTB-37上皮損傷モデルに使用されたヒト大腸腺癌細胞株。
Cell Counting Kit-8GLPBioGK10001450 nmで測定した細胞生存率アッセイ。
LM22シグネチャーを用いたCIBERSORTCIBERSORT開発者LM2222種類の免疫細胞分画のデコンボリューション。
ChEA3マヤン研究室オンラインプラットフォーム；2026年アクセス転写因子の濃縮解析および制御ネットワークの予測。
CO2 インキュベーター記録されていません該当事項なし培養に使用した加湿インキュベーター（設定温度： 37 °C および5% CO₂2.
銅2+ 蛍光プローブBIOFOUNTCAS 98907-26-7細胞内Cu2+ 蛍光検出
CytoHubbaを用いたCytoscapeCytoscapeコンソーシアムバージョン未記録PPIの可視化およびコアノードのランキング。
ダルベッコ修正イーグル培地Gibco11965092Caco-2細胞培養液
ジメチルスルホキシド記録なし該当なしビークルコントロール
牛胎児血清記録なし翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳したい原文をご提示ください。10%の培地サプリメント。
鉄2+ アッセイキットAbcamab83366細胞内Feの測定2+.
FerrDBFerrDB開発者オンラインデータベース；2026年アクセスフェロトーシス関連遺伝子のソース。
フェロスタチン-1Sigma-AldrichSML0583フェロトーシス抑制剤；最終濃度 4 µM.
ハーモニーブロード研究所/コミュニティバージョンは記録されていませんシングルセルバッチ補正
倒立蛍光顕微鏡OlympusIX71銅2+ 励起波長510nm、蛍光波長578nmでの蛍光イメージング。
リポ多糖記録なし該当なしにおける炎症性傷害刺激 1 µg/mL 24時間。
マロンジアルデヒド測定キットBeyotime Institute of BiotechnologyS0131S脂質過酸化の測定
マイクロプレートリーダー記録なし翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。450 nmにおける吸光度測定。
MonocleBioconductor/コミュニティバージョン 2単一細胞擬似時間解析
分子シグネチャーデータベースブロード研究所c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.HsGSEA用のリファレンス遺伝子セット。
NetworkAnalystNetworkAnalyst開発チームオンラインプラットフォーム；2026年閲覧転写因子およびmiRNAネットワークの統合。
ペニシリン–ストレプトマイシン記録なし翻訳する原文が見当たりません。翻訳対象のテキストをご提示ください。100 U/mLのペニシリンおよび 100 µg/mL ストレプトマイシン
RR Foundation for Statistical Computingバージョン未記録バイオインフォマティクス解析環境
RパッケージセットCRAN/Bioconductorパッケージビルドが記録されていませんlimma、WGCNA、clusterProfiler、glmnet、randomForest、e1071、pROC、およびrmsのワークフロー。
リアルタイムPCRシステム記録なし翻訳するソーステキストが提供されていません。翻訳が必要なテキストを入力してください。SYBR Green RT-qPCR装置
RevertAid 第一ストランド cDNA 合成キットThermo Fisher ScientificK1622～からの第1ストランドcDNA合成 1 µg RNA
SangerboxSangerbox開発者3.0正規化およびComBatバッチ補正。
SeuratSatijaラボ/コミュニティバージョン4シングルセル品質管理、正規化、クラスタリングおよび可視化。
統計解析ソフトウェア記録なし翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。元の細胞実験の統計解析。
申し訳ございません。翻訳対象となるソーステキスト（STRING）が入力されていません。翻訳したい英文をご提示ください。STRINGコンソーシアムオンラインデータベース；2026年アクセスタンパク質–タンパク質相互作用ネットワークの構築
SYBR Green リアルタイムPCR試薬TakaraRR820A定量リアルタイムPCR
TarBaseDIANAツール9.0実験的に裏付けられたmiRNA–遺伝子相互作用
テトラチオモリブデン酸塩Sigma-Aldrich323446銅キレート剤；最終濃度 40 µM.
TRIzol試薬Takara9108全RNA抽出

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