研究記事

ネットワーク薬理学と分子ドッキングにより明らかになった、 회전근개断裂に対する Rhizoma Drynariae（顧慮）の作用機序

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DOI:

10.3791/73695

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2026年10月16日

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1Orthopedic Ward 2, Kaifeng Central Hospital, 2Department of Traumatology and Orthopedics, Affiliated Hospital of Chengde Medical College

この記事について

サマリー

ネットワーク薬理学および分子ドッキングにより、Rhizoma Drynariaeが抗炎症、抗アポトーシス、および血管新生促進を介して複数の標的および経路に作用し、回旋筋腱板損傷を軽減することが明らかになった。

要約

回旋筋腱板損傷（RCI）は、慢性炎症、腱細胞のアポトーシス、血管新生の不全、および細胞外マトリックス（ECM）の調節異常を特徴とする難治性筋骨格系疾患であり、利用可能な臨床的治療法は限られています。本研究では、ネットワーク薬理学と分子ドッキングを用いて、RCIに対するRhizoma Drynariae（RD）の活性成分、主要ターゲット、およびシグナル伝達経路を系統的に調査しました。TCMSP、ETCM、およびSymMapからRDの18種類の活性成分と213個の非冗長ターゲットを特定し、GeneCardsおよびOMIMから870個のRCI関連ターゲットを抽出した結果、71個の重複する候補ターゲットが得られました。タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク解析およびcytoHubbaスクリーニングにより、TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3、およびHMOX1を含む10個のハブ遺伝子が明らかになりました。Gene Ontologyエンリッチメント解析では、炎症反応、酸化ストレス、血管新生、細胞増殖、およびECM組織化が強調され、KEGGパスウェイ解析では、TNF、PI3K-Akt、MAPK、およびHIF-1シグナル伝達経路が関与していることが示されました。分子ドッキングにより、エリオジクティオール、ルテオリン、カテキン、ナリンゲニン、およびアウレウシジンがこれらのコアタンパク質に対して安定した高親和性結合をすることが確認されました。総括して、RDは多成分、多ターゲット、多経路のネットワークを通じて抗RCI効果を発揮し、炎症とアポトーシスの抑制、血管新生の促進、およびECM修復の強化によってRCIを緩和させる可能性があり、これにより臨床応用および実験的検証のための理論的根拠が提供されました。

概要

回旋筋腱蓋損傷（RCI）は、整形外科およびスポーツ医学において最も一般的な肩関節疾患の一つであり、20歳以上の成人の約20％、60歳以上の成人の最大54％に影響を及ぼしています1,2。RCIの病理学的特徴は、腱の変性、炎症細胞の浸潤、過剰な腱細胞のアポトーシス、不十分な新生血管形成、および細胞外マトリックス合成の乱れであり、これらが慢性的な肩の痛み、可動域の制限、筋萎縮、さらには関節の不安定性を引き起こします3。治療を行わない場合、RCIは生活の質（QOL）を著しく低下させ、重い社会経済的負担を強いる可能性があります4。現在のRCIの治療戦略には、保存的治療と外科的修復が含まれます5。非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）やコルチコステロイド注射は痛みを緩和しますが、胃腸管障害、腎機能障害、軟骨変性、および骨粗鬆症のリスクを伴います6,7。外科的修復は短期的には機能を改善させますが、高い再断裂率、術後の癒着、および長期的な治癒品質の低さが課題となっています8,9。したがって、安全で効果的、かつマルチターゲットなRCI治療薬の開発が急務となっています。

中医学（TCM）は、多成分、多標的、低毒性という利点を持ち、筋骨格系疾患の治療において長い歴史を有しています10。 Rhizoma Drynariae（RD）は、Drynaria fortunei (Kunze) J. Sm.の乾燥させた根茎であり、血行を促進し、血瘀を除去し、腱と骨の修復を加速させる代表的な強骨薬です11,12。現代薬理学により、フラボノイドがRDの主要な活性成分であり、抗炎症、抗酸化、骨形成および軟骨保護作用を及ぼすことが確認されています13。RDは、骨粗鬆症、変形性関節症、大腿骨頭壊死、および椎間板変性疾患に広く用いられてきました14,15,16。しかし、RCIに対するRDの有効性とメカニズムを探索した系統的な研究はこれまで行われていません。ネットワーク薬理学は、バイオインフォマティクス、システム生物学、および薬理学を統合した新たな学際的アプローチであり、中医学の包括的なメカニズムを解明するのに最適です17,18。「薬物－成分－標的－パスウェイ－疾患」の調節ネットワークを系統的に構築し、潜在的な治療標的を高スループットで予測することを可能にします19。本研究では、ネットワーク薬理学と分子ドッキング法を組み合わせて、RCI治療におけるRDの活性成分、ハブ遺伝子、およびコアシグナリングパスウェイを探索し、臨床応用および今後の実験的研究のための理論的根拠を提供することを目的としました。

プロトコル

本研究では、匿名化された公開バイオインフォマティクスデータベースのみを使用し、ヒトまたは動物を対象とした実験は行っていない。中国の国家倫理審査規定第32条およびヘルシンキ宣言に従い、倫理承認およびインフォームドコンセントは免除された。本研究で使用したすべての材料は、以下に記載されている。 材料一覧.

研究デザインおよびワークフロー図

成分スクリーニング、ターゲット取得、ネットワーク構築、濃縮分析、および分子ドッキング検証を含む、本ネットワーク薬理学研究の完全なワークフローは、すべての予測データの再現性を確保するため、各ステップにおいて統一されたバイオインフォマティクス標準に従って実施されました（図1）。

RDにおける活性成分のスクリーニング

伝統中国医学システム薬理学データベースおよび解析プラットフォーム（TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）は、生薬システム薬理学に基づいて構築されたオンラインプラットフォームである20。本プラットフォームには、経口バイオアベイラビリティ（OB）、ドラッグライクネス（DL）、血液脳関門、および対応するターゲット情報を含む、天然化合物の薬物動態パラメータが包括的に収集されている。著者はキーワードとして"Rhizoma Drynariae"を入力してTCMSPデータベースに保存されているRDのすべての化学成分を検索し、吸収、分布、代謝、排泄（ADME）指標に基づき、OB ≥ 30% かつ DL ≥ 0.18 の基準を用いて適格な活性成分をスクリーニングした。上記2つの基準を満たした化合物は、RCIに対するRDの治療メカニズムを探索するための候補活性成分として保持された。データベースアクセス日：TCMSP V2.3 [2025-12-08]。エクスポートしたフィールドには、化合物名、OB値、DL値、および対応するターゲットタンパク質のエントリが含まれている。重複する化合物のエントリは手動で削除した。

RDの潜在的なターゲットの収集

研究者は、TCMSP、The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/)21、およびSymMap (http://www.symmap.org/)22の3つの独立したデータベースから、RDの作用標的を抽出した。TCMSPは、生薬、低分子化合物、タンパク質標的、およびヒト疾患の相互関係を記録する、特殊な生薬システム薬理学プラットフォームとして利用された。ETCMは、一般的な中薬の生薬および処方の標準化された情報を統合し、生薬成分、標的遺伝子、パスウェイ、および疾患のデータを記録している。SymMapは、分子メカニズムと症状マッピングを通じて、中医学理論と現代医学を統合している。薬物標的を抽出する際、種は一律にHomo sapiensに設定した。得られた標的タンパク質の未加工配列をUniProtデータベース (https://www.uniprot.org/)23を用いて、すべての標的エントリーを統一された標準遺伝子シンボルに変換した。重複する標的遺伝子を除去し、重複除去後のRD標的セットを疾患標的とのクロス解析用に保存した。データベースへのアクセス日は、ETCM V2.0 [2025-12-10]、SymMap V2.0 [2025-12-11]、UniProt release [2025-12-12]である。著者は、TCMSP、ETCM、およびSymMapから標的タンパク質の未加工エントリーをエクスポートした。UniProtを使用して、タンパク質識別子を公式のヒトHUGO遺伝子シンボルにマッピングした。複数のデータベースに由来する標的の重複を削除し、標的ごとに1つの固有の遺伝子シンボルを保持した。

RCIの潜在的ターゲットの探索

検索キーワード「rotator cuff injury」を用いて、RCIに関連するヒト遺伝子をスクリーニングするために、2つの権威あるデータベースを採用した。GeneCards (https://www.genecards.org/) は、150以上の遺伝学的プラットフォームからマルチオミクスデータを集約し、遺伝子機能のアノテーションを提供している24。Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://omim.org/) は、ヒトの遺伝性疾患を記録しており、遺伝子変異と臨床表現型の相関性を明らかにしている25。遺伝子名およびIDを含むすべてのRCI関連遺伝子のエントリを抽出した。これら2つのデータベースからのデータを統合し、重複を除去することで、ベン図による積集合解析のための病原性遺伝子の完全なプールを得た。データベースアクセス日：GeneCards [2025-12-15]、OMIM [2025-12-21]。検索ワード：「rotator cuff injury」。エクスポートしたフィールドには、疾患に関連するヒト遺伝子名および遺伝子IDが含まれていた。統合後、2つのデータベース間で重複する遺伝子エントリを削除した。種フィルターは Homo sapiens に設定した。

タンパク質間相互作用（PPI）ネットワークの構築

スクリーニング済みのRD標的データセットおよびRCI病原性遺伝子データセットをVennyオンラインプラットフォーム（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）にアップロードし、ベン図を作成して重複する共通遺伝子をスクリーニングした。抽出された共通遺伝子をSTRING v11.5（https://cn.string-db.org/）にインポートし、PPIネットワークを構築した26。STRINGは、5000種以上の2400万個以上のタンパク質をカバーする、検証済みおよび予測されたタンパク質相互作用を抽出した。種はHomo sapiensに設定し、信頼度スコアのカットオフ値を0.7として信頼性の低い相互作用ペアをフィルタリングした。エクスポートしたPPIファイルをCytoscape 3.8.0にインポートし、可視化およびトポロジー解析を行った27。ベン図の算出には、[2025-12-24]にVenny 2.0にアクセスした。STRING v11.5へのアクセス日は[2025-12-28]である。著者は、タンパク質識別子、遺伝子シンボル、および統合相互作用信頼度スコアを含む、TSV形式の完全なタンパク質-タンパク質相互作用テーブルをエクスポートした。

ハブ遺伝子解析

Cytoscape 3.8.0に組み込まれたcytoHubbaプラグインを用いて、各ネットワークノードのトポロジー的特徴を解析した。Maximal Clique Centrality（MCC）スコアが上位10位のハブ遺伝子を選択した。MCCはcytoHubbaに組み込まれたランキングアルゴリズムの一つであり、MCCスコアが高いほど、PPIネットワーク内においてより重要なトポロジー的位置にあることを示す。これらの遺伝子は、ネットワーク全体において中心的な調節効果を及ぼしている。

遺伝子オントロジー (GO) および京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) パスウェイ濃縮分析

RCIに対するRDのすべての重複する治療ターゲットを、種をHomo sapiensに設定してR x64 4.0.3ソフトウェアにインポートした。BioconductorのclusterProfilerパッケージを用いて、GOおよびKEGG濃縮分析を行った。GO分析は、生物学的プロセス（BP）、細胞成分（CC）、分子機能（MF）の3つのモジュールで構成され、ターゲットタンパク質の生物学的挙動、細胞内局在、および生化学的機能を個別にアノテーションした28。KEGG分析では、遺伝子を細胞内シグナル伝達カスケードにマッピングし、多様な生物学的経路におけるターゲットの分布を観察した29。RCIに対するRD介入に関連する、有意に濃縮されたBP、CC、MF用語およびコア経路を抽出し、すべての濃縮結果をプロット用にエクスポートした。なお、有意性の閾値はp < 0.05とした。

分子ドッキングシミュレーション

PPI解析からスクリーニングされたハブ遺伝子はタンパク質受容体として定義され、RD活性成分は低分子リガンドとして設定した。ハブタンパク質と対応する成分との間の天然の結合相互作用を探索するために、分子ドッキングシミュレーションを実施した。リガンドの3次元構造はPubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)30からダウンロードし、受容体の結晶構造はRCSB PDB (https://www.rcsb.org/)31から取得した。受容体構造はAutoDock 432を用い、冗長な水の除去および極性水素の添加を含む前処理を行った。一括ドッキング計算は、Open Babelソフトウェアと併せてAutoDock Vinaにより完了させた。結合自由エネルギーが−7.0 kcal/mol以下である複合体を、上位にランクされたドッキング複合体を示す安定な結合構造と定義した。結合自由エネルギーが−7.0 kcal/mol以下の複合体は、高い分子間親和性を持つ安定な結合構造と定義した。この経験的なカットオフ値は、AutoDock-Vinaを用いた植物性生物活性化合物のin-silico研究において一般的に適用されているが、タンパク質-リガンド相互作用の実験的検証に代わるものではない33。最適な親和性を持つ上位20個のドッキング複合体をPyMOLにインポートし、3次元結合コンフォーメーション図を作成した34。PubChemアクセス日：[2026-02-10]、RCSB-PDBアクセス日：[2026-02-03]。低分子構造は化合物名で、タンパク質受容体構造は遺伝子に対応するPDBアクセッションIDで取得した。

統計解析

すべてのバイオインフォマティクス統計およびマッピングには、R x64 4.0.3、Cytoscape 3.8.0、およびPyMOLを使用した。すべてのエンリッチメント項目において、p < 0.05を統計的に有意な差とした。

結果

RDの有効成分

キーワードとして「Rhizoma Drynariae」を用いてTCMSPから計71種の未精製化学成分を抽出した。次に、ADME基準（OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18）に基づいて二次スクリーニングを行い、経口吸収性と薬物らしさが良好な18種の生物活性成分を最終的に得た。これらの18種の活性成分に関する詳細な基本情報を表1にまとめる。これら18種の化合物が、RCIに対するRDの多成分物質基盤を構成している。

RDの関連遺伝子ターゲット

TCMSP、ETCM、およびSymMapデータベースを用いてRDの有効成分に一致する標的遺伝子を検索し、合計327件の元の標的エントリーを収集した。データの統合および重複する遺伝子シンボルの除去後、その後の交差分析のために213個の非冗長なRDの潜在的標的遺伝子を取得した。

RCIに関連する標的遺伝子

GenecardsおよびOMIMデータベースをキーワード「rotator cuff injury」で検索し、989件のRCI関連遺伝子の生データを取得した。データの統合および重複排除後、RCIの進行に密接に関連する870個の固有のヒト病原性遺伝子を抽出した。

PPIネットワークの構築

213個のRD標的遺伝子と870個のRCI病原性遺伝子の交差分析により、71個の重複遺伝子が同定され、これらはRCI治療におけるRDの潜在的な治療標的として定義されました。交差関係を示すベン図は、Venny 2.0ソフトウェアを用いて作成しました（Figure 2）。これら71個の重複標的をSTRINGにインポートし、RCIに介入するRDのPPIネットワークを構築しました（Figure 3）。全PPIデータをCytoscapeにインポートし、cytoHubbaを用いてMCCスコアが最も高い上位10個のハブ遺伝子（TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3、HMOX1）をスクリーニングしました。これらのMCCトポロジー情報はTable 2にまとめ、Figure 4で視覚化しました。これら71個の共通遺伝子は、RCIに対するRDの治療効果を媒介するコア標的であることを示しています。

GOおよびKEGG濃縮解析

RCI治療におけるRD候補ターゲットの分子メカニズムを探索するため、clusterProfilerパッケージを用いて、重複する治療ターゲットのGOおよびKEGG濃縮分析を行った。BP、CC、およびMFについて、個別にGO濃縮統計を実施した。図5A–B、6A–B、および7A–Bは、BP、CC、およびMFにおいて有意に濃縮された上位10項目を示しており、各図のサブグラフBは各機能用語の遺伝子分布を示している。さらに、RCIに対するRD介入に関与するコアパスウェイを掘り起こすためにKEGG濃縮分析を行い、濃縮された上位30のパスウェイを図8に可視化した。

分子ドッキングシミュレーション

上位10個のハブ遺伝子をタンパク質受容体として設定し、全18種類のRD活性成分をリガンドとして採用し、AutoDock VinaおよびOpen Babelを用いてドッキング計算を行った。リガンドと受容体の結合コンフォメーションはPyMOLで可視化した。ドッキングの結果、ほとんどのハブ標的タンパク質がRD活性成分と安定した結合構造を形成することが示された。最適な結合親和性を持つ上位20個の複合体の完全なドッキングパラメータおよび三次元結合図を表3および図9に記録した。

本ネットワーク薬理学解析において、RDの生物活性成分18種類と、重複のない薬剤関連ターゲット213個を抽出した。これらを870個のRCI関連遺伝子と交差させた結果、71個の共通治療候補ターゲットが得られた。PPIネットワークの構築およびcytoHubba-MCCスクリーニングにより、10個のハブ遺伝子（TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3、HMOX1）を同定した。GOエンリッチメント解析ではBP、CC、MFを網羅し、KEGGエンリッチメント解析では複数の濃縮シグナル伝達経路を特定した。分子ドッキングシミュレーションにより、RDの主要活性成分とこれらのハブターゲットタンパク質との間に良好な結合親和性が認められた。

データの利用可能性：

ターゲットリスト、PPIネットワークファイル、GOおよびKEGGエンリッチメント結果、分子ドッキングマトリックスを含む、本研究で生成されたすべての生データおよび処理済みデータは、Science Data Bankに保存されています。生データのアクセスリンクはhttps://www.scidb.cn/anonymous/alVOVlJuです。

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図1: 本研究で適用したバイオインフォマティクスパイプラインの概略ワークフロー。左側から、候補となる生物活性化合物およびそれに対応するRDターゲットをTCMSP、ETCM、およびSymMapデータベースから取得した。右側では、RCIに関連する遺伝子をGeneCardsおよびOMIMから取得した。これら2つのデータセットから重複する遺伝子ターゲットをベン図を用いて特定し、潜在的な治療ターゲットとして定義した。共有ターゲットはその後、2つの異なるブランチで処理された。一方のブランチではSTRINGおよびCytoscapeを用いてタンパク質相互作用ネットワークを構築し、もう一方のブランチではRパッケージのclusterProfilerを用いてGOおよびKEGGエンリッチメント解析を行った。PPIネットワークから抽出されたハブ遺伝子は、その後モレキュラードッキングによってさらに検証され、構造準備およびシミュレーションはPubChem、PDB、AutoDock Vina、およびPyMOLを用いて完了した。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = rotator cuff injury、TCMSP = The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform、ETCM = The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine、OMIM = The Online Mendelian Inheritance in Man、GO = gene ontology、KEGG = Kyoto encyclopedia of genes and genomes。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図2: RDとRCIの間で重複するターゲットのベン図。 青色の円はRCIに関連するターゲットを表す。黄色の円はRDの潜在的な治療ターゲットを表す。重複しているオリーブ色の領域は、RDとRCIで共通するターゲットを示す。各領域内の数値とパーセンテージは、固有または共通のターゲットの数と割合を表す。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = rotator cuff injury。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図3:RDとRCIを関連付ける71個の重複遺伝子ターゲットから生成されたPPIネットワーク。ネットワーク内の各円はターゲット遺伝子を表し、公式の遺伝子シンボルでラベル付けされている。2つの円を結ぶ線は、公開バイオインフォマティクスデータベースから抽出されたタンパク質間相互作用を示している。ノードの大きさと色の彩度は、ネットワーク内における個々の遺伝子のトポロジー的な重要性を反映している。円が大きく緑色が濃い遺伝子ほどトポロジー的に高いスコアを持ち、より中心的な位置を占めている。小さく淡い黄色の円は、トポロジー的な重要性が低い遺伝子を示している。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = rotator cuff injury、PPI = protein-protein interaction。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 4: cytoHubbaプラグインを用いてPPIネットワークから特定された上位10個のハブ遺伝子。長方形のボックスはハブ遺伝子を表し、それぞれに公式の遺伝子シンボルが付記されている。ボックス間を結ぶ黒線は、これらのコアターゲット間のタンパク質相互作用を示す。明るい赤からオレンジ、黄色へと変わる色のグラデーションは、cytoHubbaプラグインによって算出されたMCCスコアに基づくハブ遺伝子のランキングを可視化したものである。明るい赤のボックスはMCCスコアが最も高く、ネットワークにおける重要性が最大である遺伝子を示し、黄色のボックスは相対的にスコアが低い遺伝子を示す。略語：PPI = protein-protein interaction（タンパク質-タンパク質相互作用）、MCC = Maximal Clique Centrality（最大クリーク中心性）。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図5RDのRCIに対する71個の共通標的遺伝子のBP濃縮分析。 (A) BPの潜在的な治療標的におけるGO濃縮分析。上位10個の有意に濃縮されたGO生物学的プロセス項を示す横棒グラフである。水平方向のX軸は遺伝子数を示しており、各GO項にアノテーションされた標的遺伝子の数に対応している。垂直方向のY軸には、個々の濃縮されたGO項が列挙されている。右側の連続的なカラーバーは-log10(p値)を符号化しており、暖色系の赤色は-log10(p値)が高く統計的有意性が強いことを示し、寒色系の紫色や青色は有意性が低いことを示す。(B潜在的な治療標的とBP（生物学的プロセス）との関係。パネルBは、濃縮されたGO用語と対応する標的遺伝子のペアワイズ相関を示すコードダイアグラムである。外周の円弧セグメントは2つのカテゴリーに分かれており、色付きのブロックは個別のGO生物学的プロセス用語を、灰色の長方形のティックは個々の標的遺伝子シンボルを示す。円内の曲線リボンはGO用語と一致する標的遺伝子を結んでおり、各リボンは1つの遺伝子をそれが関与するGO用語にマッピングしている。各リボンの色は、外周の対応するGO用語の色を継承している。下部の凡例は、各色をそれぞれのGO用語に関連付けている。略語：RD = 貫鐘龍骨（カンショウリュウコツ）, RCI = 回旋筋腱板断裂, BP = 生物学的プロセス, GO = ジーンオントロジー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6: RCIの治療におけるRDの71個の候補ターゲットから導出されたGO-CC用語。 (A>) 細胞成分（CC）に対する潜在的な治療ターゲットのGOエンリッチメント解析。 (B>) 潜在的な治療ターゲットとCCとの関係。パネルAは、有意に濃縮された上位10個のGO細胞成分エントリを示す水平棒グラフである。水平X軸は、各GO用語に割り当てられたターゲット遺伝子数を定量化したもので、「Counts」として表記されている。濃縮されたGO細胞成分の記述は、垂直Y軸に沿って配置されている。右側のカラーバーは、色の変化を-log10(pvalue)値に対応させており、明るい赤色はより高い-log10(pvalue)値と強い統計的有意性を示し、青色の色調はより低い有意性レベルを表している。パネルBは、濃縮されたGO細胞成分用語とそれに関連するターゲット遺伝子との接続を可視化したコードダイアグラムである。外環のセグメントは2つのグループに分かれており、色付きのブロックは個別のGO細胞成分用語を、グレーの目盛りは個々のターゲット遺伝子シンボルを示す。円内部の曲線的なリボンは、各遺伝子と対応するGO用語を連結しており、各リボンは外環の対応するGO用語の色を採用している。下部の凡例は、すべてのGO細胞成分カテゴリーの色分けを定義している。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = 回旋筋腱板断裂、CC = 細胞成分、GO = ジーンオンソロジー ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

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図 7: RCI介入におけるRDの71個の重複標的遺伝子に対して行われたMF濃縮分析。(A>) MFの潜在的な治療標的のGO濃縮分析。(B>) 潜在的な治療標的とMFの関係。パネルAは、有意に濃縮された上位10個のGO分子機能（molecular function）用語をランク付けした横棒グラフである。水平のX軸の値は遺伝子数を示し、これは各分子機能エントリにアノテーションされた標的遺伝子の総数に対応する。垂直のY軸には個々のGO分子機能の記述が記載されている。右側のカラーグラデーションバーは、色の変化を-log10(pvalue) 指標に変換したものである。明るい赤色は高い-log10(pvalue) 値と強い統計的有意性に対応し、青色の色調は有意性が低いことを示す。パネルBは、濃縮されたGO分子機能カテゴリーと、それに関連する標的遺伝子との関係をマッピングしたコードダイアグラムである。外環のセグメントには2種類のラベルが含まれている。色の付いたブロックは個別のGO分子機能用語を示し、小さな灰色の長方形のティックは個々の標的遺伝子シンボルを示す。外環から内側へ伸びる曲線状のリボンは、各遺伝子を一致する機能用語に接続しており、各リボンは対応するGO用語に割り当てられた色を継承している。下部の凡例は、プロットに示されているすべてのGO分子機能カテゴリーの色分けを定義している。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = rotator cuff injury、MF = molecular function、GO = gene ontology この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 8: RCIに対するRDの71個の共通ターゲット遺伝子のKEGGパスウェイ富化分析。 このドットプロットは、上位に富化したKEGGパスウェイを可視化したものである。垂直方向のY軸は、個々の富化したパスウェイの名前を示している。水平方向のX軸はGeneRatioを表し、これはパスウェイにマッピングされたターゲット遺伝子の数と、そのパスウェイに含まれる全遺伝子数の比として定義される。各円形のドットは、1つの富化したパスウェイに対応している。ドットの大きさは遺伝子数に対応し、円が大きいほど、そのパスウェイにアノテーションされたターゲット遺伝子数が多いことを示す。ドットの色はp値を反映しており、赤色はp値が低く統計的有意性が強いことを示し、濃い青色はp値が高く統計的有意性が弱いことを示す。2つのサイドレジェンドで、遺伝子数とp値の色マッピングのスケールが個別に定義されている。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = 回旋筋腱板断裂、KEGG = 京都遺伝子・ゲノム百科事典。 こちらのリンクから本図の拡大版をご覧いただけます。

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図 9: 上位にランクされたドッキング複合体。 (A) (PTGS2, eriodictyol, -9.7 kcal/mol)。 (B) (PTGS2, luteolin, -9.6 kcal/mol)。 (C) (PTGS2, catechin, -9.5 kcal/mol)。 (D) (PTGS2, naringenin, -9.5 kcal/mol)。 (E) (PTGS2, Aureusidin, -9.4 kcal/mol)。 (F) (PTGS2, kaempferol, -9.2 kcal/mol)。 (G) (PTGS2, chroman, -9.1 kcal/mol)。 (H) (TNF, catechin, -9.1 kcal/mol), (I) (PTGS2, digallate, -9 kcal/mol)。 (J) (TNF, digallate, -9 kcal/mol), (K) (PPARG, chroman, -8.9 kcal/mol); (L) (PPARG, naringenin, -8.9 kcal/mol), (M) (TNF, Aureusidin, -8.9 kcal/mol); (N) (TNF, kaempferol, -8.8 kcal/mol); (O) (MAPK3, chroman, -8.7 kcal/mol); (P) (MAPK3, naringenin, -8.7 kcal/mol); (Q) (PPARG, Aureusidin, -8.7 kcal/mol); (R) (PPARG, kaempferol, -8.7 kcal/mol); (S) (PTGS2, 22_Stigmasten_3_one, -8.7 kcal/mol); (T) (MAPK3, luteolin, -8.6 kcal/mol)。パネルAからTは、それぞれの標的タンパク質の結合キャビティ内における個々の低分子化合物の計算された結合様式を個別に示している。シアン色のスティックモデルは、タンパク質結合キャビティを形成するアミノ酸残基を表している。低分子リガンドは、異なる化学構造を区別するためにマゼンタ色または緑色のスティックで描かれている。黄色の破線はリガンドとポケット残基間の分子間水素結合を示し、数値注釈はオングストローム (Å) 単位の水素結合距離を示している。半透明の白色表面は、各タンパク質受容体の全体的な3Dトポロジーの概形を示している。すべての結合ポーズ計算は、AutoDock Vina ソフトウェアを用いたリジッドレセプター分子ドッキングにより実施された。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

分子ID分子名経口バイオアベイラビリティ(OB) (%)ドラッグライクネス（DL）
MOL001040(2R)-5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)クロマン-4-オン42.360.21
MOL001978アウレウシジン53.420.24
MOL002914エリオジクティオール (フラバノン)41.350.24
MOL000449スティグマスターロール43.830.76
MOL000358β-シトステロール36.910.75
MOL000422ケンフェロール41.880.24
MOL004328ナリンゲニン59.290.21
MOL000492(+)-カテキン54.830.24
MOL005190エリオディクティオール71.790.24
MOL000569ジガレート61.850.26
MOL000006ルテオリン36.160.25
MOL00906122-スティグマスター-3-オン39.250.76
MOL009063シクロラウデノール酢酸エステル41.660.79
MOL009075シクロアルテノン40.570.79
MOL009076シクロラウデノール39.050.79
MOL009078ダバリオサイドA62.650.51
MOL009087マリオサイドQT70.790.19
MOL009091キサントガレノール41.080.32

表 1： RD由来の18種類の候補生物活性成分の薬物動態プロファイル。 化合物はTCMSPデータベースから抽出し、2つのADME関連しきい値（OB ≥ 30% および DL ≥ 0.18）を用いてフィルタリングした。各列は、スクリーニングされた各成分のTCMSPアクセッション番号（Mol ID）、化合物名、算出されたOB値（%）、およびDLスコアを示している。略語：RD = Rhizoma Drynariae、RCI = 回旋筋腱板断裂、ADME = 吸収、分布、代謝、排泄、TCMSP = The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform、OB = 経口バイオアベイラビリティ、DL = 薬物様性。

順位遺伝子名称スコア
1TNF腫瘍壊死因子328291218366500
2IL6インターロイキン6328291215913592
3VEGFA血管内皮増殖因子A328291215896284
4PTGS2プロスタグランジン端過酸化物合成酵素2328288656326402
5CASP3カスパーゼ3328288180323600
6AKT1AKTセリン/スレオニンキナーゼ1328287745700516
7CCL2C-Cモチーフケモカインリガンド2328161521686320
8PPARGペルキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ325302724852296
9MAPK3ミトゲン活性化プロテインキナーゼ3308779166166218
10HMOX1ヘムオキシゲナーゼ1299171945318400

表2：PPIネットワークから特定された上位10個のハブ遺伝子。遺伝子はCytoscape内のcytoHubbaプラグインによって算出されたMCCスコアに基づいて順位付けされた。MCCはcytoHubbaのトポロジカル指標であり、数値が大きいほどネットワーク内でのトポロジカルな重要性が高いことを示す。各列には、順位、公式遺伝子シンボル、完全な遺伝子名、および各ハブ遺伝子の対応するMCC生のスコアが示されている。略語：PPI = タンパク質-タンパク質相互作用、MCC = Maximal Clique Centrality。

受容体リガンド自由エネルギー (kcal/mol)図9の対応するシリアル番号
PTGS2エリオジクチオール-9.7A
PTGS2ルテオリン-9.6B
PTGS2カテキン-9.5C
PTGS2ナリンゲニン-9.5D
PTGS2アウレウシジン-9.4E
PTGS2ケンフェロール-9.2F
PTGS2クロマン-9.1G
TNF（腫瘍壊死因子）カテキン-9.1H
PTGS2ジガレート-9I
TNF（腫瘍壊死因子）ジガレート-9J
PPARGクロマン-8.9K
PPARGナリンゲニン-8.9L
TNF（腫瘍壊死因子）アウレウシジン-8.9M
TNF（腫瘍壊死因子）ケンフェロール-8.8N
MAPK3クロマン-8.7O
MAPK3ナリンゲニン-8.7P
PPARGアウレウシジン-8.7Q
ペルキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマケンフェロール-8.7R
PTGS222_スティグマステロン_3_one-8.7S
MAPK3ルテオリン-8.6T

表3：選出された20種類のレセプター-リガンド複合体における分子ドッキング結合親和性の結果。 各行には、レセプタータンパク質、低分子リガンド、算出された結合自由エネルギー (kcal/mol)、および図9における対応するサブプロットのラベルが記載されている。自由エネルギーの値がより負であるほど、タンパク質ポケットとリガンド化合物の間の結合安定性がより強いことを示す。略語：PTGS2 = プロスタグランジン末端過酸化物合成酵素2、TNF = 腫瘍壊死因子、PPARG = ペルキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ、MAPK3 = ミトゲン活性化プロテインキナーゼ3。

ディスカッション

RCIは、慢性炎症、過剰な腱細胞アポトーシス、血管新生の障害、および不十分な細胞外マトリックスのリモデリングを伴う複雑な筋骨格系疾患であり、これらの病理学的変化が組み合わさることで、腱-骨癒合の不全と臨床的予後の悪化を招きます35。本疾患は多くの場合、急性外傷や長期的な肩の使いすぎによって発生し、持続的な炎症が腱細胞外マトリックスの代謝バランスを崩します36。臨床的には、現在の治療法では複数の病理学的連鎖を同時に標的とすることができず、結果として効果が限定的であり、再発率が高くなっています37。RDは、骨を強化し、血行を促進し、組織修復を促す伝統的な中薬（TCM）であり、古くから骨や腱の損傷の治療に臨床的に用いられてきました38。しかしながら、RCIに対するRDの正確な分子調節メカニズムについては、既存の研究において系統的な分析がなされていません。

上述の研究背景に基づき、本研究ではネットワーク薬理学と分子ドッキングを用いて、RDによるRCIに対する多成分、多標的、多経路のメカニズムを体系的に明らかにします。これまでの植物化学および薬理学的研究により、RD由来のフラボノイドが顕著な抗炎症作用、抗酸化作用、抗アポトーシス作用、および血管新生促進の生物学的活性を有することが十分に検証されており、これらが組織修復機能の核心的な物質的基礎となっています39。先行研究の結果と一致して、RDから計18種類の活性成分が同定され、その中でもeriodictyol、luteolin、catechin、naringenin、およびaureusidinがコア成分として認識されました。多くの植物化学的研究により、フラボノイドがRDの主要な薬力学的物質であることが証明されています40。このような低分子化合物は組織障壁を透過し、損傷した腱の修復マイクロ環境に対して包括的な調節効果を及ぼすことができます41。良好なADME特性により、優れたOB（経口生物学的利用能）と薬物様性が確保されており、RCIに対する天然の治療薬としての潜在性が支持されています。単一標的の化学合成薬とは異なり、これらの天然フラボノイドは炎症、酸化能損傷、細胞生存、および血管新生に同時に介入することができ、慢性退行性腱病変に対して独自の優位性を示します42。

蓄積された研究により、RCIの発生と進行は複数の機能遺伝子の異常発現と密接に関連していることが確認されており、腱の炎症、アポトーシス、および組織再構築の病理学的プロセスにさまざまなコア遺伝子が関与していることが証明されている43。既知のRCIの遺伝子調節メカニズムに基づき、本研究ではRDの治療標的をさらに探索した。その結果、RCIに対するRDの潜在的な治療標的として71個の重複標的が特定された。PPIネットワーク解析により、10個のハブ遺伝子（TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3、およびHMOX1）が抽出された。このうち、TNFおよびIL6は、炎症カスケードを誘発し、腱細胞の増殖を抑制し、細胞外マトリックスの合成を抑制することで腱損傷を悪化させる重要な前炎症性サイトカインである44。これら2つのサイトカインが大量に放出されると、免疫細胞がリクルートされ、炎症反応が増幅し、腱幹細胞の増殖が抑制される45。VEGFAは損傷部位での新生血管形成を促進し、局所の血流を改善し、治癒組織の機械的強度を高める46。腱と骨の界面は本来的に血管が乏しく、新生血管の不足は損傷後の治癒品質が不十分になる主要な要因である47。PTGS2は炎症性疼痛およびプロスタグランジン産生を媒介し、CASP3は腱細胞アポトーシスの主要な実行因子である48,49。PTGS2の過剰発現は炎症性腫脹と疼痛を悪化させ、CASP3の高い活性化は機能的な腱細胞の持続的な喪失を誘導する50,51。AKT1およびMAPK3は、腱の再生に不可欠な細胞の生存、増殖、および分化を調節するコアキナーゼである52,53。これら2つのキナーゼが適度に活性化されることで、修復細胞の活性が維持され、細胞外マトリックスの沈着が促進される54。CCL2は炎症細胞をリクルートし、一方でPPARGおよびHMOX1は抗炎症作用および抗酸化作用を及ぼす55,56,57。これら2つの遺伝子は酸化ストレスを緩和し、局所の腱組織における過剰な炎症浸潤を減少させることができる58。総じて、これらのハブ遺伝子は、RCIにおける炎症、アポトーシス、血管新生、および組織再構築を調節するコア調節ネットワークを形成している。

既存の病理学的研究により、RCIの病理学的進行は主に炎症反応、酸化ストレス、異常な細胞増殖、および細胞外マトリックス組織の乱れによって引き起こされることが明らかになっており、これらがRCIの発生と修復における主要な病理学的リンクとなっています59。これに基づき、本研究ではGO濃縮分析を行い、RCIに介入するRDの潜在的な生物学的メカニズムを探索しました。これらの生物学的プロセスは、まさに病変の発生から修復に至るRCIの主要な病理学的リンクであり、RDが複数の病理学的プロセスに同時に作用できることを示唆しています60。多くの先行メカニズム研究により、TNFシグナル伝達経路、PI3K-Aktシグナル伝達経路、MAPKシグナル伝達経路、およびHIF-1シグナル伝達経路が、腱の炎症、細胞修復、および組織再構築を調節する重要なシグナル伝達経路であることが確認されています61,62,63,64。RCI治療におけるRDの潜在的なシグナル伝達メカニズムをさらに探索するため、本研究では上記の研究基盤に基づいてKEGGパスウェイ濃縮分析を実施しました。その結果、RCIに対するRDの作用には、主に上述の4つのパスウェイが関与していることが明らかになりました。TNFシグナル伝達経路は炎症反応と腱細胞のアポトーシスを促進し、腱の炎症性変性のアップストリームドライバーとして機能します65。PI3K-Aktパスウェイは細胞生存と血管新生を亢進させ、これらは腱の治癒に有益であり、また複数の成長因子を協調させて線維芽細胞のコラーゲン分泌を促進させることができます66,67。MAPKシグナル伝達経路は細胞の増殖、分化、および細胞外マトリックス合成を調節し、腱再構築の全プロセスに関与します68。HIF-1シグナル伝達経路は低酸素状態に反応して血管再生を促進し、損傷した腱の低酸素微小環境を効果的に改善します69。これらのパスウェイはクロストークし、複雑な調節ネットワークを形成しており、RCI治療におけるRDのマルチパスウェイ特性を十分に体現しています。

分子ドッキングは、ネットワーク薬理学研究において日常的かつ補助的な検証方法となっており、有効成分とコアターゲット間の結合活性を直接的に特徴付けることができます。したがって、本研究では分子ドッキングを用いてネットワーク薬理学の予測結果を検証しました70。その結果、RDの主要なフラボノイド成分がハブタンパク質の活性ポケットに安定して結合することが示され、ネットワーク薬理学的予測の信頼性がさらに検証されました。これらの安定した結合様式は、RDが主要なターゲットに直接作用して治療効果を発揮する可能性を示唆しています。フラボノイドリガンドとハブタンパク質の活性部位との間の強固な結合は、直感的な分子相互作用の証拠を提供し、その後の細胞機能検証実験のための候補化合物をも提示しています。

本研究にはいくつかの限界がある。第一に、予測は公開データベースのバイオインフォマティクス解析に依存しており、十分に研究されているタンパク質へのアノテーションバイアスが生じている可能性がある。回旋筋腱特異的な遺伝子発現およびタンパク質アイソフォームは組み込まれておらず、STRING由来の非方向性PPIネットワークでは、腱特異的な生物学的特性を完全に再現することはできない。TNF、PI3K-Akt、MAPKなどの濃縮されたパスウェイは、RD特有のシグネチャではなく、一般的な炎症カスケードを表している。公開オミクスリソースでは、ヒト回旋筋腱組織のin vivoでの動的な病理学的変化や個体差を再現することはできない。今後の研究では、シングルセルRNAシーケンシングデータセットを統合し、メカニズムの解釈を精緻化することが考えられる。第二に、化合物スクリーニングには経験的なADMEカットオフ値（OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18）が使用されており、経口バイオアベイラビリティの低い生物活性化合物が除外されている可能性がある。分子ドッキングでは剛体受容体設定が採用されており、タンパク質の柔軟性や構造水分子が無視されており、また生物物理学的な検証（SPR、ITCなど）も行われていない。陽性対照薬、感度分析、毒性評価、および完全な薬物動態プロファイリングは実施されなかった。すべての出力は計算上の予測であり、標的パスウェイの機能および成分とハブ遺伝子の調節関係を検証するには、in vitroの細胞実験およびin vivoの動物実験が必要である。第三に、複数のRD構成成分間の相乗的な相互作用およびそのin vivoでの薬物動態挙動は未解明のままである。この生薬の成分間クロストークおよび代謝プロファイルを解明するには、体系的な実験的検討が必要である。本研究は、RDが多成分、多標的、多パスウェイの調節ネットワークを通じてRCIを治療することを体系的に明らかにした。RDは、TNF、PI3K-Akt、MAPK、およびHIF-1シグナル伝達経路を介して、炎症の抑制、腱細胞アポトーシスの減少、血管新生の促進、および細胞外マトリックス修復の強化により治療効果を発揮すると考えられる。これらの知見は、RCIにおけるRDの臨床応用およびメカニズム研究のための強固な理論的根拠を提供するものである。

開示事項

著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的な関係がない状態で実施されたことを宣言します。

謝辞

著者らは、TCMSP、ETCM、SymMap、GeneCards、OMIM、STRING、UniProt、PubChem、RCSB‑PDBを含む、本研究で使用した公開バイオインフォマティクスリソースの開発者および維持管理者に感謝いたします。これらのオープンアクセスデータベースによって提供された公開データセットが、本研究で述べられている計算解析を支えました。本研究は外部資金を受けていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AutoDock VinaScripps Research InstituteV1.2.0タンパク質-リガンド結合シミュレーション用分子ドッキングソフトウェア; RRID: Not available. URL: https://github.com/ccsb-scripps/AutoDock-Vina
clusterProfilerBioconductorV3.2.14GOおよびKEGG濃縮解析用Rパッケージ; R 4.0.3互換; RRID: SCR_016884. URL: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
cytoHubba National Taiwan University(Cytoscape plugin)V0.1トポロジカル指標によるハブ遺伝子スクリーニング用Cytoscapeプラグイン; RRID: SCR_006556. URL: https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
CytoscapeInstitute for Systems BiologyV3.8.0ネットワーク可視化および解析用ソフトウェア;  RRID: SCR_003032. URL: https://cytoscape.org/
ETCM (Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine)Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical SciencesV2.0中薬成分、ターゲット、処方のキュレーションデータベース; RRID: Not available. URL: http://www.tcmip.cn/ETCM2/front/#/
GeneCardsWeizmann Institute of Science—定期的なメジャーリリースと漸進的な更新が行われる統合ヒト遺伝子データベース; 2025-12-15にデータ取得; RRID: Not available. URL: https://www.genecards.org
Open BabelOpen Babel development team—グローバルなリリースバージョンを持たない、日々更新される遺伝子-表現型データベース; 2026-02-16にデータ取得; RRID: Not available. URL: https://omim.org
OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)Johns Hopkins University—分子ファイル変換用のオープンソース化学情報学ツールキット; 2025-12-21にデータ取得; RRID: Not available. URL: https://openbabel.org/
PubChemNational Center for Biotechnology Information (NCBI)—グローバルな固定リリースなく継続的に更新される公開化学データベース; 2026-02-10に化合物データを取得; RRID: Not available. URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOLSchrödinger, LLCV2.5タンパク質-リガンド構造の可視化およびレンダリング用ソフトウェア; RRID: SCR_000305. URL: https://pymol.org
R softwareR Foundation for Statistical ComputingV4.0.3統計計算およびグラフィックス環境; RRID: SCR_001905. URL: https://cran.r-project.org
RCSB PDBRCSB Protein Data Bank—タンパク質3次元構造の公開アーカイブ; 各PDBエントリーは独立したバージョン管理が行われている; 2026-02-03に構造ファイルを取得; RRID: SCR_012820. URL: https://www.rcsb.org
STRINGELIXIRV11.5既知および予測されるタンパク質-タンパク質相互作用のデータベース; RRID: SCR_005223. URL: https://string-db.org
SymMapChina Academy of Chinese Medical SciencesV2.0生薬、成分、ターゲット、および症状を関連付ける統合データベース; RRID: Not available. URL: http://www.symmap.org
TCMSPNorthwest A&F UniversityV2.3成分、ターゲット、およびADME特性を含む中薬システム薬理学データベース; RRID: Not available. URL: https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php
UniProtEuropean Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)—計画的なリリースと継続的な更新が行われる包括的なタンパク質配列およびアノテーションデータベース; 2025-12-12にデータ取得; RRID: SCR_002380. URL: https://www.uniprot.org
VennyBioinfoGP, Spanish National Centre for BiotechnologyV2.0ベン図の作成および遺伝子セットの重複抽出用ウェブベースツール; RRID: SCR_016561. URL: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html

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