このプロトコルでは、結晶質溶液で灌流させたマウスの単離心臓を用いたex vivo心筋梗塞モデルについて説明します。この手法により全身性の変数を排除できるため、心筋細胞の生存に影響を及ぼす可能性のある外因的な要因がない状態で、心臓への影響を直接的に評価し、局所的な薬剤介入を試験することが可能になります。
方法論記事
結晶質溶液灌流マウス心臓におけるEx Vivo心筋梗塞モデル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
実験的心筋梗塞（MI）は、通常、動物において左前下降（LAD）冠動脈の一時的な閉塞によって、または細胞レベルでは低酸素・再酸素化プロトコルによってモデル化されます。虚血の代替的な臓器レベルモデルとして、ラングンドルフ灌流心は、心保護に対する生理学的変動および薬理学的介入の影響を調査するための不可欠なツールであり続けています。 ここでは、単離マウス心において局所心筋虚血/再灌流モデルを確立するために必要な基本的手法と基本原則を提示します。簡潔に述べると、心停止後、氷冷PBSで短時間洗浄し、LADを結紮しました。その後、心臓をラングンドルフ装置に固定し、110 cmH₂Oの一定灌流圧の下、37°Cで栄養豊富な酸素化緩衝液を灌流させました。心筋虚血時間を30、45、60、90、120分に設定し、続いて90分間の再灌流を行いました。心筋細胞の生存能および梗塞サイズは、顕微鏡を用いた2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色法により評価しました。その結果、このex vivo MIモデルでは、虚血時間が延長するにつれて梗塞領域内の生存心筋細胞が漸次的に消失するという、再現性の高い心筋損傷が確実に得られることが示されました。さらに、TTCに基づいた梗塞心筋の明確な描出を行うには、少なくとも30分間の再灌流が必要でした。 このアプローチは全身性の変数を排除するため、循環性液性因子や免疫細胞の浸潤など、MIの進行を妨げる可能性のある外的調節因子の影響を受けずに、心臓への影響を直接評価し、局所的な薬剤介入を試験することを可能にします。したがって、ex vivo MIモデルは、心筋細胞に直接作用する心保護メカニズムを調査するための有用なプラットフォームとなります。
概要
心筋梗塞（MI）は、冠血流が停止し、組織死と深刻な機能障害が引き起こされることで発生します。通常は個体全体で研究されますが、この用語は、特定の心臓構造に限定された局所的なMIや、全身的な影響を除外して梗塞を研究するために用いられるex vivoの単離心臓実験モデル（例：Langendorff灌流）を指す場合もあります1。そのため、Langendorff灌流心は、50年以上にわたり、心筋虚血性障害を研究するための堅牢で確立された実験モデルとして利用されてきました2。
摘出心を用いたex vivo心筋梗塞（MI）モデルには、実験環境を精密に制御できることや、循環 humoral 因子、血液成分、神経体液性調節などの全身的な影響から独立して、薬理剤などの介入が心筋に及ぼす直接的な影響を評価できることなど、いくつかの利点があります3。これらの交絡因子を最小限に抑えることで、ex vivoモデルはin vivoモデルよりも予測可能性と再現性の高いアプローチを提供し、それによってMIに関与する疾患プロセスや分子経路の厳密な調査を促進します4。
摘出心においては、心筋虚血を全般的または局所的に誘導することが可能です5。全般的MIモデルでは、冠循環全体の灌流液フローが完全に遮断されますが、局所的MIモデルでは、左前下降枝（LAD）のみを結紮によって一過性に閉塞させ、結紮部位より遠位の心筋に限定した虚血性損傷を誘発します。全般的MIモデルは技術的な実施は容易ですが、心保護の研究への適用を制限するいくつかの限界があります6。大きな限界の一つは、虚血の持続時間が心臓全体の耐久性に制約されるため、長時間虚血の誘導が困難であり、全層梗塞の可能性がin vivoでの状況と同程度になることです7。さらに、ex vivoモデルは、虚血および再灌流の時間を厳密に制御すれば一般的に優れた再現性を示しますが、これらのプロトコルは研究室間で大きく異なります。このようなばらつきは、特に多くの重要な手法上の詳細が文献で十分に記述されていないため、摘出マウス心のさらなる標準化と特性評価の必要性を浮き彫りにしています8。
一方で、局所的な心筋梗塞（MI）モデルの構築は技術的な難易度が高くなります。本稿では、特に心保護を目的とした薬理学的介入の評価に向けて、単離マウス心臓において信頼性の高いex vivo MIを誘導するためのいくつかの修正点と実践的な戦略を提示します9,10。したがって、ランゲンドルフ灌流マウス心臓を用いたこの修正ex vivo MIプロトコールは、治療的介入後の心筋生存率を直接評価するための効果的なプラットフォームを提供します。
プロトコル
ここで説明する単離灌流心モデルは急性かつ非生存性の実験であり、地元当局（ドイツ、ノルトライン＝ヴェストファーレン州LANUV、O1019/25）の承認を受けています。すべての手順は、ARRIVEガイドラインおよびNIHの実験動物のケアおよび使用に関するガイドに従って実施されました。実験に必要な機器および化学物質は、材料表に記載されています。
1. 摘出マウス心臓のためのラゲンドルフ後方灌流系のセットアップ
注：酸素化クリスタロイド灌流液（Krebs-Henseleit緩衝液、KHB）を、110 cmH2Oの一定圧で単離マウス心臓に送るため、非再循環式の重力駆動システムを設計した（図1A）。
- システムの組み立て前に、ランゲンドルフ装置のガラス器具を0.1 M/L HClおよび100%エタノールで洗浄し、その後、蒸留水ですすぐ。
- 以下の最終濃度（mM）に従い、2 Lの修飾KHB調製に必要なすべての化学物質を量り取る：116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 sodium pyruvate。
- CaCl₂を除くすべての化学物質を、2 Lのフラスコ内で二回蒸留水に溶解させ、pHを7.4に調整するため、Carbogen（95% O₂/5% CO₂）を少なくとも10分間連続的にバブリングさせる。
- 沈殿を防ぐため、その後、溶液にCaCl₂を加える。
- さらに10分間、溶液にCarbogenをバブリングし続ける。
- 冠状動脈の微小血管を閉塞させる可能性のある微粒子を除去するため、KHB溶液を0.2 µmメンブレンフィルターを用いて真空ろ過する。
- ろ過したKHB溶液を、37 °Cに維持された予熱済みウォーターバス内の2 Lガラスリザーバーに移す。
- KHBリザーバーをガラス圧力カラムに接続し、リザーバー内のCarbogenガスによって生成される圧力により、酸素飽和KHBが連続的にカラムに充填されるようにする。
- 流出チューブシステムに気泡がないことを確認する。
- 実験開始前に、KHB溶液をさらに30分間Carbogenで平衡化させる。
2. 心臓の摘出およびカニューレ挿入
注意：本実験では、体重 20–25 g の雄 C57BL/6J マウスを使用した。すべての実験手順は、根拠、日付、安楽死の方法を含め、地域の規制に従って適切に記録されなければならない。
- マウスを5% isoflurane (v/v) を含む導入チャンバーに静かに置き、麻酔を導入する。
- 足指を強くつまんでも反応が完全に消失していることで麻酔深度を確認し、手術台へ移動させる。呼吸の停止および下半身の筋緊張の消失を確認し、頚脱法により直ちにマウスを安楽死させる。
- 胸郭を胸骨に向かって両側から切開し、心臓と上行大動脈を完全に露出させる。
- ピンセットで心外組織を掴み、心臓を摘出する。
- 心停止を誘導するため、心臓を50 mLの氷冷KHB溶液を入れた小型の冷却済みビーカーに少なくとも30 sの間浸す。
注：心活動は温度に非常に敏感であるため、氷冷KHB溶液に浸すことで心臓を完全に停止させる。 - 3方活栓に接続されたカニューレシステムを設置した金属製ディッシュ内の、あらかじめ冷却しKHB溶液で湿らせたコットンパッドの上に心臓を移動させる。(Figure 1B)。
注：灌流システム内に気泡がないことを確認すること。 - 5-0 silk threadを用いて、カニューレの遠位端にゆるい半正方形結びをあらかじめ作っておく。
- 胸腺、結合組織、および残存する心外組織（肺や食道を含む）を慎重に切除し、大動脈根を露出させてトリミングする。
注：カニュレーションを成功させるため、上行大動脈に十分な長さがあることを確認すること。 - 心臓をカニューレに取り付け、あらかじめ準備しておいた縫合糸で固定する。
- 5 mLの氷冷PBSで心臓を洗浄し、冠循環から残存血液を洗い流す。
3 Ex vivo心筋虚血および再灌流
注：全心筋虚血は心臓への灌流を単純に停止させることで誘導し、局所心筋虚血は実体顕微鏡下でLADを一時的に結紮することで作成した。
- 下層のコットンパッドを調整して心臓をゆっくりと回転させ、LADを視野の中心に配置する。PBSで灌流している間、LADは透明になり、周囲の心筋から明確に区別できるようになる。
- 8–0 ポリプロピレン縫合糸を通したテーパー針を、左心房の下縁から 1 mm 下のLADの下に通す。
注：結紮による血管損傷を避けるため、LADが2つの穿刺部位の中間に位置するようにすること。 - LADの上にソフトプレジェットを置く。
- 縫合糸を強く締め、結紮部位より遠位の灌流を停止させる。
- カニューレを挿入した心臓をランゲンドルフ装置に移し、逆行性灌流を開始する。
- 実験期間中、一定の温度 (37 °C) を維持するため、心臓をウォータージャケット付きの臓器浴に浸す。
- 冠血流のピーク値および定常状態をモニタリングする（表1）。
- 規定の心筋虚血時間（結果セクションを参照）において、灌流を停止し、カニューレを挿入した心臓を灌流装置から取り出す。
- 心収縮を完全に停止させるため、直ちに心臓を氷冷KHB (4 °C) に浸す。
- 心臓を予冷したメタルディッシュ内のコットンパッドに戻し、LADの結紮を解除する。
- 薬理学的介入研究の場合、この段階で 30 G インスリン用注射器を用いて、梗塞した前壁に Interleukin-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) を 5 µL 注入する。
- カニューレを挿入した心臓を再び灌流装置に取り付け、心灌流（再灌流）を再開する。
4. 心筋傷害および生存率の評価
注：2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色では、生存している心筋は濃赤色に染まり、一方、Zamboni液で固定した後の梗塞・壊死組織はベージュ色に見えます。
注意：TTCは一般的に有害とされており、軽度の皮膚刺激、重度の眼刺激を引き起こす可能性があり、吸入すると有害であるため、慎重な取り扱いが必要です。廃棄物および残渣は、地方自治体の規定に従って処分してください。
- 再灌流から90分後に灌流を停止し、直ちに心臓を氷冷KHBに浸して心収縮を停止させる。
- TTC染色液（PBSに溶解した1% TTC）をあらかじめ充填した3 mLシリンジにカニューレを接続します。 〜を介して 3方活栓
- TTC溶液1 mLを心臓に注入し、これを3回繰り返し、15分間で合計3 mLを投与する。
- 心臓の表面が乾燥するのを防ぐため、湿らせたティッシュペーパーで覆います。
- 心臓を、3 mLのTTC溶液を含む遠心チューブに入れ、 4 °C 一晩。
- OCTコンパウンドを用いて組織ブロックを作成する。
注：組織ブロックは−で保存可能です。80 °C さらなる解析を行うまで、数か月間保存する。 - OCTコンパウンドを用いて、組織ブロックをクライオスタットチャックに固定します。
- 心臓を、以下の厚さで連続的に凍結切片化する。 50 µm そして、10分ごとに回収する。th セクション。通常、心臓1個あたり約8枚の組織切片が得られます。
- 8枚すべてのスライスを1枚の顕微鏡スライドグラス上に並べ、ヘアドライヤーで2〜3分間乾燥させる。
- 切片を、Zamboni溶液（2%パラホルムアルデヒドおよび0.4%ピクリン酸（w/v）を含む固定液）が入った染色槽に浸し、一晩～で静置する。 4 °C.
注意：Zamboni固定液は皮膚のアレルギー反応を引き起こす可能性があり、遺伝的欠陥および発がん性を誘発することが疑われています。廃棄物および残留物は、地方自治体の規制に従って廃棄してください。 - スライスをPBSで3回洗浄し、切片に封入剤を滴下して覆う。
注：TTC染色した心臓サンプルは、室温で数ヶ月間保存可能です。 - CellSensソフトウェアを用い、1.25倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して心臓の画像を撮影する。
- 梗塞サイズの定量化を行うため、画像ファイルをImageJプラットフォームにインポートします。
- ImageJメニューから以下を選択します。 画像 -> 調整 -> カラーしきい値 Color Thresholdウィンドウを開くには（図2B).
- 心臓切片内から小さな関心領域（ROI）を選択し、深紅色の生存心筋およびベージュ色の梗塞・壊死組織を色参照として使用してください。
- クリックして サンプル 〜において 色しきい値 ウィンドウを操作し、選択した領域がターゲットの色領域と正確に一致するまで、彩度範囲を微調整します。
- クリックして 選択 選択した色に対応する領域を記述する。
- ImageJメニューから、以下を選択します。 分析する -> 測定選択した領域の面積がピクセル単位でResultsウィンドウに表示されます。
- 測定データをExcelスプレッドシートに書き出し、プランニメトリ法による梗塞サイズの算出を行います。
- 梗塞領域内の生存心筋を定量化するため、IL-6を注入した心室前壁の梗塞部位を中心に、関心領域（ROI）を定義する。
- ～を開きます。 ROIマネージャー ImageJメニューから、以下をクリックします。 追加 選択したROIをROIリストに保存する（図2C).
- 上述の「Sample」および「Selection」機能を用いて、生存心筋（濃赤色）を区分してください。
- 選択した生存領域を「ROI Manager」リストに追加し、その後選択してください。 および ROIと生存心筋との重複領域を得るため。
- 生存心筋領域を測定し、選択したROI内の心筋細胞生存率を算出します。
注：TTC染色および梗塞サイズ定量化の詳細な手法については、既報である。11.
結果
ex vivo MIプラットフォームにおいて、分離したマウス心臓を用いて2つの虚血プロトコルを評価した。 ex vivo MI研究で広く用いられている全心虚血では、心臓全体に不均一な虚血性損傷が生じた。信頼性の高い高解像度の顕微鏡TTC検出法12を用いた結果、心房心筋および心尖部領域は虚血に対して比較的耐性があり、45分間の全心無血流虚血後も生存していることが示された（図 2A、上段）。対照的に、局所的MIはLAD結紮部位より遠位の心筋に局所的な虚血性損傷を誘導した。この条件下では、心外膜下心筋の一部がTTC陽性のままであり、生存組織が保持されていることが示された（図 2A、下段）。これらの知見は、2つの虚血プロトコル間で心筋生存のパターンが異なることを明らかにしている。
心筋梗塞を確実かつ再現性高く誘発するために必要な虚血および再灌流の最小時間は、単離マウス心臓を用いてさらに検討されました。虚血時間を30分から120分に延長するにつれて、心筋障害は漸進的に増加しました（図 3A）。注目すべき点として、梗塞サイズは虚血時間が30分（n = 3）から45分（n = 5）の間で2倍以上に増加し、虚血時間を60分（n = 5）、90分（n = 4）、120分（n = 3）に延長するとプラトーに達したと考えられました（図 3B）。これらの結果は、心筋の生存能が30分を超える虚血時間に対して非常に敏感であることを示しています。in vivo 心筋梗塞（ivMI, n = 5）モデルと比較して、ex vivo 心筋梗塞（evMI, n = 8）モデルでは、同等の虚血および再灌流時間においてほぼ同一の梗塞サイズが得られ（36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27）、心筋障害が晶質液灌流によって大幅に影響を受けたわけではないことが示唆されました。それにもかかわらず、evMI心は心室壁が厚く心室腔が減少しており、これは晶質液灌流に伴う心筋浮腫に起因するものと考えられます（図 3C）。
心外的な影響のない、比較的制御された環境を利用して、心筋内へのIL-6投与による心保護効果を評価しました。PBSで処理した対照群の心臓では、45分間の虚血後であっても、梗塞・壊死領域（ベージュ色）内に、散在していますが測定可能な生存心筋細胞（生存CM; 深赤色）が検出されました（図 4; 1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4）。特筆すべきは、IL-6の心筋内投与（i.m.; 矢印）により、生存CMの量が有意に増加し、それらは主に関心領域（ROI）内の注射部位周辺に局在していたことです（4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test）。これらの知見は、IL-6が虚血性傷害後の心筋細胞の生存を促進する可能性を示唆しています。
最後に、現在のex vivo MIモデルには、実験結果の再現性に影響を及ぼす可能性のあるいくつかの潜在的なピットフォールが存在します。図 5に示されているように、結紮糸のずれによってLADの閉塞が不十分となり、広範な心筋生存（4/168）が生じる場合があるほか、同時にLADの分枝が損傷すると不完全な再灌流（12/168）が起こる可能性があります。加えて、大動脈カニュレーション中の空気塞栓も心筋損傷（矢印、7/168）を引き起こすことがあり、定量化において虚血性損傷と塞栓性損傷を区別することを困難にします。最後に、心臓への灌流が過剰な場合、TTC染色の不足（11/168）が生じることがあり、これにより梗塞領域の描出が著しく妨げられます。
図1実験装置の概略図。 非再循環型重力駆動一定圧ランゲンドルフ系は、栄養分を豊富に含み酸素を飽和させたKrebs–Henseleit緩衝液（KHB）を、110 cmH2Oの一定静水圧で供給するように設計されている。₂O. KHBをあらかじめ予熱し、 37 °C リザーバーに入れられ、ウォータージャケット付き圧力カラムに供給されます。そこでは110 cmH2Oの一定の静水圧が維持されます。2Oを維持した ～経由で 圧力レギュレーター。灌流心は、一定の温度を維持するため、高さ調節可能なウォータージャケット付き器官浴に浸漬された。 37 °C 実験期間を通じて（A）。冷却済みの金属製ディッシュ内のコットンパッド上で心停止薬を用いて心停止させた後、左前下降（LAD）冠動脈を一時的に結紮することで、心筋梗塞を誘発した（B）。処置は実体顕微鏡下で行った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 局所心筋梗塞（MI）と全心心筋梗塞（MI）および梗塞サイズの決定。 全心MIは心臓全体に虚血性損傷を誘発し、それはTTC染色の顕微鏡像における黄色い染色によって示される。心房心筋および心尖領域は虚血に対してより耐性があると考えられ、45分間の全心無血流虚血後も生存していた（Aの上パネル）。局所MIは、LAD結紮部位より遠位の心筋に虚血性損傷を誘発する。この設定では、心外膜下心筋の一部が赤色に染まっており、生存組織が保持されていることが示唆される（Aの下パネル）。梗塞サイズはImageJを用いて定量化し、梗塞・壊死領域と生存心筋をそれぞれの異なる染色色に基づいて区分した（B）。関心領域（ROI）内における心筋細胞の生存率は、選択したROIにおける深赤色の染色の割合を決定することで算出した（C）。スケールバー：1 mm。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図3: 虚血時間に及ぼす梗塞サイズへの影響。虚血時間を30 minから120 minまで延長するにつれて、心筋損傷が漸次的に悪化した(A)。梗塞サイズは、虚血時間が30 min (n = 3)から45 min (n = 5)の間で2倍以上に増加し、虚血時間を60 min (n = 5)、90 min (n = 4)、120 min (n = 3)まで延長すると、ほぼプラトーに達したと考えられた(B)。in vivo MI (ivMI, n = 5) モデルと比較して、ex vivo MI (evMI, n = 8) では、同等の虚血時間においてほぼ同一の梗塞サイズが認められた (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27, Student’s t-Test)。evMI心では、晶質液灌流に伴う心筋浮腫により、心室壁が厚くなり、心室腔が縮小していることが示された(C)。エラーバーは平均の標準偏差 (SDM) を示す。スケールバー：1 mm。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図4: 虚血性損傷後の心筋細胞の生存を促進するIL-6。evMIモデルにおいてIL-6を心筋内（i.m.）投与すると、梗塞/壊死領域（ベージュ色）内に、測定可能な数の生存心筋細胞（生存CM；濃赤色）が認められ、それらは主にIL-6注入部位の周囲に局在していた（左パネル、矢印）。関心領域（ROI、破線で表示）内の生存CMを定量化したところ、PBS注入では生存心筋の割合はわずかであったが（1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4）、IL-6の注入によりROI内の生存CMの量が有意に増加した（4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test）。エラーバーは平均値の標準偏差（SDM）を示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図5: 技術的な失敗に起因する、不十分または不成功な結果。 代表的な心筋傷害の例に示されているように、 ex vivo MIモデル（左）において、典型的なTTC染色では、生存心筋と壊死心筋を一般的に明確に区別できる。しかし、いくつかの技術的な不備により、不十分または判読不能な結果となる場合がある。縫合糸の滑脱によるLAD結紮の不備は、長時間虚血にさらわれたにもかかわらず、広範な心筋生存を招く可能性がある。LADの分枝が結紮時に損傷し、その後の灌流が不十分になった場合には、不完全な再灌流が生じ、臨床的に観察される「no-reflow」現象に類似したパターンを呈することがある。このような領域は、ピンク色を呈する場合がある（矢印）。また、カニューレーションの手技中に冠循環に気泡が進入し、微小血管塞栓が生じると、心筋損傷が引き起こされる可能性があり（矢印）、定量評価において虚血性損傷と塞栓性損傷を区別することが困難になる。最後に、心臓に過剰な灌流を行った場合、虚血とは別の心筋損傷が誘発され、不適切なTTC染色となる可能性がある。スケールバー：1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| F-peak (n = 19) | F-steady (n = 19) | RFピーク (n = 19) | RF-steady (n = 19) | |
| 平均値 (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| 標準偏差 | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
表1： 虚血時および再灌流時（RF-peakおよびRF-steady）における最大レベル（F-peak）および定常状態（F-steady）の冠血流.
ディスカッション
現在のex vivo MIモデルは、主に高度なランゲンドルフ心臓灌流システムに基づいています2。準備段階における一般的な陥穽は、冠循環への気泡の混入であり、これにより塞栓性損傷が引き起こされ、虚血性損傷の評価を妨げる可能性があります。この問題を防止するためには、各実験の直前に灌流システムを細心の注意を払って点検することが不可欠です。チューブシステム内に小さな気泡が閉じ込められた場合は、KHBを用いて逆行性に洗浄し、気泡を圧力カラム側に押し戻すことで、問題の解決に役立つ可能性があります。
本プロトコルの極めて重要なステップは、LAD冠動脈の結紮です。そのため、まずLADを正確に視覚的に識別することが不可欠です。多くの場合、心臓を氷冷PBSで洗浄すると冠血管が半透明になり、LADが周囲の心筋から明確に区別できるようになります。さらに、適切で熟練した結紮技術も同様に重要です。8-0 ポリプロピレン縫合糸に過剰な張力がかかるとLADを切り裂いてしまい、その後の再灌流ができなくなる可能性があるためです。このリスクを最小限に抑えるために、結紮力を分散させ、機械的損傷から冠動脈を保護できるよう、適切なサイズのソフトプレジェットを縫合糸と血管の間に配置する必要があります。とはいえ、結紮による軽微な心筋損傷は避けられませんが、一般的に冠灌流を損なったり、実験結果に影響を与えたりすることはありません。最後に、心筋損傷は温度に非常に敏感であるため13、実験を通じて一定の温度を維持することが極めて重要です。特に定圧灌流条件下では、灌流カラムと心臓の間で熱損失が発生しやすく、それは冠血流速度に応じて動的に変化します14。したがって、温度変動が心筋温度の変化を招く可能性があります。このような環境では、安定した温度条件を維持するために、ウォータージャケット付きの臓器浴を用いることが非常に望ましいです（図 1A）。
これらの技術的な課題を克服すれば、ex vivo MIモデルは、単離マウス心臓において心筋損傷を誘導するための信頼性と再現性の高いプラットフォームとなります（図3A）。したがって、本モデルは、MI後の心筋生存率の調査、局所投与による治療介入の評価、および呼吸や心拍によるモーションアーチファクトのない高解像度イメージングを行うための有用な実験系となります。グローバルMIプロトコルは技術的に単純であり、先行研究で広く用いられてきましたが4、最大の制限は、グローバル虚血の持続時間が通常45分未満に限定されることです3。その結果、局所的MIモデルとは異なり、全層心筋梗塞が誘導されることは稀です（図2）。
ex vivo MIモデルの独自の特長は、神経調節や血中成分を含む全身的な影響がないことであり、これにより研究者は、心筋に対する治療的介入の直接的な局所的効果を評価することが可能になります8。これは、単離心筋細胞において心保護作用を示すことが明らかになっているIL-6などのサイトカインや、その下流のPI3K/AKTシグナリングにおいて特に重要です15。しかしながら、in vivoでは、IL-6が免疫細胞を活性化させると同時に炎症反応を促進し、それが直接的な心保護作用を相殺する可能性があるため、IL-6の心臓への影響はしばしば一貫性がなかったり、矛盾したりすることがあります16。この概念と一致して、我々のex vivoモデルでは、IL-6の局所的な心筋内投与が虚血性損傷後の心筋生存能を有意に維持することが説得力を持って示されており17,18、心筋細胞に対するIL-6の直接的な心保護効果を支持しています（図4）。
本ex vivo心筋梗塞（MI）モデルには、いくつかの限界があることを認めています。本プロトコルの設定では、心機能の収縮能は評価していません。3これは、主な目的が地域的心筋梗塞（MI）モデルにおける心筋生存能を評価することであったこと、および、収縮機能不全は虚血性傷害後の機能障害を反映するものの、必ずしも心筋細胞の死を意味するわけではないためです。8さらに、 ex vivo MIモデルでは、MIの進行および心室リモデリングに大きく寄与し得る血中成分、免疫細胞、および神経体液性因子の影響が本質的に排除されている。 in vivoこの全身的な複雑性の低減は、〜の大きな利点であるものの、 ex vivo MIモデルでは、起こりうる炎症、血管、神経、および内分泌反応を模倣することにおける広範な利用も制限されます。 in vivo最後に、結晶質液による灌流は、心室壁の厚さの増加および心室腔の減少によって示される心筋浮腫と関連していることが分かった。 in vivo 心筋梗塞（MI）心。浮腫の発生が心筋の構造や組織拡散、そして潜在的に細胞生存能を変化させる可能性があることは周知の通りである。したがって、本モデルは、心筋損傷および心筋細胞特異的なメカニズムを調査するための制御されたプラットフォームとして見なされるべきである。
それにもかかわらず、ここで述べたex vivo MIモデルは、外在的な調節因子の影響がない状態で心筋の生存能を評価するための、簡便で費用対効果の高いプラットフォームである。遺伝子改変マウスモデルの利用が増加していることを踏まえると、このアプローチは、高度なイメージング、電気生理学的記録、および分子解析を用いて心保護メカニズムを調査する上で特に有用であると考えられる。さらに、本モデルは、局所的な薬理学的介入または遺伝子ベースの介入を系統的に検証し、全身性の交絡因子を排除して心筋細胞特異的なメカニズムを解析することに適応させることが可能である。したがって、ex vivo MIモデルは、心保護経路の同定およびメカニズムの解明を促進するための補完的な実験プラットフォームとなる。
開示事項
著者らは、利益相反がないことを宣言します。また、本研究の起草、データ分析、図の作成、または検証において、人工知能（AI）ツールまたは生成AI支援技術が使用されていないことを宣言します。
謝辞
本研究は、Jiangsu Geriatrics SocietyのGeneral Project（JGS2026MS019、WOへの助成）、鎮江市科学技術局社会発展基金（助成番号：SH2023023、H.Z.への助成、およびSH2023057、X.L.への助成）、FoKo Program（助成番号：23/2013、ZDへの助成）、およびCardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID)の支援を受けて実施されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド | Milipore | 1.08380.0100 | 化学薬品 |
| 大動脈カニューレ | BD | 305895 (20 G) | 逆行性灌流 |
| Aquamount | BDH | 362262H | 凍結切片作成 |
| 電子天秤 | Ohaus | - | 化学薬品の計量 |
| 大型ピンセット | AESCULAP | - | 手術器具 |
| 血液ガス分析装置 | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | ガス分析 |
| 塩化カルシウム二水和物 | Fluka | 21097 | 化学薬品 |
| カーボゲン | Linde | 4040152 | ランゲンドルフ装置 |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | イメージングソフト |
| コットンパッド | BEESana | PZN-1330900 | 手術器具 |
| カバーグラス | Epredia | BB02400500A113MN20 | 凍結切片作成 |
| クライオスタット | Leica | M850 | 凍結切片作成 |
| D(+)-グルコース無水物 | Merck | 8337.1000 | 化学薬品 |
| 二回蒸留水 | Milipore | - | 化学薬品の溶解 |
| エタノール (100%) | Merck | 64-17-5 | チューブの洗浄 |
| エタノール (70%) | VWR | UN1170 | チューブの洗浄 |
| フィルターメンブレン (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | ランゲンドルフ装置 |
| フローメーター | Transonic | T4S410 | ランゲンドルフ装置 |
| ガラス製顕微鏡スライド | Engelbrecht | 11102 | 凍結切片作成 |
| ガラス製水柱 | Homemade | - | ランゲンドルフ装置 |
| 塩酸 | Roth | P074.1 | 化学薬品 |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | ソフトウェア |
| インターロイキン-6 | Biolegend | 570804 | 化学薬品 |
| イソフルラン | Piramal | 14150097146754 | 化学薬品 |
| 光学顕微鏡 | Olympus | BX61 | イメージング |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | Merck | 5886.1000 | 化学薬品 |
| 医療用フロープローブ | Transonic | 3PXN | ランゲンドルフ装置 |
| 金属製ディッシュ | Homemade | - | 手術器具 |
| マイクロファインシリンジ | BD | 30G / 0.3 mL | ランゲンドルフ装置 |
| マウス | Janvier | C57BL/6J | 動物 |
| 対物レンズ (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | イメージング |
| OCTコンパウンド | Sakura | 4583 | 化学薬品 |
| ペトリ皿 | Thermo Scientific | 172931 | ランゲンドルフ装置 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Roth | 9143.1 | 化学薬品 |
| 塩化カリウム | Merck | 4936.1000 | 化学薬品 |
| リン酸二水素カリウム | Merck | 4873.1000 | 化学薬品 |
| 絹縫合糸 | F.S.T | 18020-60 | 手術器具 |
| 塩化ナトリウム | Sigmaaldrich | SZBD0810V | 化学薬品 |
| 炭酸水素ナトリウム | Roth | 6885.2 | 化学薬品 |
| ピルビン酸ナトリウム | Sigmaaldrich | 113-24-6 | 化学薬品 |
| ソフトプレジェット | Deknatel | L-705 | 手術器具 |
| ステンレス製ピンセット (8m/m) | F.S.T | 11052-10 | 手術器具 |
| ステンレス製ハサミ | AESCULAP | BC702R | 手術器具 |
| ステンレス製ハサミ | AESCULAP | BC257R | 手術器具 |
| 実体顕微鏡 | Leica | MZ6 | 手術器具 |
| 縫合糸 (8-0) | Ethicon | TG-108 | 手術器具 |
| シリンジ (3 mL) | B. Braun | 4617100V | 逆行性灌流 |
| 三方活栓 | B. Braun | 16494C | 逆行性灌流 |
| チューブ | Tygon | T3304-23 | ランゲンドルフ装置 |
| 恒温水槽 | HAAKE | DC1/B3 | ランゲンドルフ装置 |
| ザンボーニ液 | Morphisto | 12773.0050 | 化学薬品 |
参考文献
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- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
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- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
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- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
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- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
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