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方法論記事

結核および多剤耐性結核の診断のためのMODSの方法

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DOI:

10.3791/845

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2008年8月11日

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1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

この記事について

サマリー

顕微鏡観測薬剤感受性（MODS）アッセイは、結核の高性能検出（TB）と多剤耐性結核（MDRTB）用の低コスト、ローテクのツールです。このビデオは、MODSの液体培地培養法を説明します。

要約

活動性肺結核の患者（TB）は、患者を硬化し、新たな感染症の予防の両方に不可欠な活動性結核を診断すること、毎年10月15日他の人に感染する。さらに、耐性結核（MDRTBを）多剤の出現は、その薬剤耐性の検出は、薬剤耐性菌の拡散を阻止するために必要であることを意味する。顕微鏡観測薬剤感受性（MODS）アッセイは、TBとMDRTBの高性能の検出のための低コスト、ローテクのツールです。結核菌（MTB）は、微細なMTBの成長は、固形培地上のコロニーの肉眼的外観を待っているよりも早期に液体培地で検出し、可能な）固形培地2に比べて液体培地でより速く成長する1）：MODSのアッセイは、3つの原則に基づいていますその成長は、サブカルチャーは、実行をする必要がない、それは薬イソニアジドとリファンピシンがMDRTBの同時直接検出を可能にするためにMODSのアッセイに組み込むことができる非定型抗酸菌や真菌や細菌汚染3）と区別できるように、MTBの特徴です。間接的な薬剤感受性試験。競合する現在の診断は、喀痰塗抹標本と低感度、固体培地の文化、既存の液体培地培養法と法外に高いコスト、およびMDRTBを検出する間接的な薬剤感受性試験のためにサブカルチャーを行うために必要と診断されるまでに長い遅延によって妨げています。対照的に、非独占的なMODSの方法は、結核とMDRTBための高感度を有し、比較的迅速な培養法であり、MDRTBの同時薬剤感受性試験を提供し、リソースが限られた結核のためのテストのためのすぐ下に$ 3の設定にアクセス可能であり、 MDRTB。

プロトコル

  1. ストック溶液を準備する
    1. リン酸塩緩衝在庫
      1. 一塩基性リン酸カリウム溶液（千ミリリットル蒸留水に溶解したリン酸カリウム一塩基の9.07グラム）の950ミリリットルでナトリウム塩基性溶液（千ミリリットルの蒸留水に溶解したナトリウム二塩基性リン酸の9.47グラム）の950ミリリットルを混合し、かき混ぜ、調整して戻ってそれぞれのソリューション50mlの維持pHは必要に応じて
      2. 6.8 ± 0.2にpHを調整する：pHを上昇させるために追加のリン酸ナトリウム二塩基性溶液、低いpHに一塩基性リン酸カリウム溶液を入れる
      3. 121から124まででオートクレーブ℃で15分間の滅菌に
      4. プレート無菌性を確認するために48時間で37ペトリ皿とインキュベートの栄養寒天培地上にリン酸緩衝液° C100μlのアリコートを
      5. 2〜8℃冷蔵庫で保管℃で最長1ヶ月まで

        注 ：各痰のサンプルでは、リン酸緩衝液10mlのが必要です
    2. 除染株式
      1. 水酸化ナトリウム溶液（200ミリリットル滅菌蒸留水に溶解した水酸化ナトリウムの8.0グラム）とクエン酸ナトリウム溶液（200ミリリットル滅菌蒸留水で蒸留クエン酸ナトリウムの5.8グラム）の等容量を組み合わせる
      2. 15分間121〜124℃で混合し、オートクレーブ
      3. 2〜8℃冷蔵庫で保管℃で最長1ヶ月まで

        注 ：各痰のサンプルは、汚染除去の株式の2ミリリットルが必要です
    3. 文化メディア株式
      1. 滅菌蒸留水900ミリリットル中にグリセロールと7H9培地の粉末のcasitoneと5.9グラムの1.25グラムの3.1ミリリットル加える。一定に撹拌しながら混合を完全に溶解するまで
      2. 15分間121〜124℃でオートクレーブ
      3. 滅菌サンプル調製のための16倍、100mmのガラス管、および抗生物質のソリューションと内部統制の準備のための10.8ミリリットルアリコートで4.5ミリリットルのアリコートに無菌培地を冷却し、分割
      4. 37℃48時間の不妊（濁度の欠如）を確認する
      5. 2〜8℃キャップ付きで保存するには、しっかりと一ヶ月にするため、最大閉鎖

        注 ：各痰のサンプルでは、7H9培地のいずれかのチューブを含む4.5ミリリットルが必要です
    4. 抗生物質ストック溶液
      1. A.イソニアジド株式（8 mg / ml）を
        1. 2.5ミリリットル滅菌蒸留水で完全にイソニアジド20mgを溶かす
        2. 水性溶媒用0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリング
        3. 6ヵ月まで-20℃で滅菌マイクロ遠心チューブに20μlのアリコートの店

          注 ：各ストアド20μlの分画は、最大100サンプル（無駄を含む）のために十分である
      2. B.リファンピシン株式（8 mg / ml）を
      1. 1.25ミリリットルのDMSOに完全に20mgをリファンピシンを溶かす
      2. 1.25ミリリットル滅菌蒸留水とミックスを追加する
      3. 有機溶剤用0.2μmのシリンジフィルターとフィルター
      4. 6ヵ月まで-20℃で滅菌した微量遠心チューブに20μlのアリコートの店

        注 ：各ストアド20μlの分画は、最大100サンプル（無駄を含む）のために十分である
  2. ワーキング溶液の調製法
    1. 汚染除去作業ソリューション
      1. 必要な除染液の各20ミリリットルで、NALC結晶の0.1グラムを溶かし

        注 ：各サンプルには、除染液の2ミリリットル必要があります

        注意 ：NALCは時間が経過すると、その粘液溶解活性を失うように24時間後に未使用の状態にある任意のNaOH - NALCの除染液を捨てる
    2. 文化メディアワーキングソリューション
      1. 着手：
        1. 処理されるすべての喀痰サンプルの7H9培地1チューブ、加えて全てのプレートに1追加のチューブ（ネガティブコントロールの列のため）
        2. ポジティブコントロールの7H9培地の2チューブ（3 monoresistant菌株が使用されている場合）
        3. 抗生物質溶液の調製のための10.8ミリリットル7H9で1〜チューブ
      2. 各サンプルチューブに7H9の4.5ミリリットルに0.5ミリリットルOADCを追加
      3. 10.8ミリリットル7H9でチューブに1.2ミリリットルOADCを追加
      4. 抗生物質溶液の調製に使用される12ミリリットル7H9 - OADCで5ミリリットルポジティブコントロール用の7H9 - OADC、及びチューブ（S）で2チューブを脇に置いて（これらは、PANTAを必要としない）
      5. 再構成のPANTAと各サンプルチューブに、陰性対照のチューブ（7H9 - OADC - PANTA：総量= 5.1ミリリットル）に0.1ミリリットル追加

        注：PANTA（7H9 - OADC - PANTA）との完全な培地は喀痰サンプルとネガティブコントロールに使用されている。ポジティブコントロールのためにと抗生物質溶液の調製のためのPANTAなく7H9 - OADCを使用する
    3. 抗生物質ワーキングソリューション
      1. 1。未使用の24ウェルプレートでの抗生物質ワーキングソリューションを作成する手順については、図1を参照してください

        注 ： 正確な感受性の結果を得るには、最終的な抗生物質の濃度が重要である。次の手順では、lに適していますマイクロピペットを装備aboratories。マイクロピペットが使用できない場合は、ツベルクリン注射器はmodsperu.orgでユーザガイド付録3で説明されている希釈の異なるシリーズで使用できます

        注 ： 薬物活性として再凍結または再使用しないで抗生物質の作業または原液が失われる可能性があります処理の日の図1の終了時にす ​​べての未使用の抗生物質を破棄。。抗生物質ワーキングソリューションを作成（modsperu.orgにおけるユーザガイドから）
  3. 痰のサンプルおよびプレートの準備
    1. 汚染除去
      1. 15ミリリットルの遠心チューブに痰のサンプルの場所の2ミリリットル（小さい場合、リン酸緩衝液で2ミリリットルに構成している、多くの場合、唯一の2ミリリットル使用）
      2. 2ミリリットルをNaOH - NALCのソリューションを追加します。
      3. 20秒のためのキャップをしっかりと管と渦、水酸化ナトリウム、NALCのソリューションの連絡先を内部全体の管の表面と蓋を確実にするためにチューブを反転させる
      4. 15分以上放置する - サンプルは、特に粘性の場合は数分で延長することができます。治療上のを避けるために、20分を超えないようにしてください
      5. 4倍をアルカリ中和し、除染プロセスを終了し、チューブを反転させてよく混合してリン酸緩衝液（pH6.8）で14ミリリットルにチューブを埋める
      6. 15分間、3000gで遠心（3000 gを達成するために必要な分当たりの回転の方程式のためmodsperu.orgでユーザーガイドの付録2を参照）
      7. 慎重に10％の次亜塩素酸ナトリウムまたは他の適切な消毒剤と液体廃棄物の容器に上清を取り除き、ペレットを保持する
    2. 最終サンプルのサスペンションとバックアップの準備
      1. 7H9 - OADC - PANTAを（5.1ミリリットルを含むチューブから）を使用して、パスツールピペットで遠心管に2ミリリットルの合計体積に試料ペレットを再懸濁します。うまくミックス
      2. バックアップとして2〜8サンプルの懸濁液とマイクロ遠心チューブ内の店舗° Cの1ミリリットルを削除します。
      3. 残りの7H9 - OADC - PANTAとチューブにサンプルのサスペンションの第1ミリリットルを追加、よく混ぜる。これはメッキの準備ができて最終的なサンプルのソリューションです。
    3. 24ウェルプレートに試料懸濁液の配置
      1. 24ウェルプレート内の列の4ウェルの各々に最終的なサンプルの懸濁液900μl場所
      2. 、列3を除いて、プレートのすべての列まで、追加のサンプルを繰り返して（またはすべてのサンプルがメッキされるまで）満ちている
      3. 各サンプルプレートの列3（負の内部統制）の4ウェルにサンプルなし 7H9 - OADC培地の900μl場所
    4. サンプルに抗生物質を追加する
      1. マルチチャンネルピペットを使用して、慎重に7H9 - OADCと抗生物質ワーキングソリューション（抗生物質希釈で2列目は、プレート - 参照図1）でウェルから100μlの4のヒントを埋める
      2. プレートやサンプルに触れることなく、900μlのサンプル溶液と1列目のウェルに100μlのアリコートを追加
      3. すべての列は、媒体の追加の100μlの（薬物のない井戸）または（ネガティブコントロールのカラム3を含む）の抗生物質を受信するまで繰り返します。
      4. 密閉式ポリエチレン（ジップロック）袋とシールで、その蓋と場所でプレートを閉じて（ 袋はこの時点から再び開いていない ）
      5. 37℃（CO 2濃縮は不要です）
  4. 品質管理
    1. ネガティブコントロールは、各プレート上で実行されています。井戸のいずれかで、成長の存在は、ネガティブコントロールの列で、プレート全体が廃棄とサンプルの再メッキする必要があるため、クロスコンタミネーションを示します。
    2. ポジティブコントロールは、一日の終わりに別々のプレート上で実行されています。One完全に薬剤感受性株の列で実行され、INHとRIFに歪み耐性が別の列で実行されている。 MDR菌株を実行している懸念がある場合は、INH monoresistantひずみとRIF monoresistant歪みの両方が影響を受けやすいとMDR株の代わりに実行することができます。すべてのポジティブコントロールには、そのメディアのサポートの成長を実証するために薬物のない井戸の成長が必要です。薬物濃度が正しいことを示すために、感受性株はINHまたはRIF井戸に成長しないはずですが、MDR株はINHとRIF井戸にも拡大成長してください。
  5. プレートの読み取り
    1. としてめっきの日に"0日目、"板の読み込みは5日目に開始し、負の場合は目に5測定値は、14日目とその後15日目から毎年2〜3日まで（またはワークロードに応じて別の日）は毎日行われます。 -21。プレートを上検討されています10倍の目標と倒立光学顕微鏡
    2. 肯定的な文化は、薬物のない井戸の両方で複数のコロニー形成単位は（> 2 CFU）が存在する環境です。初期のマイコバクテリアの成長は、小さな湾曲したコンマまたはらせん（日5-9）のように見えます。コロニー形成は、通常、"コード"または"もつれ"（modsperu.org上のイメージのライブラリを参照してください）​​へと進行する
    3. 日には文化が2薬物のない井戸で陽性である、薬物含有ウェルを読んでおく必要があります。 薬剤の存在下で任意の成長がその薬剤に耐性を示す。

      注 ： 正の培養は薬物のない井戸に記載されている> 1週間後に薬物含有井戸の読み取りが行われる場合、この、成長のブレークスルーとしての抵抗を表していない可能性がありますが時折見られます
    4. 21日目で陽性ではないサンプルは負の文化と考えられている
    5. 井戸の濁りは、マイコバクテリアの成長は、曇りが発生しないのに対し、汚染の増殖の結果である
    6. 21日間培養の終了時に破棄されることがあります。文化は、彼らの密封袋に残り、オートクレーブバッグに入れて45〜60分間121〜124℃でオートクレーブしている

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ディスカッション

MODSのアッセイは、資源が限られた設定で対象としています。初めて、MODSは、結核の迅速な液体培養の検出のための能力をもたらし、テストあたりのすぐ下に$ 3で資源が限られた設定に耐性結核を多剤。 MODSは、非独占的、反復的な方法論であり、MODSのコミュニティは、常に他の研究室を作るために管理されていることの改善に興味を持っています。

液体がこぼれたり、エアロゾル化することができますので、再発の懸念は、結核の液体のメディア文化のバイオセーフティです。対照的に、MODSは単にの接種を含む、我々は間接的な薬剤感受性試験が流出し、エアロゾルの付随するリスクと抗酸菌の高濃度の溶液の操作を伴うので、MODSのアッセイは、関連する間接的な薬剤感受性試験その任意のアッセイよりもbiosafeであると信じていますプレートへの痰のサンプルは、そのあとプレートはプラスチック袋に密封し、再度​​開かれることはありません。これは、職業上のリスクは、薬剤感受性試験を行​​うことなく、喀痰サンプルを播種実験室労働者に喀痰塗抹顕微鏡検査を行う労働者のそれより大きくはなかったことが示された韓国（金2007）からのデータがサポートしており、対照的に、それらの何薬剤感受性試験は、結核のためのは...

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謝辞

我々は、結核の成長タイムラプスビデオセグメントに対してショーンフィッツウォーターとカルメンGianninaルナコロンボに感謝します。我々は、現在のプロトコルは主に逐語的に取得されたユーザガイドを、編集中に彼女の徹底と優れたフィードバックのためマーティローパーを感謝し、共同編集。このビデオの制作は、NIH /フォガティ国際センターによって資金を供給されたhttp://www.fic.nih.gov/デビッドAJムーアが、ロンドン大学インペリアルカレッジで感染症の熱帯医学とリーダーのウェルカムトラスト臨床研究員（フェローとして貢献受賞番号078067/Z/05）。マークF. BradyはNIH /フォガティ国際センターの研究員として貢献した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
冷蔵庫／冷凍庫装置・器具調製済みのブイヨンおよび抗生物質ストックを保存するため
ボルテックス混合装置・器具喀痰の除染を補助するために
遠心分離機装置・器具喀痰の濃縮用；最大3,000 gまで到達可能；d–冷蔵する必要はありませんが、バイオセーフティを確保する必要があります（バケットは密閉可能です）。
インキュベーター（37℃）装置・器具培養用。CO2濃縮は不要。
倒立光学顕微鏡顕微鏡MODSプレートを読み取るため
オートクレーブ器具・設備培地、PBS、および使用済みプレートを滅菌するため
天秤装置・器具イソニアジド、リファンピシン、およびNALCを秤量する
Middlebrook 7H9液体培地 (Difco)試薬Fisher ScientificDF0713-17-9500g/瓶；培地ベース
カシトーン（膵消化カゼイン）試薬Fisher ScientificDF0259‐17‐9500g/瓶；培地ベース
凍結乾燥グリセロール（グリセリン）試薬Sigma-AldrichG‐33‐500500ml/本；培地ベース
PANTA（抗生物質混合凍結乾燥物BD） 試薬Fisher ScientificB43451146本/パック；抗生物質培地添加物
OADC (Middlebrook OADC増菌培地 BD)試薬Fisher ScientificB1188610 x 20ml/パック；栄養培地サプリメント
ジメチルスルホキシド (Hibri-Max)試薬Sigma-AldrichD-2650100ml/瓶；リファンピシンのストック溶液を調製するため
抗生物質ストック溶液：イソニアジド試薬Sigma-AldrichI-337750g/瓶；直接感受性試験
抗生物質ストック溶液：リファンピシン試薬Sigma-AldrichR-35011g/瓶；直接薬剤感受性試験
水酸化ナトリウム（ペレット）試薬Sigma-Aldrich221465500g/瓶；喀痰の除染
クエン酸ナトリウム（クエン酸三ナトリウム二水和物）試薬Sigma-AldrichS-4641500g/ボトル；喀痰の除染
N-アセチル-L-システイン試薬Sigma-AldrichA-725050g/瓶；喀痰の除染
リン酸一カリウム結晶 KH2PO4試薬Sigma-AldrichP0662500g/瓶、痰の除染
リン酸二水素ナトリウム、無水物。Na2HPO4試薬Sigma-AldrichS0876500g/瓶；喀痰の除染
次亜塩素酸ナトリウム試薬家庭用漂白剤汚染廃棄物を廃棄するために
15ml遠心チューブ（ポリプロピレン製 15ml Falcon 35‐2096)消耗品Fisher Scientific14‐959‐49B500個/ケース；客痰の除染および濃縮用
24ウェルプレート（BD Falcon 35 組織用24ウェルプレート）‐3047)消耗品Fisher Scientific08-772-150枚/ケース。培養および判定用。
密封可能なポリエチレン袋 6 X 6 “ ジップロック袋消耗品バイオセキュリティーのため、24ウェルプレートを封じ込めるための
蓋付きガラス管（16 x 100mmおよび18 x 145mm）消耗品VWR international47729-583500本/ケース；調製済みブイヨン分注液の保存用
スクリューキャップ付きマイクロチューブ (1.5ml)消耗品Fisher Scientific05‐669‐221000個/ケース；抗生物質ストックのアリコート保存用
0.22μμmフィルター（水系溶媒）シリンジフィルター Millex blue消耗品Fisher ScientificSLGL 025 OS50ユニット/ケース；抗生物質ストック溶液のろ過用
0.22μμm フィルター（有機溶媒用） シリンジフィルター Millex イエロー消耗品Fisher ScientificSLGV 033 RS50ユニット/ケース；抗生物質ストック溶液のろ過用
使い捨てパストゥールピペット ホウケイ酸ガラス 9″消耗品Fisher Scientific13‐678‐20°C720個/ケース。PANTAを培地ミックスに混合すること。
エアロゾルバリアチップ 1000μL‐1300μ（入力がありません。翻訳するテキストをご提示ください。）消耗品Fisher Scientific02‐707‐511000個/パック；プレートへの培地分注用
USA Scientific Tips One 1‐200μイエローチップ消耗品Fisher Scientific1111‐00061000本/袋。抗生物質ストック溶液の希釈用。

参考文献

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  2. Caviedes, L. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).
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