この記事では、三齢ショウジョウバエの幼虫から中枢神経系を解明する方法を示します。
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この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエの幼虫の中枢神経系（CNS）は、複雑でほとんどわかっていない。 CNSを調査する一つの方法は様々な小説やマーカータンパク質の発現を調べるために免疫組織化学を使用することです。タフなキューティクルが体腔内に侵入から抗体を妨げるため、全体の幼虫の染色は、非現実的です。これらの組織を染色するためには、固定と染色の前に動物を解剖することが必要である。この記事では、中枢神経系を損傷することなく、ショウジョウバエの幼虫を解剖する方法を示します。細かいピンセットで半分に幼虫を引き裂くことによって開始し、CNSを公開するために、キューティクル"インサイドアウト"をオンにします。解剖が注意深く行われている場合、CNSがキューティクルに接続されたままになります。我々は通常、固定と染色ステップを通して表皮に接続されている中枢神経系を維持、そして唯一の完全なガラススライド上にサンプルをマウントする直前に、キューティクルからCNSを削除します。我々はまた、イブ、中枢神経系における神経細胞のサブセットに発現する転写因子で染色された幼虫の中枢神経系のいくつかの代表画像を示す。資料では、この方法の実用的な使用方法と発生する可能性がある潜在的な問題のいくつかの議論で締めくくります。
プロトコル
- キューティクルに接続されている中枢神経系を残し、第3齢幼虫を解剖。 1.5 mlチューブ内の場所。
- 振盪しながら40分間、2％ホルムアルデヒドを含むPBS（1X）に修正。 、5〜10解剖CNS用250ulを使用してください。
- ホルムアルデヒドを取り外して、簡単にPBS + 0.1％トリトンX - 100（PBST）で3回洗浄する。組織の損失を避けるために、細かくプルパスツールピペットを使用してください。
- 非特異的タンパク質結合部位をブロックし、PBSTで組織1から8時間インキュベートすることにより細胞膜を透過性+ 4で揺れを5％BSA、℃を
- 4℃で一晩PBST +5％BSAロッキングで希釈した一次抗体でインキュベートする。最適な抗体の希釈には、異なる抗体ごとに異なります。
- 4として2時間30分洗浄℃に続いてPBSTで3倍のリンス
- PBSTで希釈した二次抗体でインキュベート+ 4で揺れ1〜3時間、5％BSA℃を4として2時間30分洗浄℃に続いてPBSTで3倍のリンス二次は光に敏感な化合物に共役である場合、アルミ箔で管を包む。
- さらに組織を解剖（必要に応じて）とスライド上にマウント。
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ディスカッション
このビデオでは、三齢ショウジョウバエの幼虫からCNSを分析する方法を示しています。解剖後、CNSは、標準の免疫組織化学のプロトコールを用いて染色することができます。現在、多くのまだそれは情報を格納して送信する方法成体神経系はだけでなく、どのように生成されるかについては不明です。開発ショウジョウバエ幼虫の中枢神経系の研究は、神経系の配線や機能の知識を強化していくべき。
ショウジョウバエの幼虫は、このような環境の手がかりへの応答としてstereotpyed行動、の数を示す。どのようにこれらの行動は、学習し、神経系に格納されていますか？幼虫の発育中の神経系の研究は、この質問に答えるのに役立ちます。
ショウジョウバエの開発のこの段階で、生物は蛹化時に発生する膨大な形態学的変化を受けるように準備を進めている。この時間の間に、神経筋システムの大規模な改造は、クロールウジから大人のフライにorgansim遷移として発生します。それは、ニューロンが開発のこの段階で変更すると動作が同じタイプの高等動物の神経細胞で観察できるかどうかを判断する興味深いものになる。
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開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| ピンセット | 先端細型 | |||
| 9ウェル時計皿 | ||||
| プラスチック製ペトリ皿 |
参考文献
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
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