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アッセイを開始する前に、我々は、以下の試薬が正しく準備されていることを確認する必要があります。
- 50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5の。カリウムphospate二塩基、水を精製し、1M HClでpHを調整するの三水和物11.4 mg / mlのを使用して準備します。この溶液を37で使用する° Cの前に配置されます。
- 50mMリン酸カリウム緩衝液中でカゼインの6.5 mg / mlに混合して調製した0.65％重量/容積カゼイン溶液、。均一な分散が達成されるまで徐々に緩やかに攪拌しながら溶液の温度は℃で約10分間80から85に増加した。それは解決策を沸騰しないように非常に重要です。 NaOHとHClで必要に応じてpHを調整されます。
- 精製水を6.1Nの株式1時55分を希釈した110 mMのトリクロロ酢酸溶液を、。トリクロロ酢酸は強酸であり、取り扱いには注意してください。
- 0.5mMのフォリン＆Ciolcalteaの、または直接プロテアーゼの活性に関連する測定可能な色の変化を生成するチロシンと反応するソリューションですフォリンのフェノール試薬、。フォリンのフェノール試薬は酸であり、取り扱いには注意してください。
- 精製水にanyhydrous炭酸ナトリウム53 mg / mlのを用いて調製した500mMの炭酸ナトリウム溶液、。
37 5mMの酢酸カルシウムと10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH7.5、で構成される酵素希釈液を、℃のこのソリューションは、我々は固体プロテアーゼのサンプルを溶解または酵素液を希釈するために使用するものです。 - 1.1 mmのL -チロシン標準原液。精製水に0.2 mg / mlのL -チロシンを用いて調製し、チロシンが溶けるまで穏やかに加熱。カゼインと同様に、このソリューションを沸騰されません。 L -チロシン標準を室温に戻します。このソリューションは、当社の標準曲線を作成するためにさらに希釈されます。
- プロテアーゼ溶液。使用する直前に、ステップ6で準備酵素希釈液にプロテアーゼを溶解する。
必要に応じて、0.1〜0.2単位/ mlに酵素希釈液を用いて溶解されている所定の活動の固体プロテアーゼのサンプルを、使用してください。このソリューションは、品質管理アッセイの陽性コントロールとして、我々は酵素活性を決定するために実行する計算のための検証として提供しています。
プロテアーゼアッセイや標準曲線を設定する
- このアッセイを開始するには、約15 MLSを保持する適切なバイアルを見つける。テストされる各酵素について、4つのバイアルが必要です。 1バイアルは、空白として使用され、そして3人は、プロテアーゼの三希釈液のアッセイの活動に使用されます。お互いに最終計算をチェックする際に三希釈に便利です。
- fourバイアルの各セットに、私たちの0.65％カゼイン溶液の5mlsを追加。それらを37℃の水浴中で平衡化させて° Cを約5分間。
- 酵素の試験のサンプルバイアルの3つにテストされるソリューションではなく、ブランクの様々なボリュームを追加します。ちょうど10分間37 ° Cのために渦巻くとインキュベートして混合。このインキュベーション時間中のプロテアーゼ活性およびチロシンの必然的な解放は、測定および試験サンプル間で比較されるものです。
- この10分間のインキュベーション後、反応を停止するには、各チューブにTCA試薬の5mlのを追加します。次に、各チューブ内の酵素溶液の最終体積が1ミリリットルになるように、、各チューブにさえブランクを酵素溶液の適切な量を追加します。これは、酵素自体の吸光度値を考慮すると、各チューブに最終容量が等しいかどうかを確認するために行われます。 37ソリューションをインキュベート℃で30分間。
この30分間のインキュベーションの間に、あなたのチロシン標準希釈液をセットアップすることもできます。簡単に8 MLSを保持できる6 DRAMバイアル（ドラムのバイアルは、ポリプロピレンチューブに置換することができます）を使用してください。 0.05、0.10、0.20、0.40、0.50シックスバイアルに、MLSに以下のボリュームで1.1 mmのチロシン標準のストック溶液を加える。空白に任意のチロシン標準を追加しないでください。下の規格は、ほとんど色の変化が得られる不純なテストサンプル用に必要になる場合があります。チロシン標準溶液を添加した後は、2 MLSのボリュームをもたらすための基準の各々に精製水の適切な量を追加します。 - 30分間のインキュベーションの後、試験溶液と0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用して空白の各フィルタをかける。ろ過は、サンプルから任意の不溶物を除去するために必要です。
- 少なくとも8 MLSを保持できる4ドラムバイアルにろ過2テストサンプルのMLSと空白のろ液を追加。規格が準備されたバイアルの同じタイプを使用することができます。
- 規格と標準空白を含むバイアルのすべてに、炭酸ナトリウムの5mlsを追加。最良の結果を得るには、すぐ後にフォリン試薬1mlを加える。
- フォリン試薬の添加によって作成された任意のpHの低下を調整するために炭酸ナトリウムを追加。
- テストサンプルとTESに炭酸ナトリウムを追加tのブランク。これらのソリューションは、炭酸ナトリウムの添加後に濁ってくる。無料のチロシンと主に反応するフォリン試薬を、追加。
- 渦巻きによってDRAMのバイアルを混合し、30分間37℃でインキュベートする。
このインキュベーション後に、基準がチロシン付加量と相関する色のグラデーションを持っていることに気付くはずです。チロシンの最高濃度は、最も濃い色に現れる。また、私たちのテストサンプルでかなりの色の変化に気づくことができる。これらのソリューションの2mlsは、適切なキュベットに0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用してフィルタリングされます。アッセイが行われるので、今度は私たちの吸光度値を記録するために分光光度計に進むことができます。
吸光度を測定し、酵素活性の計算
- サンプルの吸光度は、660nmの波長を用いて分光光度計によって測定されます。光パスは、1センチメートルに設定されています。規格、標準的な空白、別のテストサンプル、およびテストのブランクの吸光度値を記録します。すべてのデータが収集された後、標準曲線を作成することができます。曲線を生成するために、標準と標準のブランクの間の吸光度の差を計算する必要があります。これは、標準溶液中のチロシンの量に起因する吸光度の値です。この簡単な計算の後、Y軸上の私たちの基準の吸光度の変化に対し、X軸上の私たちの5標準の各マイクロモルの量をプロットするグラフプログラムを使用して標準曲線を作成します。
| チロシン標準の音量 | チロシンuMoles |
|---|
| 0.05 | 0.055 |
| 0.10 | 0.111 |
| 0.20 | 0.221 |
| 0.40 | 0.442 |
| 0.50 | 0.553 |
- データ点を入力したら、最高のフィット感と、対応するスロープ式のラインを生成する。
試験サンプルの吸光度とテストのブランクの吸光度との差を計算することにより、テストサンプルの吸光度の変化を見つける。スロープ式にテストサンプルの1つのための吸光度値を挿入し、解決することは、この特定のタンパク質分解反応中のチロシン解放のマイクロモルになります。 / mlあたり単位で酵素の活性を得るために、次の計算を実行します。
（umoleチロシン同等物が放出さ）×（11）
単位/ mlの酵素= __________________________________________
（1）×（10）×（2）
アッセイの11 =総体積（ミリリットル）
アッセイの10 =時間（分単位）単位の定義に従って
1酵素の酵素の=ボリューム（ミリリットル）を使用
比色定量に使用されている2 =ボリューム（ミリリットル）
斜面の方程式から得られるマイクロモルのチロシンに相当リリースの数を取り、我々の場合に11mlsであるMLS、のアッセイの合計量を掛けます。他の3つの量がこの値を分ける：（のは1ミリリットルを使用できるように）変化させた我々は10分間実行したアッセイの時間、、アッセイで使用される酵素の量、、比色検出に使用されるミリリットルの容積、これかもしれないあなたのキュベットに基づいて異なります。私たちは2 MLSを使用する。 - "ユニット"と呼ばれるプロテアーゼ活性の分収率の測定に時間で割ったチロシンのマイクロモル。私たちは、単位/ mlの条件で酵素活性のmeasurmentを残して、分子と分母の体積測定の単位を取り消すことができます。酵素希釈液で希釈した固体プロテアーゼのサンプルでのアクティビティを決定するために、我々はmg / mlで、もともとこのアッセイで使用される固体の濃度で単位/ mlで私たちの活動を割ります。、単位/ mgの面での活動を私たちに残して。
ユニット/ ml酵素
単位/ mgの固体= _____________________
MGソリッド/ mlの酵素