環境ソースから細菌のグラム染色

1. サンプル コレクション

1. 微生物分析検査室に土のサンプルとトランスポートを収集します。
2. 演習では、10 g サンプル分析用天秤を使用して重量を量る。
3. リン酸緩衝生理食塩水 95 mL に、サンプル 1:10 の希釈 (10 の部分の土壌は 5 パーツ水性液に相当) と (図 2ステップ 1) をミックスする渦。
4. その後 1:10 を実行、mL 当たり少なくとも 10^-5 g まで希釈土壌し、拡散板 2 つまたは低栄養寒天媒体 (例えばR2A) に 3 つのレプリケートで希釈を選択した (図 2、手順 2-3)。
5. (図 2手順 4) 室温で 1 週間の版を孵化させなさい。
6. 隔離、および (図 3、ステップ 1-3) 新鮮な寒天に連勝の 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
7. 縞板室温 (図 3のステップ 4) で 2 〜 3 日間インキュベートします。

2. 細菌塗抹標本の作製

1. 隔離されたコロニーの縞板を観察します。
2. 各塗抹標本準備の準備、接種したループを浸しエタノール、火炎滅菌し、滅菌蒸留水 1 に 2 loopfuls をあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドの中央に配置。
3. 上記のようにもう一度接種したループを滅菌します。いったん冷却、単一の隔離されたコロニーから少量の文化を削除し、(塗抹標本は希釈脱脂乳になります) スライドの水滴をミックスします。接種したループは、植民地の分離前に冷却しなければなりません。高温でループになりますコロニーやスプラッタ、中長期菌エアロゾル化につながる可能性があります。一般的には、ループが使用する熱すぎるとき「ヒスノイズ」寒天または植民地に適用、聞かされます。ループの不適切な冷却効率の文化-スライド転送と細胞形態の歪みの可能性があります。
4. 塗抹標本を測定約 2.5 cm × 2.5 cm、スライドの表面に広がるし、それを空気乾燥を許可します。空気層流条件下で発生する乾燥が重要です。スライドを乾燥塗抹標本を妨害しないように吹きしない必要があります。また、スライドでは、炎で乾燥させた、細胞の形態を維持するためにする必要がありますできません。
5. 乾燥後、熱は 2 〜 3 倍、炎を素早くスライドを渡すことによって塗抹標本を修正します。スライドをスライド ガラスに細胞の形態および/または損傷の歪みを防ぐために、炎の中で固定開催しない必要があります。

3. グラム染色

1. きれいな洗濯はさみを使用して 1 つの端にスライドを固定します。
2. クリスタル バイオレット (プライマリ染色) で汚れをカバー、2 〜 3 分押し続けます。
3. 蒸留水を使用してスライドを慎重に洗います。水の流れは、損傷および/またはスライド ガラスからの剥離を防ぐために塗抹標本でない監督する必要があります。
4. グラムのヨウ素塗抹標本をカバーし、2 分間保持水スライドを優しく洗浄します。
5. 95% のエタノールを使用して汚れをもはやスライドから洗うまで塗抹標本を脱色 (これは通常 20 以上かかる塗抹標本の厚さに応じて s)、すぐに水で洗い流し。この手順は、スライドで、偽グラム染色指定 (すなわち、グラム変数) につながる可能性がありますを脱色を避けるために重要です。
6. 塗抹標本に対比染色 (サフラニン) を追加を押し 30 秒。蒸留水を使用してスライドを洗い流し優しく、しみ、乾燥が吸水紙を使用します。

4. スライドの顕微鏡

1. (例えば4 X、10 X)、低高ドライ (例えば40 X) を使用してスライドを観察し、オイルの浸漬 (100 X) 目的。オイルの液浸、塗抹標本に直接オイルを追加します。
2. グラム陽性およびグラム陰性の土壌細菌の代表的な結果は、図 4と5を参照してください。

図 2。希釈・拡散めっき技術。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。ストリーク プレート法によるコロニーの分離。

図 4 。グラム陽性細菌黄色ブドウ球菌.

図 5。グラム陰性細菌大腸菌.