2.3: 環境ソースから細菌のグラム染色

1. サンプル コレクション

1. 微生物分析検査室に土のサンプルとトランスポートを収集します。
2. 演習では、10 g サンプル分析用天秤を使用して重量を量る。
3. リン酸緩衝生理食塩水 95 mL に、サンプル 1:10 の希釈 (10 の部分の土壌は 5 パーツ水性液に相当) と (図 2ステップ 1) をミックスする渦。
4. その後 1:10 を実行、mL 当たり少なくとも 10^-5 g まで希釈土壌し、拡散板 2 つまたは低栄養寒天媒体 (例えばR2A) に 3 つのレプリケートで希釈を選択した (図 2、手順 2-3)。
5. (図 2手順 4) 室温で 1 週間の版を孵化させなさい。
6. 隔離、および (図 3、ステップ 1-3) 新鮮な寒天に連勝の 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
7. 縞板室温 (図 3のステップ 4) で 2 〜 3 日間インキュベートします。

2. 細菌塗抹標本の作製

1. 隔離されたコロニーの縞板を観察します。
2. 各塗抹標本準備の準備、接種したループを浸しエタノール、火炎滅菌し、滅菌蒸留水 1 に 2 loopfuls をあらかじめ洗浄し、ガラスのスライドの中央に配置。
3. 上記のようにもう一度接種したループを滅菌します。いったん冷却、単一の隔離されたコロニーから少量の文化を削除し、(塗抹標本は希釈脱脂乳になります) スライドの水滴をミックスします。接種したループは、植民地の分離前に冷却しなければなりません。高温でループになりますコロニーやスプラッタ、中長期菌エアロゾル化につながる可能性があります。一般的には、ループが使用する熱すぎるとき「ヒスノイズ」寒天または植民地に適用、聞かされます。ループの不適切な冷却効率の文化-スライド転送と細胞形態の歪みの可能性があります。
4. 塗抹標本を測定約 2.5 cm × 2.5 cm、スライドの表面に広がるし、それを空気乾燥を許可します。空気層流条件下で発生する乾燥が重要です。スライドを乾燥塗抹標本を妨害しないように吹きしない必要があります。また、スライドでは、炎で乾燥させた、細胞の形態を維持するためにする必要がありますできません。
5. 乾燥後、熱は 2 〜 3 倍、炎を素早くスライドを渡すことによって塗抹標本を修正します。スライドをスライド ガラスに細胞の形態および/または損傷の歪みを防ぐために、炎の中で固定開催しない必要があります。

3. グラム染色

1. きれいな洗濯はさみを使用して 1 つの端にスライドを固定します。
2. クリスタル バイオレット (プライマリ染色) で汚れをカバー、2 〜 3 分押し続けます。
3. 蒸留水を使用してスライドを慎重に洗います。水の流れは、損傷および/またはスライド ガラスからの剥離を防ぐために塗抹標本でない監督する必要があります。
4. グラムのヨウ素塗抹標本をカバーし、2 分間保持水スライドを優しく洗浄します。
5. 95% のエタノールを使用して汚れをもはやスライドから洗うまで塗抹標本を脱色 (これは通常 20 以上かかる塗抹標本の厚さに応じて s)、すぐに水で洗い流し。この手順は、スライドで、偽グラム染色指定 (すなわち、グラム変数) につながる可能性がありますを脱色を避けるために重要です。
6. 塗抹標本に対比染色 (サフラニン) を追加を押し 30 秒。蒸留水を使用してスライドを洗い流し優しく、しみ、乾燥が吸水紙を使用します。

4. スライドの顕微鏡

1. (例えば4 X、10 X)、低高ドライ (例えば40 X) を使用してスライドを観察し、オイルの浸漬 (100 X) 目的。オイルの液浸、塗抹標本に直接オイルを追加します。
2. グラム陽性およびグラム陰性の土壌細菌の代表的な結果は、図 4と5を参照してください。

図 2。希釈・拡散めっき技術。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。ストリーク プレート法によるコロニーの分離。

図 4 。グラム陽性細菌黄色ブドウ球菌.

図 5。グラム陰性細菌大腸菌.

グラム染色により、細菌の形態を迅速に可視化し、幅広い環境サンプルから幅広い細胞を区別できます。バクテリアを染色するために、均一な塗抹標本をガラス面に塗布し、乾燥させます。塗抹標本を熱固定した後、クリスタルバイオレットを塗布します。

脱色剤は、グラム陰性細胞からクリスタルバイオレットを洗い流しますが、グラム陽性細胞からは洗い流しません。第2の色素(通常はサフラニン)は、グラム陰性細胞を視覚化するためのバックグラウンド染色として使用されます。染色後、細胞の形態、サイズ、鎖やクラスターなどの配置を評価することができます。

このビデオでは、環境サンプルを調製し、そこに見られる細菌種を分離し、分離されたコロニーでグラム染色を行う方法を示します

グラム染色により、ほとんどの細菌をグラム陽性菌とグラム陰性菌の2つの大きな構造クラスに分類できます。どちらのクラスも基礎となるリン脂質原形質膜を持っていますが、細胞壁の構造は大きく異なります。グラム陽性細胞壁は、主に糖とアミノ酸からなるポリマーであるペプチドグリカンの厚い層で構成されています。グラム陰性細胞壁は、ペプチドグリカンの薄い層を持ち、第2の脂質膜の間に挟まれています。この外膜には通常、リポ多糖が含まれています。

正に帯電したクリスタルバイオレットは、負に帯電した細菌細胞壁に弱く結合します。グラムのヨウ素は、クリスタルバイオレット色素と不溶性錯体を形成し、それによって細胞壁に固定されます。

脱色工程では、グラム陽性細胞のペプチドグリカンが脱水され、結晶バイオレット-ヨウ素複合体が収縮してトラップされます。グラム陰性細胞では、脱色剤が外膜を損ない、その多孔性を増加させます。これにより、結晶バイオレット-ヨウ素錯体を洗い流すことができます。

グラム染色の土壌細菌の背後にある原理を理解したところで、実験室で土壌細菌に対して実行されるプロセスを見てみましょう。

現場で土壌サンプルを採取した後、それを実験室に持ち込んで分析します。ふるいでサンプルを精製し、分析天びんを使用して、ふるいにかけた土壌の10gを秤量します。

サンプルを95 mLのリン酸緩衝生理食塩水に希釈し、ボルテックスで混合します。さらに1〜10回の希釈を行い、各希釈間でボルテックスします。少なくとも3回連続して希釈したアリコートを、複製する低栄養アガロースプレートに移します。

エタノール炎滅菌を行い、曲げたガラス棒を媒体に叩いて冷却した後、サンプルをプレートの表面に広げます。プレートを室温でインキュベートします。3〜5日間インキュベートした後、30〜300個の個別のコロニーで最も高い希釈率を選択します。滅菌接種ループにより、目的のコロニーを選択して分離します。

コロニーを新しいプレートの1つのセクションに縞模様にします。縞の間のループを滅菌し、プレートの各セクションにジグザグパターンで連続した縞を作成し、その後の離散的な単一コロニーの分離を可能にします。プレートを室温で1〜2日間インキュベートします。

細菌塗抹標本の調製を開始するには、取り扱いを容易にするために、事前に洗浄されたスライドガラスにクリップを取り付けます。各細菌塗抹標本について、接種ループを洗浄し、火炎滅菌します。スライドの中央に2ループの滅菌蒸留水を置きます。

ループを再度滅菌した後、分離されたコロニーから少量の培養物を取り出し、スライド上の水と混合します。培養物に触れる前に、寒天の未接種部分を数回軽くたたいてループを冷却することが重要です。塗抹標本は希釈された牛乳に似ているはずです。スライドを室温で乾かします。乾燥後、塗抹標本をすばやく炎に通して熱固定します。

乾いたら、クリスタルバイオレットを塗抹標本にピペットで移し、2〜3分間放置します。スライドの上部に直接流れを向けて、スライドを蒸留水で慎重にすすぎ、水が穏やかに流れ落ちるようにします。水の流れを直接塗抹標本に向けないでください。

スライドをグラムのヨウ素で覆います。2分後、蒸留水でやさしくすすいでください。汚れが洗い流されなくなるまで、スライドを95%エタノールで脱色します。すぐに蒸留水ですすいでください。これにより、汚れの過度の脱色が制限されます。

サフラニンを対比染色として塗抹標本に30秒間加えます。これにより、存在するグラム陰性細胞が染色されます。蒸留水でやさしくすすぎ、吸収紙で吸い取り乾燥します。得られたスライドを顕微鏡で観察します。最初に低倍率対物レンズを使用して大まかな調整を行い、汚れの理想的な部分を見つけてから、高倍率の小さな視野に移ります。

さらにイメージングを行い、中倍率対物レンズで塗抹標本を調整した後、塗抹油を直接塗抹標本に加えます。このオイルは、最高の顕微鏡写真を提供する高出力対物レンズに必要です。グラム陽性菌は青色または紫色に見えますが、グラム陰性菌は赤色またはピンク色に見えます。得られた顕微鏡写真から、細胞壁の構造だけでなく、形状や配置も解明されます。

グラム染色が細菌を定性的に研究する能力は、幅広い科学分野にとって重要です。

土壌は、バクテリアを分離して分析できる環境源の1つにすぎません。飲料水の場合、サンプル調製を変更する必要があります。水道水のサンプルは、蛇口から採取し、多様な従属栄養性細菌コロニーの成長を促進する成長培地にメッキすることができます。R2Aなどの媒体にめっきすると、プロセスは土壌手順とほぼ同じです。

特定の細菌同定技術では、パラメータは目的の細菌の細胞壁の種類に依存します。この例では、敗血症患者の血液が検査され、グラム陽性菌が潜んでいることがわかりました。

この情報をもとに、細胞のrRNAに結合する種特異的なペプチド核酸プローブを選択した。これらのプローブは、存在する種を同定するために使用された蛍光色素に結合しました。

グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞構造には根本的な違いがあるため、細菌はクリスタルバイオレット以外の化合物に対して独自の反応を示します。この実験は、糞便サンプルからグラム陽性菌であるクロストリジウム・ディフィシルを単離することを目指しました。グラム陰性細胞の増殖を阻害するシクロセリンを寒天プレートに添加しました。プレート上で増殖したグラム陽性細胞は、他の方法によってさらに単離されました。

JoVEによる環境研究のためのグラム染色の紹介をご覧になりました。これで、プロセスの利点と、手法を実行して結果を活用する方法を理解する必要があります。ご覧いただきありがとうございます!