堆積物中のバイオ マーカーの抽出溶媒抽出を加速
ソース: ジェフ Salacup - マサチューセッツ大学アマースト校講座
グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers (GDGTs)、古細菌と細菌のスイート プロデュースと呼ばれる有機バイオ マーカーのグループの分布は、空気への応答で予測可能な方法で変更または水の温度1, 2現…
1. 必要な資料の収集
- サンプルを抽出します。(この場合は堆積物) のサンプルは凍結、凍結乾燥、粉砕と抽出、前に均質化、効率を最大にするグループで抽出します。
- サンプルのサイズ、に応じて 40 または 60 mL のボリューム コレクション バイアルを使用します。この実験では、ホウケイ酸ガラスの瓶 (40 mL) と溶剤の安全キャップを使用します。燃焼バイアル、ホウケイ酸ガラス ピペットおよび 550 ° C、6 h 可能な有機汚染物質の除去を確実に事前に計量缶。
- ほとんどの有機地球化学研究室では、ジクロロ メタン (DCM) とメタノールを共通です。それらを個別に使用して、(メタノール最初、DCM が続く) 実験室のツールと使用前にガラスを洗浄します。多くのラボでメタノール (メタノール; 9:1) ジクロロ メタンの混合物を使用することで、効率的に極性の広い範囲でバイオ マーカーを抽出します。溶剤は、有機汚染物質の無料する必要があります。
- この実験に使用する加速の溶媒抽出を取得します。
2. サンプル細胞の調製
- 各サンプルを抽出するためのサンプル細胞に加えて、1 つの空白を組み立てます。
- 各セルの細胞体の一方の端に端点キャップをネジします。
- 燃焼ガラス繊維フィルターを溶剤洗浄のピンセットを使用して各セルの上に配置します。その後、静かにゆっくりをフィルター プランジャーを使用しているセルにフィルターを押し下げます。
- ラベルの番号 (例: 1-22) 各サンプルの細胞体と、空白のセルに「空白」を書きます。
- 珪藻土 (または砂) で空白を塗りつぶすし、2 番目のエンド キャップとキャップします。手で締めます。
3. 試料の調製
- ラボ ・風袋錫の重量を量る燃焼を配置します。
- 洗浄溶剤、ラボへら計量錫に適切なサンプル量を転送するためにそれを使用し、質量を記録します。
- 試料の質量は、その有機物の含有量によって異なります。有機物豊富な材料 (葉組織) が、はるかに少ない必要ですが、比較的有機物の無駄のない材料 (海泥) は数グラムを必要があります。
- 準備された ASE セルにすべての計量のブリキ缶に材料を転送します。
- セルの上に別のガラス繊維フィルターを配置し、フィルターのプランジャーを使用してサンプルの上部に到達するまでゆっくりと優しく押してダウン。
- それがほぼいっぱいまでのセルに珪藻類地球 (または砂) を追加します。細胞体のスレッドから任意の残骸を削除する注意してください。
- 別のエンド キャップとセルの上端をキャップします。
- 各サンプルの 3.1 3.6 の手順を繰り返します。
4. コレクション バイアルの作製
- 対応するセル (例えば1-22 または空) と ASE コレクション バイアル キャップとキャップの数と各バイアルにラベルを付けます。
5. 抽出
- 上段の ASE トレイの番号のスロットに各サンプル セルを配置します。
- 低い ASE 皿に同じ数のスロットに対応するコレクション バイアルを配置します。
- ASE のキーパッドを使用して抽出を作成します。100 ° C で 1,200 psi を抽出します。抽出は、各サンプル 3 x 10 分の静的保持と静的な保持間総容積の 50% の細胞体をフラッシュします。
- 溶媒ボトルにすべてのサンプルを抽出する十分な溶剤が含まれていることを確認します。
- リンス ASE 3 x ASE コントロール パッドの「すすぎ」ボタンを押して実行を開始する前に。
- スタートを押します。
加速溶媒抽出は、多数の地質堆積物サンプルから有機バイオマーカーを分離するために使用される、高速、効率的、かつハイスループットな手法です。
伝統的に、超音波処理やソックスレーなどの抽出方法が使用されますが、これらのプロトコルの欠点は、詳細な古気候の再構築に十分な材料を処理するには遅すぎることです。新しい技術であるAccelerated Solvent Extraction(ASE法)は、効率とハイスループットを念頭に置いて開発されました。
ASE法は、高温と高圧の組み合わせを使用してサンプルを抽出し、1回の比較的高速な調製実行で複数のサンプルを実行できます。
このビデオは、堆積物からバイオマーカーを抽出する方法を詳しく説明するシリーズの第3弾です。それは手順をカバーし、超音波処理またはソックスレー抽出に対するASEのメリットについての洞察を提供します。
加速溶媒抽出では、サンプルをスチールセルにロードし、スチールセルにロードします。各サンプルセルの収集バイアルも、別々のカルーセルにロードされます。この装置は、サンプルセルを内部オーブンにロードします。溶剤は、十分な圧力に達するまで、溶剤ボトルから一連のバルブを介してポンプで送り込まれます。
この圧力は、サンプルと分析物によって決定される時間一定時間保持されます。次に、溶媒をサンプルセルからスチールラインを介して対応する収集バイアルに洗い流します。このプロセスは何度も繰り返すことができます。温度、圧力、および持続時間はすべて、サンプルに合わせてカスタマイズできます。
使用される高温は抽出の動力学を増加させ、高圧は溶媒の揮発を防ぎます。コレクションバイアルには総脂質抽出物が含まれており、サンプルセルに残っているものは残留物と呼ばれます。これは、非有機材料と、ケロジェンと呼ばれる溶媒抽出性のない有機材料で構成されています。
加速溶媒抽出の原理を理解したところで、これを実験室でどのように実施するかを見てみましょう。
関心のあるサンプルを収集した後。凍結乾燥、均質化、除染は、このシリーズの別のビデオで示されているように行います。
すべてのサンプルが準備されたら、抽出する各サンプルのセルを組み立て、ブランク用に1つのセルを組み立てます。これを行うには、エンドキャップをセル本体にねじ込みます。溶剤ですすいだピンセットを使用して、燃焼ガラス繊維フィルターを各ピンセットの上に置きます。プランジャーでフィルターをゆっくりとそっと押し下げます。
各サンプルの番号で細胞体をラベル付けし、ブランクを別々にラベル付けします。燃焼させた計量缶を実験室のはかりと風袋引きに置きます。スパチュラを溶媒ですすぎ、それを使用して5〜10 gのサンプルを計量缶に移し、質量を記録します。
計量缶内のすべての材料を対応するセルに移します。別のグラスファイバーフィルターを上に置き、サンプルの上部に達するまで軽くタンピングします。
珪藻土や砂などの分散剤をほぼいっぱいになるまで加え、細胞体の糸に破片が入らないように注意します。セルの上部を別のエンドキャップでキャップします。各サンプルとブランクについて、これらのステップを繰り返します。
各コレクションバイアルに対応するサンプルセルまたはブランクの番号をラベル付けし、バイアルキャップでキャップします。各セルを上部ASEトレイの番号付きスロットに配置します。ASEのキーパッドを使用して抽出方法のパラメータを設定し、100 ?C?および1,200 psi。10分間の静的保持で各サンプルを3回抽出し、静的保持の間に細胞本体を総体積の50%でフラッシュします。
次に、溶媒ボトルにすべてのサンプルを抽出するのに十分な量が含まれていることを確認します。実行を開始する前に、計器ラインを3回すすいでください。最後に、スタートを押します。
バイアルをASEから取り出します。バイオマーカーが抽出されたので、分析前に精製する必要があります。
Accelerated Solvent Extractionは汎用性の高い手法であり、さまざまなアプリケーションに活用できますが、ここではその一部について説明します。
加速溶媒抽出は、食品を含む他の種類のサンプルにも使用できます。農薬汚染を試験するための残留物分析は、果物や野菜などの食品の安全性と品質を確認するために、規制施設や産業施設で頻繁に実施されます。ASEは、食品サンプルから有機塩素系農薬を抽出し、農産物に存在する残留物の種類またはレベルを決定するために使用できます。この情報は、農産物が人間または動物の消費に適しているかどうかを確認するために使用できます。たとえば、ディルドリンは、製品にもよりますが、食品の0〜0.1ppm以内で見つけることができます。
食品の栄養成分は、ASEを使用して抽出することもできます。例えば、重量脂肪含有量が高いチョコレートのような製品を抽出することができます。石油エーテルを溶媒として含むASEを使用すると、脂肪をチョコレートサンプルから分離し、定量分析を行って、既知のチョコレート量あたりの脂肪含有量の正確な割合を決定できます。この情報を使用して、規制当局はチョコレート製造業者の主張を確認したり、製造業者は正確な食品ラベルを作成するための情報を入手したりできます。
JoVEの加速溶媒抽出(ASE)を使用した脂質バイオマーカーの抽出に関する紹介をご覧になりました。さらなる処理と分析の方法については、後続のビデオで説明します。
ご覧いただきありがとうございます!
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.