細菌の成長曲線の解析と環境応用

細菌の増殖速度を測定することは、基本的な微生物学的手法であり、基礎研究だけでなく、農業や工業への応用にも広く使用されています。

バクテリアは地球上で最も豊富な生命体の一つであり、人体を含むすべての生態系に存在しています。また、特定の細菌種は遺伝的に非常に扱いやすく、研究モデルとして、または工業規模で天然または合成製品を生産するために利用されてきました。ただし、すべての細菌種を実験室で培養できるわけではありません。それが可能な人にとって、重要な特性は増殖率、または「成長速度論」です。

細菌培養物の増殖速度を測定することは、科学者にその生理学的および代謝的機能について情報を提供することができ、また、下流のアプリケーションのために細菌の正確な細胞数を取得するのにも役立ちます。

このビデオでは、細菌の成長率分析の背後にある原理を紹介し、「成長曲線」で成長率を特徴付けるためのプロトコルを示し、最後に、細菌の増殖速度を測定するためのいくつかの環境科学アプリケーションを探ります。

細菌は一般に無性生殖をし、1つの親細胞が2つの同一の娘細胞に分裂する単純な二元分裂によって増殖します。栄養素が豊富に利用可能で、温度などの環境パラメータがすべて成長を助長する良好な成長条件下では、増殖率は死亡率をはるかに上回ります。これにより、指数関数的な成長がもたらされます。

培養物中の細菌の量を時間の関数として測定することにより、成長曲線を得ることができます。最適な条件下で液体培養物中で細菌を増殖させると、さまざまな相に分けることができる特徴的な形状の成長曲線が生成されます。曲線は、細菌が培養条件に順応する間、成長が遅い「ラグフェーズ」から始まります。次は「log」または「exponential phase」で、バクテリアが指数関数的に成長します。栄養素が枯渇し、老廃物が蓄積すると、成長は最終的に停止し、「固定相」になります。最後に、増殖速度が細胞死速度に追い越されると、培養物は「死期」に入ります。

成長曲線を構築するために、液体培養液のフラスコ内の細菌数を、培養期間の異なる時点でカウントします。細菌数は、いくつかの異なる方法で取得できます。一般的なアプローチの1つは、600nmの波長で細菌溶液が光を吸光する光の光学密度(または「OD」)600を測定することです。

別の方法は、培養物のミリリットルあたりの「CFU」、またはコロニー形成単位を決定することです。細菌の増殖にはクローン性があるため、培養物中の1つの細菌は、理論的には寒天プレート上の1つの観察可能なコロニーに拡大する可能性があります。細菌培養物を一連の希釈液でめっきして、個々の離散的なコロニーを観察できる細菌濃度に達することにより、「連続希釈めっき」と呼ばれる方法により、コロニーカウントを使用して、1mLあたりのCFUで細菌濃度を逆算できます。

細菌の増殖解析方法を理解したところで、確立された細菌モデルである大腸菌の純培養物で、段階希釈めっき法を用いて増殖曲線解析を行うためのプロトコルを見ていきましょう。

収集の1日前に、滅菌済みのトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)を20mLのフラスコに接種し、大腸菌のコロニーを1つ含みます。

37歳で一晩で培養しますか?振るC。大腸菌の場合、これにより、固定期の集団は約109 CFU/mLになります。

翌日、100人分を接種しますか?Lを500 mLフラスコ中のTSB250 mLに一晩培養します。よく混ぜます。これにより、約4 x 105 CFU/mLの希釈培養物が得られます。この希釈した培養物を5 mLを培養チューブに保存します。これは、時点 0 (T0) からのアリコートです。4°Cですぐに冷蔵します。

残りの培養量を37 ?振るC。その後1時間ごとに最大8時間、培養物から5mLのアリコートを回収します。これらのサンプルをT1からT8に指定し、それらすべてを4 ?使用までC。

実験当日は、大腸菌のタイムポイントアリコートを冷蔵庫から取り出し、氷の上に置いておきます。滅菌マイクロチューブを使用し、それぞれに900本入りですか?滅菌生理食塩水のL、次の表に従って各アリコートの希釈シリーズを設定する。

T0培養物を穏やかにボルテックスしてよく混合し、100 ?LからチューブAへの希釈シリーズで、1-in-10、または10-1の希釈を行います。ボルテックスチューブAを混合し、新しいピペットチップを使用して、100 ?チューブAのLからチューブBへ、1-in-100、または10-2希釈を行います。

各培養分注についてこのプロセスを繰り返し、表2に従って適切な希釈シリーズを作成します。すべての時点のサンプルの希釈シリーズが作成されたら、細菌めっき用に適切な数の滅菌トリプチカーゼ大豆寒天プレートを準備します。

各タイムポイント培養の3希釈液を、下表に従って三重に播種します。それに応じてプレートにラベルを付けます。では、ピペット100?各培養物のLを、それぞれの寒天プレートの中心に。「L」字型のガラス棒を火炎殺菌し、接種物から離れた寒天に棒を触れて冷まし、すぐに液体を寒天表面に広げます。拡散が遅れると、接種部位で細菌が過剰に増殖する可能性があることに注意してください。

9つの時点の培養物すべてについて各希釈シリーズをプレーティングし続け、各希釈シリーズ間でガラス拡散ロッドを火炎滅菌します。

プレートを数分間乾燥させたら、逆にして37?Cインキュベーター一晩。この成長期間の後、プレートは4°Cで保存することができます。

希釈プレートを一晩インキュベートした後、コロニーの汚染と均一性についてそれらを調べます。各タイムポイント培養について、プレートあたり30〜300コロニーの希釈液を選択します。その希釈のために、各トリプリケートプレート上のコロニーの数を数えます。

各希釈の平均コロニー数と希釈係数を使用して、各時点における元の培養物中の細菌の濃度をCFU/mLで計算します。例えば、10-4の0.1 mL、つまり10,000分の1の希釈液から得られたトリプリケートプレートセットに平均30のコロニーがある場合、30を0.1 mLで割った値に10,000を掛けた値、つまり300万CFU/mLになります。

各時点で計算された細菌濃度を使用して、細菌濃度の base-10 対数 (CFU/mL) を時間単位に対してグラフ化します。グラフから、元の細菌培養物の成長の対数期を特定し、対数期内の2つの時点を選択し、これらの最初の時点をt = 0として指定します。式 X は 2 に n の累乗に X0 を掛けて計算し、X は時間 t での細菌濃度、X0 は t = 0 での初期濃度、n は 2 つの時点間で経過した世代数です。

例えば、X0 が 1,000 CFU/mL で、t = 6 h の濃度が 16,000 CFU/mL であるとします。この方程式を使用すると、6時間以内に4世代が発生したことがわかり、6の生成時間を4で割った値、つまり1世代あたり1.5時間になります。

細菌の増殖速度の測定は、研究、農業、またはバイオエンジニアリング目的の多くのアプリケーションの基本です。

細菌の増殖速度を知るための1つの用途は、別の培養物または培地に接種するために正確な量の細菌培養物を得ることを可能にすることです。たとえば、マメ科植物などの特定の作物は、植物の根にコロニーを形成して結節を形成し、窒素を「固定」する根粒菌として知られる共生細菌と一緒に栽培する必要があります。これは、大気中の窒素を植物が利用できるアンモニアに変換します。農業用途では、既知量の根粒菌を泥炭ベースの炭素培地に添加し、それを使用してマメ科植物の種子を接種して植物と細菌の共生を確立します。

成長解析は、産業廃棄物を分解し、貴重な副産物を生成する可能性のある細菌種を特定するためにも使用できます。この例では、研究者は、木材パルプ化や製紙からの廃棄物である黒液を添加した成長培地が、環境微生物分離株の成長にどのように影響したかを調査しました。

細菌は黒液で成長が促進されただけでなく、「二相性」成長パターンも示し、細菌が代謝できる黒液中に複数の炭素源が存在することを示しました。その後、黒液の個々の成分を抽出して、より詳細な成長分析を行うことができます。

最後に、成長率の測定は、油汚染の修復など、特定の産業目的のために設計された細菌の特性評価にも役立ちます。ここで、科学者たちは、石油の炭化水素成分を分解する酵素を含む遺伝子操作された細菌株を作成しました。例えば、毒性のある炭化水素の存在下で、遺伝子操作された細菌が正常な細菌よりも増殖速度が増加したことを確認するために、増殖解析が行われました。これは、遺伝子操作された細菌が汚染浄化機能を果たすことを可能にする耐性の向上を示しています。

JoVEのビデオ「成長曲線による細菌の増殖率の分析」をご覧になりました。これで、細菌培養のさまざまな成長段階、時間点収集と段階希釈プレーティングを使用して成長曲線を得るための実験の実施方法、および成長分析を研究や産業目的にどのように適用できるかを理解する必要があります。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!