RT-PCR 法を用いた環境試料の RNA 解析

1. サンプル コレクション: 土壌サンプル

1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
2. ランダム サンプリングは、微生物の生息地の一般的な人口調査を取得するエリア内にランダム ポイントを選択します。トランセクトに沿って直線、例えば河床に隣接するポイントからサンプリング収集。グリッド サンプルは体系的に、定期的にポイントから取られる、未知または可変領域のマッピング微生物群集に便利。
3. 3-6 インチ (7.5-15 cm) 内サンプリング深度は内ではなく、根 (植物の根とその関連付けられた微生物の影響を直接受ける土の狭い地域) が近く、最も豊富な微生物の活動へのアクセスを提供します。
4. 土のサンプルを収集するために押して所定の深さまで地面に手オーガーを回転します。
5. オーガーを持ち上げます。オーガーの中空の茎内土壌にあります。
6. 土壌回収袋にオーガーの底に土をこすり。タッチや土壌を汚染するにしないようにします。
7. 場所、名前、日付、および時間に正しく袋にラベルを付けます。
8. 所、砂利や岩を削除する 2 mm ふるい土を渡します。
9. 土壌水分のための土の部分を分析します。この手順の詳細については、土壌水分にゼウス科学教育ビデオを参照してください。

2. サンプル コレクション: 水サンプル

1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
2. ストレージ ボトルの中の水を収集します。水の量のレコードの収集;場合は、サンプル中の微生物は、検定定量的微生物濃度は収集量に基づいて決定できます。
3. (温度、pH、導電率、塩分、窒素、燐等) の実験に必要な任意のパラメーターのための水をすぐにテスト適切な電子プローブを用いたします。
4. 氷をクーラーに水のサンプルを含むボトルを置きます。研究室にクーラーを転送します。

3. RNA の抽出

1. 収集し、環境試料からの微生物を集中、ゼウス科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
2. 製造元の指示に従って商業抽出キットを使用してウイルスから RNA を抽出します。
3. 簡単に言えば、最初エタノール添加の換散バッファーのサンプルをミックスし、スピンの列にサンプルを追加します。
4. 約 12,000 × g、破棄の流れる通路に列を遠心します。列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。
5. 列および 30 の遠心分離機に RNase フリー水を加える s 滅菌 1.5 mL 低接着 microfuge の管に RNA を溶出します。

4. 逆転写 - PCR

1. -20 ° C のフリーザーから次の試薬を取得: dNTP、集中 (例えば、10 倍) を逆転写バッファー (この例では、ランダムなプライマー) のプライマー。氷の上やクリーン フード内室温でこれらを解凍し、一度融解したもの氷のそれらを保ちます。また逆転写酵素と RNase 阻害剤取得し、氷の上にそれらを保ちます。
2. すべての試薬を組み合わせた「マスター ミックス」をすべての反応の間で一定に必要な試薬体積を計算 (サンプル反応は表 1を参照)。(知られているトラン スクリプト テンプレートを使用して) 肯定的な制御と同様に、あらゆるサンプルのため十分なマスター ミックスを準備し、否定的な反応 (例えば逆転写酵素、テンプレート等と水だけでなく) を制御します。ボリュームに余分な 10% を含めます。
3. 1.5 mL 低接着 microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これは、チューブのプラスチック壁に試薬の分子の結合を最小限に抑えます。
4. 試薬がフリーズ解除とき、および microfuge の管に計算されたボリュームを追加します。優しく渦、加算の前に各チューブを遠心力場します。汚染を防ぐために各試薬を追加間ピペット チップを変更することを確認します。
5. 後すべての試薬が追加されました、渦および遠心分離機の均一混合物を確保するためのマスターの組合せ。-20 ° C で貯蔵に戻って試薬を入れる
6. 準備、ラベルの 8 チューブ PCR ストリップ、各サンプルまたはコントロールの反作用のための 1 つの管を指定します。
7. 各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物などの反応に固有のコンポーネントを追加します。
8. PCR ストリップにしっかりとストリップ キャップを置きに各管 (図 2) の下部にすべての液体を収集するストリップ管アダプターと minicentrifuge の遠心分離機します。
9. たちでしっかり場所 PCR ストリップ。チューブを保護する押し。
10. 使用されている RT の適切なプログラムを実行するたちを設定 (サンプル プロトコルの表 2を参照)。プログラムが完了したら、チューブ PCR 増幅に受けることができますし、cDNA 等が含まれます。詳細については、PCR および量的な PCR のゼウス科学教育ビデオを参照してください。使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。

図 2。マスター ミックスとエキスを含む 8 チューブ ストリップを頂いた。

試薬	1 反応 (μ L) あたりのボリューム
RT バッファー x 10	2.0
25 x dNTPs	0.8
任意プライマー x 10	2.0
Multiscribe	1.0
リボヌクレアーゼ阻害剤	1.0
分子グレード H2O	3.2
総容積	10

表 1。RT マスター ミックスの成分。

ステップ 1	ステップ 2	ステップ 3	ステップ 4
25 ° C、10 分	37 ° C、120 分	85 ° C、5 分	4 ° C、∞

表 2。RT 反応たちプログラム。