高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

1. 移動相を作る

1. 400 mL のアセトニ トリルを精製・ ディ ・水約 1.5 L に追加することによって移動相を準備します。
2. 慎重に 2.4 mL の氷酢酸をこのソリューションに追加します。
3. ・ ディ ・純水でメスフラスコに 2.0 L の総ボリュームへの解決策を希釈します。得られた溶液 pH 3.2 2.8 間が必要です。
4. 水酸化ナトリウム 40% は、校正済みのデジタル pH メーターの使用と drop-wise を追加することで 4.2 に pH を調整します。非常にゆっくりと pH が 4.0 になったらを追加します。これは達成するために約 50 滴を取る必要があります。
5. ドガのソリューションや、クロマト グラフ柱を差し込むことができる固体を削除する真空下で 0.47 μ m ナイロン 66 膜フィルターを介して移動相をフィルターします。可能性があります、列の入口で静止した段階のボイドが発生または紫外線吸光度と不安定性を引き起こして検出器セルにその方法を動作バブルを避けるために移動相をガス抜きが重要です。

2. コンポーネント ソリューションの作成

行わなければならない 3 つのコンポーネントは、カフェイン (0.8 mg/mL)、(1.4 mg/mL)、安息香酸カリウム、アスパルテーム (L-アスパルチル-L-フェニルアラニン メチルエステル) (6.0 mg/mL)。これらの濃度は、かつて同じ方法で希釈ソーダ サンプルで発見したレベルで基準を置きます。

1. カフェインの 0.40 g を 500 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 500 mL のマークに希釈します。
2. 安息香酸の 0.70 g を 500 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 500 mL のマークに希釈します。
3. アスパルテームの 0.60 g を 100 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 100 mL のマークに希釈します。貯蔵中の分解を避けるために冷蔵庫にこのソリューションを配置します。

3. 7 標準溶液を作る

すべての 3 つのコンポーネントがある異なる分配係数、どのフェーズの両方との相互作用に影響を与える。分配係数が大きいほど長期間の保存で静止した段階のコンポーネントを費やしている多くの時間回検出器に到達。

1. 次の表 1、ピペット 50 mL のメスフラスコに各コンポーネントの適切な量のグラフ。
2. 各移動相の容積測定フラスコ 50 mL マークに原液を希釈します。
3. サンプル ラックのラベル付きの小さな瓶に各標準溶液を注ぐ。
4. 冷蔵庫、50 mL のメスフラスコに残りのソリューションと一緒にサンプルのラックに格納します。

4. 高速液体クロマトグラフィー システムの初期設定をチェックします。

1. 廃棄ライン廃棄物コンテナー内にある、移動相にはリサイクルではなくを確認します。
2. 移動相の流量を 0.5 mL/min に設定されていることを確認します。これは、すべてのピーク 5 分以内に溶出し、素敵な解像度を許可するのに十分遅いのに十分な高さです。
3. 最小値と最大圧力と流量が溶剤配信システム (ポンプ) のフロント パネルに適切な値に設定されているを確認します。
   1. 最小圧力設定: 250 psi (これはリークが発生した場合、ポンプを遮断するです)。
   2. 最大圧力設定: 4,000 の psi (これは詰まりが形成された場合、破壊からポンプを保護するためには)。
4. 検出器のフロント パネルの「ゼロ」を押します空白 (空白は純粋な移動相) を設定するために。
5. 分析するとそのソリューションと注射器を埋める作業標準の 1 つの複数のボリュームとし、純水で 100 μ L のシリンジをすすいでください。関心の各成分のピークを識別することができます 3 単一コンポーネント サンプルを開始します。

5. 手動で注入サンプルとデータ収集

1. インジェクター ハンドル荷重位置で、ゆっくりと中隔ポートを介してソリューションの 100 μ L を注入します。
2. 300 のデータを収集するデータ収集プログラムが設定されていることを確認すべての 3 のピーク検出器から溶出するに十分な時間を可能にする s。
3. トライアルを開始する準備ができたら、(移動相にサンプルを注入する) 挿入位置にインジェクター ハンドルを回転させるし、すぐにコンピューター データ収集プログラムに「試験開始」をクリックして。3 つの連続したピークの 1-3、1 つだけ基準 (図 1) の実行中に画面に表示されます。
4. 一度 300 s が渡される、データ収集は、データ ファイルを保存するためのプロンプトを送信します。適切なファイルの名前 (例えばSTD #1) でデータを保存します。
5. そのコンポーネントを識別するに使用されている個々 の試験のピークを秒単位で時間に注意してください。
6. 鼻中隔からシリンジを外し、最初の実行から決定されたクロマト グラムあたりの同じ時間を使用して、残りの作業標準のごとにプロセスを繰り返します。

図 1。3 つの部品のクロマト グラム。左から右へ, 彼らが安息香酸、アスパルテーム、カフェインです。

6. ダイエット ソーダのサンプル

ダイエットコーク、ダイエットペプシ、コカコーラゼロは「未知数」彼ら残されている、中性化を取り除くために一晩に開いた容器に泡が HPLC システムに適していません。これは、サンプルの任意のガスの十分に取り除きます。

1. プラスチック注射器にダイエット ソーダの約 2 mL を描画します。
2. 場所にそれをねじることによってフィルター チップを経由ルアーロック注射器に接続します。
3. フィルターを通して、小さなガラスの瓶に注射器で液体をプッシュします。これは分離カラムを詰まらせることができる可能性のある不要な粒子を取り除きます。
4. 50% の高純度で、DI 水の同量の各サンプルを希釈します。
5. サンプル ループに 100 μ L のサンプルを注入し、基準については同じパラメーターで試験を実行します。

7. 計算

1. コンポーネント ソリューションの濃度、7 のサンプルのために作られた希釈に基づいて、標準のコンポーネントのすべての濃度を算出します。
2. ピーク高さ ½ 高さ (図 2) の幅に等しい三角形法による各標準および未知の試料のクロマト グラムのピーク面積を決定します。彼らのそれぞれのピークを表示する各コンポーネントにかかる時間に基づいて各コンポーネントに対応するピークが決まったら、コンピューターのスプレッドシートにこれらのピークの面積を入力します。
3. すべての 3 つのコンポーネントの基準の濃度 (mg/L) とピーク面積の検量線を作成します。
4. 各校正曲線の最小二乗法フィットを決定します。
5. サンプルのための高速液体クロマトグラフィー試験から示されるピーク面積からダイエット炭酸飲料の各コンポーネントの濃度を計算します。ダイエット ソーダは HPLC システムに注入する前に 2 倍に希釈したことに注意してください。
6. ダイエット炭酸飲料の各コンポーネントの量を mg/L を計算します。
7. 結果を基に、ソーダの 12 オンスの缶は、各コンポーネントのミリグラムを計算します。12 オンス = 354.9 mL を想定してください。

図 2。曲線のピーク高さと幅、乗算するが、基本的な例 (ピーク高さ × 幅 ½)。