高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、液体混合物の成分を固定相とのさまざまな相互作用に基づいて分離する非常に汎用性の高い手法です。

HPLCは、カラムクロマトグラフィーを応用したものです。カラムクロマトグラフィーでは、カラムには固定相と呼ばれるマイクロスケールのビーズが充填されています。固定相ビーズは、ビーズと液体または移動相中に位置する混合物の成分との間の相互作用を誘発する化学基で官能基化されています。混合物がカラムを流れると、成分は固定相と異なる方法で相互作用します。

HPLCでは、カラムクロマトグラフィーは従来のカラムクロマトグラフィーよりも高い流速、つまり高い圧力で実行されます。これにより、表面積と体積の比率が大きい小さな固定相ビーズを使用できるようになり、固定相と移動相中の成分との相互作用が大幅に増加します。

このビデオでは、さまざまなダイエットソーダの成分の分離を実演することで、HPLCの操作の基本を紹介します。

ラボで使用されるHPLCには、分析用と分取用の2種類があります。分析HPLCでは、装置を使用して少量の成分を同定し、分析したサンプルは廃棄物として廃棄されます。分取HPLCでは、装置を使用して混合物を精製し、各成分の所望の量をフラクションに収集します。

HPLC装置は、一連のシンプルなコンポーネントで構成されています。まず、溶媒リザーバーに保持された移動相は、1 つ以上のポンプによって一定の流量でシステム内をポンプで送り込まれます。サンプルは、サンプルインジェクターによって移動相ストリームに注入されます。移動相で希釈されたサンプルは、HPLCカラムに送達され、そこでサンプルの成分が分離されます。その後、成分は検出器によって分析され、後で使用するために分画で保存されるか、廃ボトルに移されます。

HPLCカラムは、システムの主要コンポーネントです。これは、固定相のマイクロスケールビーズ、またはクロマトグラフィー樹脂が詰められた金属またはプラスチックのシリンダーで構成されています。サンプル混合物は、充填された粒子床を一定の流速で流れ、各成分は流れながら固定相と相互作用します。

化合物は固定相と異なる方法で相互作用するため、カラムの長さに沿って検出器まで異なる速度で移動します。成分がカラムから出る、つまり溶出するのに必要な時間は、保持時間と呼ばれます。その結果、保持時間対強度のプロット、またはクロマトグラムが得られます。保持時間は、コンポーネントを識別するために使用されます。ピークサイズ、特にピークの下の面積は、初期溶液中の化合物の量を定量するために使用されます。

固定相の選択は、サンプル混合物中の成分の特性によって異なります。最も一般的に使用される固定相はシリカビーズであり、マイクロスケールのビーズを形成する不活性な非極性材料であり、十分な充填密度を達成します。最も一般的なタイプのHPLCは逆相クロマトグラフィーで、疎水性の固定相、通常はビーズの表面にC18鎖が結合したシリカビーズを利用します。成分は極性が減少する順に溶出されます。

逆相クロマトグラフィーで使用される移動相は、通常、水とアセトニトリルなどの有機溶媒の混合物です。サンプルによっては、移動相を水と有機溶媒の比率を一定に保つことができます(アイソクラティックモードと呼ばれます)。しかし、これにより、水分含有量が高い場合はピークが広くなったり、有機物含有量が高い場合はピークが重なったりすることがあります。

移動相比は、分離中に直線的または段階的に変化させて、移動相の勾配を作成することもできます。グラジエント溶出により、極性の低い成分のピークブロードニングを防ぐことができるため、分離が改善され、溶出時間が短縮されます。

HPLCの基本が概説されたので、研究室でHPLC技術を実演します。この実験では、HPLCを使用して、ダイエットソーダの3つの一般的な成分を分離および定量化します。

まず、移動相を調製するために、1.5 L の精製脱イオン水に 400 mL のアセトニトリルを加えます。次に、2.4mLの氷酢酸を慎重に加えます。溶液を総容量2Lに希釈します。得られた溶液のpHは2.8〜3.2である必要があります。

校正済みのpHメーターを使用して、攪拌液に40%NaOHを滴下して加え、pHを4.2に調整します。

真空下で0.47μmのメンブレンフィルターで移動相をろ過し、溶液を脱気し、カラムを詰まらせる可能性のある固形物を取り除きます。気泡は固定相にボイドを引き起こしたり、検出器セルに流れ込んで測定が不安定になったりするため、溶液を脱気することが重要です。

ダイエットソーダの3つの典型的な成分であるカフェイン、安息香酸、アスパルテームの3つの成分溶液を準備します。次に、これらのコンポーネント溶液を使用して、未知化合物を決定するために使用される標準溶液を調製します。カフェインと安息香酸溶液500mLを調製します。

アスパルテーム成分溶液100mLを調製します。分解を防ぐため、使用しないときは溶液を冷蔵庫に保管してください。

次に、カフェイン、安息香酸、アスパルテームの濃度が異なる7つの標準溶液を調製します。各成分を適量をメスフラスコにピペットで移し、移動相で50 mLのマークまで希釈します。

最初の 3 つの溶液にはそれぞれ 1 つの成分が含まれており、ピークの同定が可能です。他の 4 つの溶液には、ピーク高さと濃度を相関させるために、3 つの成分すべての濃度の範囲が含まれています。

各標準溶液をサンプルラック内のラベル付きバイアルに注ぎます。サンプルラックにはサンプルと残りの溶液を冷蔵庫に保管してください。

まず、移動相と廃棄物容器をセットアップします。廃棄物ラインが廃棄物コンテナに供給され、移動相にリサイクルされていないことを確認してください。インレット移動相ラインが移動相コンテナに供給されていることを確認します。

移動相の流速が 0.5 mL/min に設定されていることを確認します。この流速により、すべての成分が 5 分以内に溶出しますが、個々のピークの分離を確保するには十分に遅くなります。

次に、溶媒送液システムの最小圧力と最大圧力を確認します。これらの設定は、それぞれ漏れや詰まりが発生した場合にポンプを停止します。

検出器のフロントパネルの「ゼロ」を押して、ブランクを設定します。100-をすすぎますか?Lシリンジに脱イオン水を入れ、次に7つの作業標準のうちの1つを数容量入れます。次に、シリンジにその溶液を入れます。各成分のピークを特定するために、3つの単一成分サンプルから始めます。

次に、インジェクターハンドルを負荷位置に置いて、手動で溶液を注入します。ゆっくりと100を注入しますか?セプタムポートを通る溶液のL。

データ収集プログラムが 300 秒間データを収集するように設定されており、3 つのピークすべてが検出器を通じて溶出するのに十分な時間を確保していることを確認します。試験を開始する準備ができたら、インジェクターハンドルを注入位置まで回転させて、サンプルを移動相に注入します。すぐに、データ収集プログラムの「トライアルを開始」をクリックします。スキャンが完了したら、7つの標準ソリューションごとにプロセスを繰り返します。最初の 3 つの標準試料のそれぞれについて、3 つのピークのうち 1 つだけが表示されます。コンポーネントの識別に使用されるピークの位置に注意してください。

3つのダイエットソーダサンプルを選択し、炭酸を取り除くために開いた容器に一晩置いておいてください。

一晩脱気した後、各ダイエットソーダを約3 mLをプラスチック製の注射器に引き込みます。次に、フィルターチップをシリンジに取り付け、ソーダをフィルターを通してガラスバイアルに押し込み、固体の微粒子を取り除きます。

各サンプルの 2 mL を移動相 2 mL で希釈して、ソーダ濃度を半分に減らします。

100を引く?ソーダサンプルの1つのLをシリンジに入れ、サンプルループに注入します。標準ソリューションと同じパラメーターで試用版を実行します。ソーダサンプルごとに繰り返します。

まず、標準サンプルのピーク面積を既知の濃度と相関させます。これを行うには、三角法を使用して、各標準サンプルのクロマトグラフのピーク面積を決定します。幅を高さの半分にしてピーク高さの時間を計算し、この値をピーク面積として使用します。

ピーク面積と既知の濃度を使用して、各成分の検量線を作成し、各検量線の最小二乗適合を決定します。

ピーク面積からダイエットソーダの各成分の濃度を計算します。ソーダはすべて、HPLCに注入する前に2倍に希釈されたことを忘れないでください。これらの結果に基づいて、12オンスのソーダ缶の各コンポーネントのmgを計算します。

当然のことながら、テストされた3つのソーダすべてに、ほぼ同量の防腐剤安息香酸塩が含まれていました。ただし、コーラ製品にはカフェインが多く含まれていました。すべてのコンポーネントの計算値は、メーカーによって報告された値とよく相関していました。

HPLCは汎用性の高い装置で、幅広い分析に使用されています。

HPLCは、ペプチド分子の精製によく使用されます。この例では、膜貫通型ペプチド複合体を調製し、次いでタンパク質をジスルフィド結合で酸化的に架橋することにより安定化させた。

次に、タンパク質をギ酸に溶解し、逆相HPLCを使用して精製しました。次に、2つの溶媒の線形グラジエントを使用してサンプルを溶出し、質量分析で純度を確認しました。

HPLCは、ラボで合成された有機化合物の同定にも使用できます。Miller-Urey実験では、原始地球での有機化合物の非生物的合成が研究されました。メタンやアンモニアなどの原始ガスは、初期の海をシミュレートして、水の入ったフラスコに導入されました。その後、原初の地球の稲妻を模倣して放電が加えられました。

次に、HPLCと質量分析を組み合わせて水を分析し、既知のアミノ酸標準と比較しました。この実験では、23種類のアミノ酸が合成され、同定されました。

JoVEのHPLCの紹介をご覧になりました。これで、測定器の実行と結果データの分析の基本を理解できました。

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