3.3: 標準添加法

1. 試薬の準備

1. 100 ppm 標準 Al^{3 +}ソリューション: DI 水を 1 L メスフラスコにディゾルブ 0.9151 g アルミニウム硝酸塩 (Al (₃)₃•9H₂O)。
2. 8HQ ソリューション 1 M 酢酸 (2 %wt/巻): 8-ヒドロキシキノリンの 2.0 g を 100 mL のメスフラスコに追加。
3. 慎重に 100 mL フラスコに 5.74 mL の氷酢酸を追加し、DI 水が付いている印に希釈します。これは液相に溶解する 8-オキシキノリンをことができます。
4. 1 M NH₄⁺/NH₃バッファー (pH ~ 8): 酢酸アンモニウム (NH₄OAc) 20 g を 100 mL のボトルに追加。
5. この 100 mL ボトルに 30% アンモニア水 7 mL を追加し、DI 水のマークを希薄化します。これにより、8HQ ソリューションを組み合わせるときの酸を中和します。
6. その他の試薬は無水硫酸ナトリウムを含む (Na₂SO₄) とクロロホルム (スペック グレード)。

2. サンプルの準備

1. Al^{3 +}ソリューション ピペットで 100 ppm 株式の 1.0 mL を 100 mL のメスフラスコに追加することによって 1.00 ppm 標準 Al^{3 +}ソリューションを準備します。
2. ボンネットにある大型のリング スタンド上にあるリングに 6 125 mL, 目標到達プロセスを配置します。彼らは次のようにラベル付けされる必要があります: BL、0、1、2、3、4 です。 ガラス製品すべてが綿密にきれい、クロロホルムの小さなビーズは、ガラスの壁に固執する場合、量的な結果を得ることが困難であることを確認します。
3. 5, 目標到達プロセス 0、1、2、3 をラベルに不明な Al^{3 +}ソリューションの 25.00 mL を追加 & 4。この例では、未知の濃度は 0.110 ppm です。
4. 1 mL ピペットで 5 目標到達プロセスにそれぞれ、4.00 1.00 ppm 標準 Al^{3 +}溶液、mL、3.00 2.00 1.00 0 を追加します。
5. 黒ラベル, 漏斗に 25.00 mL の蒸留水を追加することによって、空白を準備します。
6. それぞれの六つのソリューションに 1.0 mL のピペットで 8-ヒドロキシキノリン溶液を追加します。
7. それぞれの六つのソリューションにピペットで緩衝液 3.0 mL を追加します。
8. 2 回各時間 1 分は積極的に揺れクロロホルム 10 mL で各ソリューションを抽出します。圧力集結を解放する, 漏斗を時折口に注意してください。(注: 良い抽出のみ行われるフェーズ間の液-液接触の多くがある場合)。
9. 清潔で乾燥した 100 mL のラベルの付いたビーカーにクロロホルムを収集します。クロロホルムので、それは下層の密度を 1.5 g/cm³、閉じる。完全な抽出した水相でに黄色左のトレースをする必要がありますはありません。
10. それぞれ 25 mL メスフラスコに各ビーカーから結合されたクロロホルム抽出を転送し、クロロホルムが付いている印に希釈します。必ず、クロロホルムが蒸発するを防ぐために各のメスフラスコにストッパーを配置してください。
11. 無水硫酸ナトリウムの ~ 1 g を追加 (Na₂SO₄) ステップ 2.9 から 6 100 mL ビーカーのそれぞれに。硫酸ナトリウム クロロホルム抽出物に存在する水の痕跡を削除することができます。
12. ソリューションを彼らの敬われたビーカーに転送します。サンプルの水の脱水を促進する慎重に旋回。
13. 石英蛍光セルにクロロホルム抽出をデカント (注: クロロホルムをプラスチックのポリスチレン セルを解散する)。

3. 励起波長を選択します。

スキャンを実行することによって励起し、発光波長を決定し、単に読み、これらの値のすべてのサンプルの蛍光強度を記録します。励起と発光帯域幅が 5 であらかじめ設定されて nm。励起波長は約 385 をする必要がありますので、近い紫外線の複合体が吸収する nm。当初、500 で蛍光をモニター発光支店で nm。

1. 蛍光、両方の内部および外部冷却ファン、蛍光ではキセノン ランプの電源投入前にオンにことを確認します。キセノン ランプは非常に熱く、継続的な冷却が必要です。
2. 400 V に PMT 検出器に高電圧 (HV) オンにします。
3. シャッターの両方を開きます。
4. コンピューター上のデータ集録プログラムを開き、ここでは"100nmFluorScan"。
5. 「サンプル + 追加 2 mL」を置く最高の励起・発光波長を決定するために使用する石英セルに (2) ソリューション。
6. 500 で設定当初発光波長 nm、2 nm/秒のスキャン速度と 335 435 nm から励起スキャンを実行します。
7. 結果として得られる蛍光プロット (EXλ_最大)、最大蛍光励起波長を決定し、その値に計測器を設定します。

4. 発光波長を選択します。

1. 450 に蛍光発光波長を設定 nm。
2. 発光波長範囲 450-550 nm から 100 nm スキャンを実行するを設定します。
3. スキャンを開始するには、蛍光のフロント パネルの「スタート」ボタンを押すと同時にプログラムに「試験開始」ボタンをクリックします。
4. 結果として得られる蛍光プロット(EMλ_最大)、最大蛍光波長を決定し、その値 (図 2) に楽器を設定します。

図 2。最適な EXλ の_maxと EM を決定するλ_max 波長。

5. サンプルの蛍光性の測定

1. すべてのサンプルは、EMλ_maxと EXλ_maxで実行されます。これらの条件における蛍光値だけで、各サンプルのスキャンは不要です。最も希薄サンプル (空白) にはじまって、石英セルで、楽器を配置します。蛍光強度を実験室のノートに記録します。
2. 他のすべてのサンプルに対して繰り返します。
3. 覚えて空の相対強度が相対的強度校正チャートを作成する前に各ソリューションから減算しなければなりません。

6. 標準添加プロットを作成します。

1. Al^{3 +}追加の μ g 対蛍光強度をプロットします。
2. 結果プロットの二乗値を決定し、傾きと切片の両方を記録します。
3. Al^{3 +} Al^{3 +}の方程式 μ g から未知のサンプルでの μ を決定 -b/m を =
4. 不明なアルミが 25.0 mL 各サンプルに追加の量を持っていたことを知って、未知の世界のアルミニウムの濃度を決定します。

標準添加法は、分析種の測定信号に干渉するマトリックスの影響を最小限に抑えるために使用される定量分析技術です。

未知の成分濃度は、多くの場合、光分光法、質量分析法、電気化学などのさまざまな分析手法によって解明されます。ただし、測定は、マトリックスと呼ばれるサンプル内の他の成分の影響を受け、マトリックス効果と呼ばれる信号の不注意な減少または増強を引き起こす可能性があります。これらの影響により、結果が歪められ、解析に重大なエラーが発生する可能性があります。

標準加算の方法を使用して、測定信号に対するマトリックスの影響を最小限に抑えることができます。これは、既知の分析種溶液の正確な体積をサンプルに加えることによって実行されます。

このビデオでは、標準添加法の基本を紹介するとともに、蛍光測定を用いて実験室でその手法を実行する方法を紹介します。

マトリックス効果は、他の多くの分子が分析種と相互作用する複雑なサンプルで発生する可能性があります。例えば、分子が分析種と結合または凝集し、それによって蛍光能力が変化すると、これが起こります。または、マトリックスが溶液全体のイオン強度を変化させ、分析種の特定の特性を変化させる可能性があります。

標準添加法を使用してこれらの影響を軽減するために、分析物標準溶液の一定容量をサンプルの同量に添加します。次に、溶媒を使用して溶液の量を等しくします。

次に、標準添加の有無にかかわらず、サンプルの信号が測定されます。データは、従来の検量線ではなく、サンプルに添加された標準試料の量に対する強度としてプロットされます。任意のフラスコ中の分析物の実際の濃度は、次の式で定義されます。装置応答は、分析物の濃度の一定倍に等しくなります。結果の方程式は、線形形式 y=mx+b を取ります。したがって、プロットを吸光度ゼロに外挿すると、切片はサンプルの未知の濃度に等しくなります。

信号プロットは、関心のある濃度範囲にわたって線形でなければなりません。また、分析対象物とサンプルマトリックスの比率が変化しても、干渉は変化してはなりません。最後に、マトリクス自体が単独で測定信号を生成しないようにする必要があります。

次の実験では、非蛍光種であるアルミニウムを8-ヒドロキシキノリン(8HQ)と反応させて蛍光ALQ3複合体を形成することを研究しています。

有機溶媒中のアルミニウム錯体の蛍光を測定し、元のアルミニウム溶液の濃度に関連付けます。このアプローチは、金属イオンの分析で一般的です。

さて、標準加算の方法の基本を概説し、実験の基本を説明したので、研究室で技術を行いましょう。

まず、100ppmのアルミニウム原液を水に調製し、次にそれを使用して1ppmの標準溶液を調製します。

次に、2 gの8-ヒドロキシキノリン(8HQ)を100 mLメスフラスコに加えます。

5.74 mLの氷酢酸を慎重に加え、脱イオン水で100 mLのマークまで希釈します。このステップにより、8HQを水相に溶解させることができます。

次に、20 gの酢酸アンモニウムと7 mLの30%水酸化アンモニウムを100 mLのマーク付きボトルに加えて緩衝液を調製し、希釈します。pHインジケータースティックでpHを確認します。このバッファーは、組み合わせると8HQ溶液中の酸を中和するのに役立ちます。

必要な他の試薬には、無水硫酸ナトリウムおよび分光光度グレードのクロロホルムが含まれます。

次に、この場合、液液抽出を使用して水性サンプルを有機相に抽出することにより、サンプルを準備します。6つの125 mLセパリー漏斗をフード内のリングスタンドリングに置きます。.汚れたガラス製品は結果を歪めるため、すべてのガラス製品が細心の注意を払ってきれいであることを確認してください。ファネルに「blank」、「0」、「1」、「2」、「3」、「4」のラベルを順番に付けます。

ピペットを使用して、「0」から「4」とラベル付けされた5つのセパレーター漏斗のそれぞれに、未知のアルミニウム溶液25 mLを追加します。「ブランク」とラベル付けされた漏斗に25mLの脱イオン水を加えてブランクを準備します。

次に、1 ppm 標準溶液 1、2、3、4 mL を対応する番号付き漏斗に加えます。ブランクまたは0ファネルに標準ソリューションを追加しません。

8HQ溶液1 mLと緩衝液3 mLを6つの漏斗のそれぞれに加えます。

各フラスコに10 mLのクロロホルムを加えて、液液抽出を行います。漏斗を激しく振る、そして時々漏斗を通気して圧力の蓄積を解放します。漏斗をリングに戻し、液体層を分離させます。

次に、クロロホルム相を清潔で乾燥した標識付き100 mLビーカーに集めます。クロロホルムは水よりも密度が高いため、漏斗の下層になります。

クロロホルム抽出物を25 mLメスフラスコに移し、蒸発を防ぐために各フラスコにキャップをします。

各漏斗に10 mLのクロロホルムを添加することにより、残りの水溶液で2回目の液液抽出を行います。前と同じように漏斗を振って、残っている分析物をクロロホルム相に移します。上部の水相に黄色が残っていないはずです。

漏斗ごとに2回目の抽出を繰り返し、対応する標識ビーカーにクロロホルム相を収集します。収集したクロロホルムをそれぞれのメスフラスコに注ぎ、新鮮なクロロホルムでマークまで希釈します。

微量の水を除去するには、6つの100mLビーカーのそれぞれに約1gの無水硫酸ナトリウムを追加します。溶液をそれぞれのビーカーに戻し、渦巻き状に回転させてサンプルの脱水を促進します。

クロロホルム抽出物を石英蛍光計セルにデカントします。

製造元の指示に従って蛍光計をセットアップし、電圧を400Vに設定します。次に、コンピューターでデータ収集プログラムを開きます。

サンプル2を使用して、最適な励起波長と発光波長を決定します。発光波長を500nmに設定し、335×435nmから2nm/sのスキャン速度で励起スキャンを実行します。

蛍光プロットから、励起の最大波長を決定します。装置をその励起波長値(この場合は399nm)に設定します。

次に、450〜550nmのスキャンを実行して発光波長を決定します。得られた蛍光プロットから、最大波長を決定し、発光波長(この場合は520nm)を設定します。

選択した励起波長と発光波長のブランクを含む各サンプルを測定します。各蛍光強度の読み取り値を記録します。

ブランクサンプルの測定された蛍光を、他の5つのサンプルのそれぞれから差し引きます。

5つのサンプルのそれぞれの蛍光強度と、サンプルに添加されたアルミニウムの量をプロットします。結果のプロットの最小二乗値を決定し、傾きと切片を記録します。

蛍光強度と添加されたアルミニウムの量のプロットは、示されているように最小二乗線をもたらしました。サンプル中のアルミニウムの量は、この線を使用して計算できます。未知数の添加量が25mLであったため、決定値である2.916μgを25mLで割る。これにより、最終結果は0.117μg/mL、つまり0.117ppmになります。これは、既知の値である 0.110 ppm にかなり近い

次に、マトリックス効果によって結果が歪む可能性のある他の分析手法を見てみましょう。

原子吸光分光法は、気相中の標的分析物による光の吸光度を測定する分析法です。ほとんどのサンプルでは、吸収とサンプル濃度を関連付ける単純な検量線が、未知の濃度を定量するための信頼性の高い方法として役立ちます。

ただし、この手法では、混合物の他の成分がターゲット分析種と相互作用し、吸収を抑制または増強すると、精度が低下する可能性があります。この場合、標準的な添加法を使用して、特に分析前にマトリックスを除去できないサンプルで、これらの相互作用の影響を説明できます。

機器のキャリブレーションは、測定の精度に重要な役割を果たします。標準添加法は、ICP-MSなどの機器の校正を支援するためによく使用されます。ICP-MSは比較法であり、未知のサンプルの測定は化学標準の測定に基づいていることを意味します。

したがって、未知数の測定値の不確かさは、キャリブレーションの不確かさよりも優れているわけではありません。したがって、標準添加法は、標準法よりも精度が高く、サンプル中のマトリックス相互作用を考慮した検量線を作成するために使用できます。

多くの生体分子は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して分析されます。HPLCは、極性、電荷、サイズなどの分子特性に基づいて複雑な混合物を分離し、分析する技術です。分析種がカラムを離れる時間により、ユーザーは混合物中の各成分を同定できます。

生体分子は、多くの場合、混合物中で相互作用し、懸濁しているマトリックスの影響を大きく受けます。多くの場合、標準添加法は、これらの影響を考慮した検量線を作成するために使用されます。

JoVEの標準加算の方法の紹介を見ました。これで、サンプル分析でマトリックス効果を考慮する手法を実行する方法を理解できたはずです。

ご覧いただきありがとうございます!