ろ過による水試料からの糞便細菌の分離

1. 水のサンプルの収集と処理

1. いくつかの 1 L の水をテスト水の源から採取 (例えば水噴水、プール、貯水池、配水システム、生または扱われた下水)、微生物分析検査室に氷の移動や。
2. 滅菌またはオートクレーブで使用、紫外線放射 (2 分)、またはエタノール炎着火への暴露の前に膜ろ過マニホールド アセンブリをサニタイズします。
3. すべての部品の冷却、真空ポンプと真空濾過廃棄物フラスコに漂白剤を含むマニホールドを正しく接続します。
4. エタノール炎は彼らと鉗子のペアを殺菌、滅菌、グリッドのメンブレン フィルターをパッケージから取り出します。膜孔径 0.45 μ m の直径 47 mm が通常使用されます。ただし、代替の径、孔径が十分にターゲット糖化をわなに掛ける、フィルター領域の少なくとも 70% は、気孔スペースで構成されています、細孔径を用いることができます。
5. マニホールド、膜ろ過面積のセンターの上にフィルターを配置単位に漏斗滅菌フィルターを適用し、所定の位置に固定します。
6. 試験水の望ましい量測定 (例えば100 mL)、じょうご (100 mL の線マークは目標到達プロセスの表示) に追加。
7. フィルターを通してテスト サンプルを描画するために部分的な真空 [34 に 51 kpa (キロ パスカル) は圧力差] を適用します。合計は固体を中断、細菌を含むと腐敗性有機物、フィルターより大きい意味する孔径 0.45 μ m のフィルターに閉じ込められています。小さい粒子の分解された固体膜を介して漂白剤を含む廃棄物コンテナー真空フラスコに少量の有機物と塩の渡すようとウイルスを含みます。
8. 次のフィルターを通してサンプルの完全な通路は、滅菌水の 2 〜 3 20-30 mL の容積と目標到達プロセスの内部をすすいでください。
9. 電源オフ、真空、最終すすぎの閉鎖時にマニホールドから漏斗を取り外します。
10. エタノール火炎滅菌ピンセットでユニットからメンブラン フィルターをすぐに削除し、速やかに (表 1の各推奨成長メディア ・ インキュベーション条件一覧) ターゲット微生物にとって適切な培アガロースに置きます。
11. ロール型動き成長媒体、膜の完全な接触を確保するため、気泡の巻き込みを避けるために agarose 表面に膜フィルターを適用します。
12. 使用されるろ過漏斗に置き換えて、各サンプルの処理の間に滅菌ユニット、クロス汚染を防ぐためにステンレス鋼のマニホールドをエタノール消毒します。

2. コロニー列挙

1. 潜伏期間は、以下の列挙のためのインキュベーターから成長板を削除します。
2. 理想的には、クールで白い光源を用いた低消費電力倍率下でコロニー カウントを実行します。
3. 大腸菌群
   1. 合計大腸菌コロニーは通常ピンク色、金属表面の光沢と色の濃い赤。シーン自体が部分的または完全に植民地をカバーします。非定型の合計大腸菌コロニー形態ダークレッド、粘液、または光沢のない核があります。
   2. ピンク、青、白、または無色で光沢に欠けている、植民地は、大腸菌群以外と見なされます。
4. 糞便の大腸菌群
   1. 糞便の大腸菌群のコロニーは、青の様々 な色合いを表示されます。
   2. Nonfecal 大腸菌コロニーにクリーム色で灰色であります。
5. 糞便の腸球菌
   1. 濃い赤い色でピンクの糞便の腸球菌コロニーの範囲です。

3. コロニーの検証

1. 大腸菌群
   1. 在・不在が検証のため綿棒滅菌接種を使用して全体の膜はループします。植民地、少なくとも 5 つそれぞれの典型的な非定型の形態を確認することをお勧めします。
   2. ラウリル tryptose スープ ダーラム管を入れたガラスの容器に選択したコロニーを転送します。48 h の 35±0.5 ° C で接種のチューブを孵化させなさい。ガスの生産と組み合わせて濁度を示す成長の存在は、大腸菌群として植民地を確認します。
2. 糞便の大腸菌群
   1. ダーラム発酵管を無菌の EC 媒体を含んでいるガラス容器に無菌青色のコロニーを転送します。44.5 ± 0.2 ° C 24 時間で接種のチューブを孵化させなさい。ガスの生産と組み合わせて濁度を示す成長の存在は、糞便の大腸菌群として植民地を確認します。
3. 糞便の腸球菌
   1. ストライク コロニー分離無菌に脳心臓注入寒天培地 (BHIA)、糞便の腸球菌形態の類型化と 35 ± 0.5 ° C、24 〜 48 時間で孵化させなさい。
   2. 2 あらかじめ洗浄し、ガラス スライド上に隔離されたコロニーから BHIA 上の成長を転送します。
   3. スライドの準備塗抹標本に 3% 過酸化水素の 2 〜 3 滴を追加します。泡の急速な出現が「カタラーゼ肯定的な」結果を示し、分離は糞便連鎖球菌細菌ではないです。
   4. (気泡が観察なし)「カタラーゼ否定的な」としてテスト菌株のグラム染色を実行します。糞便の腸球菌はグラム陽性、卵形、ペアまたは短い鎖で表示されます。

糞便の細菌インジケーター	推奨メディア (孵化の温度、時間)1
大腸菌群	レ遠藤寒天 (35 ± 5 ° C、24 h) M 遠藤媒体 (35 ± 5 ° C、24 h)
糞便の大腸菌群	m FC 媒体 (44.5 ± 0.2 ° C、24 h)
糞便の腸球菌	mエンテロコッカス寒天 (35 ± 0.5 ° C、48 h)

表 1。環境試料中の糞便細菌指標の検出のための一般的に使用される文化成長媒体
¹ 試験の水と排水の標準的な方法(アメリカ公衆衛生歯内療法と、米国水道協会、22^nd版、2012) によって推薦されるように