2.14: カラム ・ クロマトグラフィ

1 シリカゲル スラリー

1. シリカゲルを三角フラスコに注ぐ。包装材の重量も約 50 倍、分離されているサンプル。分離されている化合物は、非常によく似たR_f値を持つ、それは大量のサンプルは、この例では、あたりのシリカを使用してを必要があります。
   1. 三角フラスコ、50 mg のサンプル (45 mg フルオレノンのテトラフェニルポルフィリンの 5 mg) が分離されているので中のシリカの場所 10 g。
2. 溶剤システムを追加 (ヘキサン/ジクロロ メタン 70%: 30%) シリカゲルを含むエルレンマイヤー フラスコに。シリカゲルのすべてがよく溶媒和であることを確認する十分な溶媒を追加します。シリカは分解しないが、とき、混合物は視覚的に顕著なる溶媒和。溶媒が追加された後、シリカのすべてがよく溶媒和ように三角フラスコを旋回します。

2. 列の準備

1. 適切なサイズの列を選択します。通常シリカゲル スラリーの約半分の方法列を入力する必要があります。精製されているサンプルのサイズを大きくより大きい列が必要です。
2. グラスウールの切れ端で列の下部に差し込みます。長い棒を使用して、ウールが、活栓のすぐ上の列の下部に詰まってしっかりとを確認します。
3. ウールはしっかりと後、は、グラスウールの上砂の薄い層を適用します。
   注:活栓上記ガラスフリット列が装備されている場合は、この手順を省略されなければなりません。
4. リング スタンドに縦位置で列を固定します。
5. 目標到達プロセスを使用して、優しく注ぎ準備スラリー状シリカゲルの列。三角フラスコから列にスラリーを転送する追加溶媒を追加する必要があります。ピペットを使用して、列の両側にスティック任意のシリカゲルを洗います。
   1. シリカゲル列で定着しつつあると優しくシリカゲル パックをしっかりと、空気の泡を除くことを確認する列の側面をタップします。
6. 活栓を開き、シリカゲルと溶媒フロント ミート前だけまでに、きれいな三角フラスコに流出し溶媒を許可します。シリカゲルには、プロシージャが完了するまでに決して乾燥行く必要があります。
7. シリカゲル (図 1) の上に砂の薄層を配置します。ピペットを使用して、列の両側に立ち往生している可能性があります任意の砂を洗います。
8. 砂は、乾燥するまでが、シリカゲル層にない追加溶剤を排出します。

図 1。カラム ・ クロマトグラフィの適切なセットアップは、サンプル添加する前に試してみてください。

3 列にサンプルを追加

1. (シリカゲル スラリーのために使用された同じ溶剤を使用して) 可能な溶媒の少量のサンプルを溶解します。
2. 列の上部にサンプルを追加そっとピペットを使用して。
3. サンプルは、列の上部に適用されている、一度活栓を開き、砂の層がないシリカゲル層を通って流出する溶剤を許可します。上下に列の側面にしがみついている可能性があります任意のサンプルを洗浄する溶剤量が非常に少ないを使用します。砂層にもこの追加溶剤を排出します。

4. 列を通して試料の溶出

1. 砂の層を妨げないような方法で 4-5 mL の溶媒を追加ピペットを使用して、非常に穏やか。
2. 列の上部に漏斗を置き、非常にゆっくりと優しく溶媒と列の残りの部分を埋めます。
3. 活栓を開き、列を通って流出する溶剤を許可します。
4. 試験管に列から排水溝のように移動相を収集を開始します。
   1. 試験管は、順次テスト チューブのラックに配置する必要があります。
5. すべての必要な化合物がカラムから溶出されるまで必要に応じて列の上部に追加溶媒を追加します。

5. 回復成分

1. 化合物が着色されている場合、視覚的に識別できます。しかし、化合物は無色、する場合彼らは (化合物には、共役が含まれて) 場合 ulta 可視 (UV) 光を使用して識別する必要がまたは適切な染色。化合物の純度は、薄層クロマトグラフィーを使用して確認できます。
2. 目的の化合を含む試験管を識別します。
3. あらかじめ重量を量られた丸底 (RB) フラスコに目的の分離化合を含む画分のすべてをマージします。この隔離される各化合物に対して行います。
4. 回転蒸発器に RB フラスコを置くことによって溶媒を蒸発させます。
5. 溶媒のすべてが削除されると、乾燥製品で RB の重さし、収率を取得する RB の初期の重さを引きます。

カラムクロマトグラフィーは、溶液中の化合物を分離するために使用される汎用性の高い精製法です。溶液混合物は、固定相と呼ばれる吸着剤固体を含むカラムを介して溶媒によって運ばれます。溶媒とサンプル混合物の組み合わせは、移動相と呼ばれます。

移動相中の分子は、その化学的特性と固定相に対する親和性に基づいて、異なる速度でカラム内を移動します。したがって、各コンパウンドは異なる時間にカラムから出ます。化合物が分離および精製されると、さらに処理するか、または配布の準備が整います。このビデオでは、カラムクロマトグラフィーの基礎を紹介し、有機化合物の精製技術を実演します。

カラムクロマトグラフィーでは、分子がカラムを流れるときに固定相に可逆的に吸着するため、分子の進行が遅くなります。固定相と弱く相互作用する化合物は、カラムから出るのが速い、または溶出します。固定相と強く相互作用する化合物は、溶出が遅くなります。固定相は、シリカゲルやアルミナなどの吸着剤粉末またはゲルです。シリカゲルとアルミナは極性が高いため、極性化合物や溶媒と強く相互作用し、非極性分子とは弱い相互作用を示します。固定相は、溶媒と共にスラリーとしてカラムに装填され、固定相に溶媒を流すことによって充填されます。適切に充填されている場合、固定相は上から下まで均一であり、これらの不規則性によって引き起こされる不均一な流れが化合物の分離を妨げるため、気泡や乾燥パッチは含まれていません。溶媒(または溶離液)は、通常、リザーバーから供給される有機溶媒です。一般に、非極性溶媒は非極性化合物のみを溶出するのに対し、極性溶媒は極性化合物と非極性化合物の両方を溶出します。混合物に極性が大きく異なる化合物が含まれている場合は、極性が徐々に高まる一連の溶媒を使用して、目的のすべての化合物を溶出させることができます。移動相の流量は、通常、カラムの下部にあるストップコックによって制御されます。化合物の拡散を避けるために、流れの一時停止は最小限に抑えられています。カラムから出る移動相は溶出液と呼ばれ、化合物の分離を維持するためにフラクションに収集されます。カラムクロマトグラフィーの原理を理解したところで、有機化合物の混合物を精製する手順を見ていきましょう。

手順を開始するには、本文に記載されているように機器を入手してください。単離する各化合物の丸底フラスコを秤量し、質量を記録します。次に、サンプルを秤量し、必要最小限の溶媒に溶解します。適切な溶媒は、薄層クロマトグラフィーを使用して事前に決定する必要があります。Rf値は0.2〜0.3である必要があります。次に、サンプルの乾燥重量と、TLCの事前スクリーニングに基づく目的の化合物の移動距離の差に基づいて、固定相に必要なシリカゲルの量を決定します。適量のシリカゲルを三角フラスコに注ぎます。スラスコが渦巻くとスラリーが半透明になり、自由に動くまで、溶媒をシリカゲルに加えます。次に、シリカゲルが半分まで充填されるほど十分な大きさのカラムを選択します。カラムにグラスフリットがない場合は、グラスウールをカラムに入れ、長いロッドで底にしっかりと押し付けます。シリカがグラスウールを通過するのを防ぐために、グラスウールを約2cmの砂で覆います。ヒュームフードでカラムをリングスタンドに固定し、試験管を収容するのに十分なスペースを確保します。

漏斗をカラムに配置し、ストップコックが閉じていることを確認します。スラリーをカラムに注ぎ、スラリーが沈殿するにつれて側面を軽くたたいて気泡を排除します。漏斗、フラスコ、およびカラムの壁を溶媒ですすぎ、すべてのゲルをカラムに移します。

三角フラスコをカラムの下に置きます。活栓を開き、溶媒レベルがシリカゲルのすぐ上になるまで溶媒をフラスコに排出してから、活栓を閉じます。ゲルに約2cmの砂を注ぎます。カラムの側面に付着した砂を溶媒でやさしく洗い流します。必要に応じて溶剤を排出して、砂がほとんど乾燥しますが、シリカは完全に覆われたままです。

分離を開始するには、砂を乱さずにサンプルをカラムに加えます。少量の溶媒を使用して、カラム壁に付着したサンプルを洗い流し、サンプル容器を洗い流します。レベルがシリカのすぐ上になるまで、溶媒を慎重に排出します。次に、ピペットで、砂層を乱さずに4〜5mLの溶媒を穏やかに加えます。漏斗をカラムに入れ、溶媒をゆっくりと充填します。フラスコを取り外し、ラベル付きの試験管と交換します。最初の試験管を所定の位置に設置した状態で、ストップコックを開き、試験管がほぼいっぱいになるまで溶出液を収集します。

目的の化合物がすべて溶出されるまでフラクションの収集を続け、標識された試験管を順次進行します。終了したら、活栓を閉じます。

単離した各化合物について、純粋な画分を事前に秤量した丸底フラスコに混ぜ合わせます。ロータリーエバポレーターでフラスコから溶媒を取り出し、乾燥化合物を含む丸底フラスコを計量します。詳細については、ロータリーエバポレーションに関するこのコレクションのビデオをご覧ください。

このサンプルには、テトラフェニルポルフィリン(TPP)とフルオレノンの混合物が含まれていました。濃い赤紫色のTPPが最初に溶出し、次に黄色のフルオレノンが溶出されました。各単離された化合物の純度は、NMR分光法によって確認されました。

カラムクロマトグラフィーは、さまざまな科学分野での精製や分析に使用されています。

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、化合物間の優れた分離を提供し、放射性標識分子の放射線検出器などの特殊な検出器を組み込むことができるカラムクロマトグラフィーの一種です。HPLCを使用すると、放射性標識リン脂質は、混合物のごく一部であっても、他の多くの混合物から容易に単離できます。この情報は、多くの重要な生体分子の産生、制御、および機能を解明するのに役立ちます。

フラッシュクロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーの一種で、移動相は重力流のみではなく、空気またはガスの圧力下でカラム内を移動します。

これにより、流速が速くなり、拡散が最小限に抑えられ、分離が向上します。目的の化合物は、薄層クロマトグラフィーで示されるように、いくつかの純粋で濃縮された画分に収集されるため、精製後の収率と純度が優れています。

通常のカラム装置は少量の分離には適していませんが、一部の混合物はHPLCなどの特殊な技術に適合しません。小規模精製はガラス製ピペットカラムで行い、ピペットバルブは小規模フラッシュクロマトグラフィーで行います。これは、特殊な精製技術のためにサンプルを調製する場合や、大規模精製後の最終ステップとして特に役立ちます。

JoVEのカラムクロマトグラフィーの紹介をご覧になりました。これで、カラムクロマトグラフィーの原理、シリカゲルカラムクロマトグラフィーの手順、およびこの手法のいくつかのアプリケーションについて理解しているはずです。

ご覧いただきありがとうございます!