3.11: キャピラリー電気泳動 (CE)

1. CE の計測セットアップ

1. CE 楽器とコンピューターを入れます。コンピューターのソフトウェアを使用して、ウォーム アップを許可する UV 分析用光源をオンします。いくつかのソフトウェアは、インジケーター ランプ使用の準備ができて (ランプ アイコン色に変わります)。
2. 方法ファイルを作る。CE を実行するための重要なパラメーターを設定します。この分析でカートリッジとサンプルの保管温度は 35 ° c. です。UV 検出のための波長は 214 nm。
3. 時間プログラムを書きます。プログラムは一般的に、(解析の前にキャピラリーをきれい) にリンス手順、注入の手順、および、電気泳動のステップで構成されます。リンス ステップ 20 psi の圧力を使用して 1 分の 2 洗口液を実行します。最初のリンスは、水酸化ナトリウムは、毛細血管壁にシラノール基が脱プロトン化したかどうかを確認できます。2 回目のすすぎは、実行バッファー (0.025 M ホウ酸バッファーここ) と毛細血管を確認するは左が平衡バッファーです。
4. 注入圧注入 0.5 psi で使用は 5 s。
5. 電気泳動のステップのための条件、分離電圧: 20 kV、時間: 5 分、通常の極性。各ステップの入口であり、どのバイアルはコンセントがバイアルをまた示します。すべてのパラメーターを入力した後方法ファイルを保存します。

2. 標準およびソーダ サンプルの準備

1. アスパルテーム、カフェイン、安息香酸の 500 ppm 原液を水にします。容積測定フラスコを使用して、それぞれの 50 mL を作る。
2. 150 ppm アスパルテーム、カフェイン、150 ppm、100 ppm 安息香酸標準液を 10 mL のメスフラスコに作る。
3. 10 mL のメスフラスコで 50 ppm、100 ppm、150 ppm と 200 ppm の標準カフェイン溶液を作る。

3. CE のサンプルを実行します。

1. 試料バイアル ホルダーに標準またはソーダのサンプルのいずれかを含むバイアルを配置します。どのサンプルがどのスロットにダウンを記述することを確認します。2 つのスロットがあるホウ酸バッファーと 0.1 M 水酸化ナトリウム洗浄液を実行します。
2. 方法ファイルの最初のサンプルのバイアルは、スロットを入力します。
3. 取得単一の実行、プログラムすべての情報を入力するように要求します。
4. 各サンプルの入力のバイアルを変更するデータの獲得を続行します。標準の組み合わせ、カフェイン 3 濃度とペプシを実行し、ダイエット ペプシ サンプル。
5. 楽器にターゲットを挿入し、適切な計測器を選択します。
6. コンピューター上のデータを分析します。ピーク面積とオーバーレイ標準およびピークを識別するのに役立つ実際のサンプルを計算します。カフェイン データの検量線を作る。

キャピラリー電気泳動(CE)は、電場中の分子をサイズと電荷に応じて分離する化学分析で使用される技術です。

キャピラリー電気泳動は、キャピラリーと呼ばれる直径以下のサブミリメートルのチューブ内で行われ、そこには流れる電解質溶液が含まれています。サンプルをキャピラリーに注入し、電界を印加します。次に、分子は、電荷、サイズ、および溶媒の粘度に影響される速度の差に基づいて分離されます。CEは荷電分子の分離に理想的であり、高速液体クロマトグラフィーよりも分解能が高いため、より効率的で感度が高くなります。

このビデオでは、キャピラリー電気泳動の基本を紹介し、清涼飲料の組成を決定することにより、その使用法を示します。

CEでは、電解質で満たされたキャピラリーに電界が印加されます。電界は、毛細管入口で正電荷を誘導し、出口で負電荷を誘導します。

電解質は、電界によって誘導されて毛細血管内を流れます。電気浸透流と呼ばれるこの流れは、負に帯電した毛細管壁に沿って正に帯電した塩イオンの離散層が移動することによって引き起こされます。

電流がキャピラリーを流れると、壁に沿った陽イオンは負の端に向かって移動します。このイオンの流れにより、中央の溶液がチューブを通して引き込まれます。

次に、サンプル分子は、キャピラリー内の速度に基づいて分離されます。電気泳動移動度と呼ばれるこの速度は、分子の電荷とサイズ、および電場によってどれだけ引き付けられるか反発されるかによって異なります。

正に帯電した分子は、出口の電位により引き付けられるため、毛細管内をより速く流れます。負に帯電した分子は、入口の電位により引き付けられるため、流れがはるかに遅くなります。中性分子はバルクフローとともに運ばれます。したがって、毛細血管から出る分子の順序は、正に帯電し、中性に帯電し、次に負に帯電します。さらに、電解質の流れは、摩擦力により、大きな分子よりも小さな分子をより速く引っ張ります。

分子は、カラムを出るときにUV-Visなどの検出器によって記録され、エレクトロフェログラムと呼ばれる検出器の信号強度と時間のプロットで視覚化されます。

エレクトロフェログラムは、さまざまな情報を得ることができます。サンプルにいくつの異なる化合物が存在するか、各物質の量など。

キャピラリー電気泳動の簡単な概要を見てきたところで、研究室でどのように行われるかを見てみましょう。

まず、キャピラリー電気泳動装置とコンピュータの電源を入れます。次に、UV検出器のスイッチを入れてウォームアップします。

実験を実行するためのパラメーターを設定します。まず、カートリッジとサンプル保管の温度を35°Cに設定します。CとUV検出の波長は214nmまで。

次に、2つのすすぎステップを設定します。最初のすすぎは、毛細血管壁のシラノール基がプロトン化されることを確認するために、水酸化ナトリウムで行われます。2回目のすすぎでは、ランニングバッファーを使用してキャピラリーを平衡化します。次に、サンプルを 0.5 psi で 5 秒間注入するように設定します。

分離電圧を選択して、電気泳動ステップを設定します。この場合、電界が入口で正、出口で負であることを意味する、通常の極性を使用して20kVを5分間使用します。

まず、ソーダ成分のアスパルテーム、カフェイン、安息香酸の50mLのストック溶液を500ppmの水で調製します。

原液から、アスパルテーム150ppm、カフェイン150ppm、安息香酸100ppmの標準液を作ります。

次に、50ppm、100ppm、150ppm、200ppmのカフェインの4つの標準溶液を作ります。これらのサンプルは、検量線を作成するために使用されます。詳細については、このコレクションのキャリブレーション曲線に関するビデオをご覧ください。

最後に、ソーダサンプルを窒素で脱気して調製します。ソーダサンプルは希釈せずに分析されます。

標準サンプルまたはソーダサンプルが入ったバイアルをバイアルホルダーに入れます。ランバッファーと水酸化ナトリウムリンス液が入ったバイアルもサンプルホルダーに入れます。それぞれの場所を必ず記録してください。

CE機器ソフトウェアで、2つのリンス溶液と最初のサンプルバイアルが入っているスロットを示します。次に、最初のサンプルを実行します。

次に、インプットバイアルを変更して、組み合わせ標準、4濃度のカフェイン、およびレギュラーソーダとダイエットソーダのサンプルを実行します。

すべてのソリューションが分離されたら、データを分析します。

まず、標準試料を使用して、ソーダサンプルのピークを特定します。ダイエットソーダサンプルで観察された 3 つのピークを標準試料と比較すると、カフェイン、アスパルテーム、安息香酸がダイエットソーダに含まれていることがわかります。通常のソーダサンプルには、カフェインのピークのみが存在し、アスパルテームと安息香酸のピークは存在しません。

次に、各カフェイン標準溶液のピーク面積を計算し、検量線を作成します。カフェインの検量線は、各サンプル中のカフェイン濃度を計算するために使用できます。

キャピラリー電気泳動は、学術および産業環境における多くの特殊分離に使用されています。

CEは、製薬業界の品質管理試験の1つのコンポーネントとしてよく使用されます。低分子または生物製剤としての薬物は、キャピラリー電気泳動にかけ、副産物が存在するかどうかを確認できます。また、フォールディングはタンパク質の電荷に影響を与える可能性があるため、タンパク質が適切にフォールディングされているかどうかを判断するためにも使用できます。

CEはDNAの分離にも使用できます。マイクロウェルプレートと複数のキャピラリーアレイを使用することで、研究者はここに示すように、1つの実験のスループットを向上させることができます。DNA断片はサイズに基づいて分離され、分解能は1塩基対まで下げられました。これにより、DNAの断片のシーケンシングが可能になり、潜在的な遺伝性疾患の診断に使用されるコピー数バリアントなどの他のパラメーターを決定することができます。

タンパク質は、さまざまな場所に化学的に結合したさまざまな官能基によって修飾できます。同じタンパク質の異なるコピーは、異なる修飾によって異なる可能性があり、これにより各タンパク質の電荷とサイズが変化します。精製したタンパク質を質量分析計に付着したCEに通すことで、どの修飾が存在するかに基づいてタンパク質を分離し、修飾の種類と位置を特定することができます。

JoVEのキャピラリー電気泳動の紹介をご覧になりました。これで、CEが電荷と質量に基づいて分子を分離する方法と、ラボでCEにサンプルを実行する方法を理解できたと思います。

ご覧いただきありがとうございます!