イオン交換クロマトグラフィー

1. サンプルと列を準備します。

1. このデモで 2 つのタンパク質の混合物を陽イオン交換カラムで分離されます: ヘモグロビンやチトクロム c. 追加 0.2 mL 平衡バッファー (pH 8.1) 蛋白質のサンプルし、徹底的にミックスする渦。任意の泡を削除に 2 分間遠心します。
2. レジンの解決を許可するように 5 分間テスト チューブに陽イオン交換カラムを配置します。それは直立させるリング スタンドに列を持つテスト チューブをクランプします。
3. 列のトップ キャップ、ボトム キャップを開きます。試験管に重力を点滴する列のバッファーを許可します。
4. 洗って二度と列列のボリューム (この場合は列ボリュームは 0.3 mL) 平衡バッファーの。廃棄物のバイアルにうち平衡バッファー点滴の 2 番目の列ボリュームを追加する前に最初の列ボリューム (0.3 mL) をみましょう。この手順では、平衡の平衡バッファーで列をことができます。樹脂を邪魔しないようにこの手順でゆっくりと平衡バッファーを追加します。

2. 陽イオン交換カラムによる蛋白質のサンプルの実行

1. 「非連結 1] というラベルの付いた 2 mL 遠心管中列を置きます。列の一番上に蛋白質のサンプルの 0.1 mL を慎重にロードします。
2. サンプルは、列の上部に搭載されている、一度、0.3 ml の平衡バッファーの列の上部にバッファーを追加し、すべての方法を介して滴下することができます洗います。(5 洗浄の合計) の 4 倍を繰り返し、独立した 2 mL の遠心管で各洗浄を収集します。「1-5 非連結」としてチューブ ラベルを付けます。
3. 10 遠心分離機の最後 2 の洗浄のため列をすべての非連結の種を確実にする 1,000 x g で s。列にバインドされるサンプルはこれらの洗浄は、いけませんが、バインドされないサンプルは unretained を洗浄します。遠心分離列からバインドされていない材料を洗浄するより多くの力を提供します。
4. 「バインド 1」というラベルの付いた新しい 2 mL 遠心コレクション管中列を置きます。上列 0.3 mL の溶出バッファー (高い塩、pH 5.5) を置きます。10 結果の溶離液を遠心分離機 1,000 x g で s。
5. 回 0.3 mL を追加する新しい遠心管に列を配置することによって溶出のステップ 2 を繰り返し、これら 10 s. ラベルの遠心分離」は、2 と 3 をバインドされて」。
6. 色の変更や、分数についての観察を記録します。ヘモグロビン、シトクロム C は赤味がかった色、赤茶色に見える色蛋白質であります。

ヘモグロビンやチトクロム C の結果: 陽イオン交換

1. シトクローム C は 10.5 とヘモグロビン 6.8 の pI pI です。したがって、pH 8.1 平衡バッファーを使用すると、ヘモグロビンが列にバインドできません、それが負荷電であるので。チトクローム C この ph 条件で積極的に充電、ために、列にバインドは、pH < pI。
2. ヘモグロビンは、列にバインドされていないために、非連結の分数で観察されます。
3. シトクローム C は、陽イオン交換カラムにバインドされたため、バインドされた分数で観察されます。

図 1。非連結の分数 (ヘモグロビン) とバインドされている割合 (シトクロム C) の画像。