Name: gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 学ぶgentleMACS Dissociatorを用いたマウス脾臓の自動組織解離法。専用チューブとフィルター処理で高生存率の単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーによる解析に適したサンプルを得る効率的な技術です。

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機器の紹介<ol><li>組織は、実行可能な単細胞懸濁液に紫のC管を使用して、穏やかに解離している。 </li><li> PBS / BSA EDTAバッファーは細胞を解離するために使用されます。バッファーは、EDTAを含む溶液をすすぎautoMACSの20部にBSAのストック溶液の1部を添加して調製される。 </li><li> MACSプレセパレーションフィルターは、解離組織サンプルが正常に行わMACS分離とその後の分析を促進する、すべての細胞塊がないかようにするために使用されます。 </li></ol>脾臓細胞を解離<ol><li>全体脾臓をgentleMACSのDissociatorを使用して脾細胞の単細胞懸濁液にdisscociatedされています。 </li><li>手順を開始するには、脾臓の質量に応じてバッファーの量とCチューブをロードする。若年成人女性のBALB / cマウスの健康な脾臓は80から120まで約10mgの重量を量る。この質量の1〜2脾臓は、緩衝液3mlを必要とする。感染症のある高齢の動物または動物から脾臓はしばしば大きく、バッファに検討する必要があります。バッファのボリュームは、それに応じてスケーリングする必要があります。を10mLの総バッファ量を超えないようにしてください。 </li><li>緩衝液3mlを含むCチューブに切除した脾臓を追加。 </li><li> Cチューブのキャップがタイトであることを確認して、上下のキャップでdissociatorにCチューブを取り付けます。 </li><li> dissociatorの電源を入れます。 1から2脾臓の場合は、プログラムのm_spleen_01を選択します。プログラムが完了するまで56秒かかります。脾臓の数が大きい場合は、プログラムm_spleen_04を使用して、このプログラムは、脾臓の組織の最大720 mgのために使用することができます。 </li><li>プログラムの終了後、ネイティブの脾臓の組織では、脾臓細胞懸濁液中に解離している。 </li><li>約30秒間室温で300xgで全細胞懸濁液をスピンダウン。これは、回転子と固定子は、C管の下部に収集されるすべてのセルから解放されることを保証します。 </li><li> 1000年マイクロリットルピペッターを使用してC管のキャップにセプタムシール開口部を通してサンプルを削除します。 </li></ol>濾過のステップ<ol><li>濾過工程を開始するには、プレセパレーションフィルターまたは30μmの孔径を持つセルストレーナーに解離組織を適用する。ストレーナーは1-2脾臓または2つ以上の脾臓では50 mLのチューブに15 mLのチューブを適合する必要があります。 </li><li>細胞懸濁液が通過してみましょう。その後、緩衝液5 mLを適用することにより、フィルターを洗う。 </li><li>今、脾臓細胞ペレットにすべての脾細胞を収集するために室温で10分間、300xgで細胞懸濁液でチューブを遠心する。 </li><li>今、我々は解離脾細胞のペレットを持っていることを、我々は、上清を吸引除去し、バッファの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します必要があります。 </li></ol> gentleMACSのDissociatorを使用して、脾臓の解離は、MACSQuant Analyzerを使用してフローサイトメトリーによって実証されている実行可能な脾細胞の割合が高いが、得られます。死んだ細胞はヨウ化プロピジウムで染色されています。提供される例では、前方側方散乱ドットプロットでは、調製した脾細胞を示しています。

すべてのプロトコルとデータシートがご利用いただけます<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; http://www.miltenyibiotec.com。</a&gt;。

退屈でしばしば痛みを伴うマニュアルの解離を避けるために、gentleMACSのDissociatorは1つが制御され、再現可能な条件の下で非常に効率的に組織を解離することができます。組織解離の手順は、高い生存率と細胞と収量の細胞懸濁液に優しいです。 Cチューブとの組み合わせでgentleMACSのDissociatorは、様々な組織からの単細胞懸濁液の調製のために設計されています。楽器は、マウスの脾臓、肝臓、肺、または神経組織を解離するためにあらかじめ設定されたプログラムの数が装備されています。プログラムとプロトコルの範囲は連続して追加の組織を含むように拡張されます。

<table><tbody><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; スターターキット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>13 mLチューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; 洗浄液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; BSAストック溶液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>分離前フィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>プロピジウムイオジド溶液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

gentlemacs dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

単細胞懸濁液は、細胞分離、細胞解析と細胞培養の実験のための前提条件です。退屈でしばしば痛みを伴うマニュアルの解離を避けるためにgentleMACSのDissociatorは1つが制御され、再現可能な条件の下で非常に効率的に組織を解離することができます。 gentleMACSのDissociatorは、最適に、ユーザーの安全と時間節約と標準化を組み合わせ、マウスの脾臓を切り離すことができます。このビデオでは、gentleMACS Dissociator、機械的に生存細胞懸濁液を生成するために特殊なチューブを使用して組織を混乱させることができる自動化された卓上型の装置を使用してマウスの脾臓を解離させる方法について説明します。解離に続いて、脾臓を、ろ過、遠心分離し、さらにアプリケーション用に再懸濁する。

このビデオでは、マウス脾細胞の単細胞懸濁液を準備するためにgentleMACSのDissociatorを使用して自動化された組織の解離のためのシンプルな、時間の節約テクニックを説明します。

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

単一細胞懸濁液（シングルセルサスペンション）は、細胞分離、細胞解析、および細胞培養の実験において必須となります。煩雑で、しばしば苦痛を伴う手作業を避けるために……

このビデオプロトコルでは、専用チューブを用いて組織を機械的に破砕し、生存率の高い細胞懸濁液を調製できる自動ベンチトップ装置「Gentle Max」を使用したマウス脾臓の解離方法を紹介します。解離後、脾臓はMax Presセパレーションフィルターでろ過され、遠心分離を経て、その後のアプリケーションのために懸濁されます。こんにちは、メラニー・ムルーです。私はドイツのBE Lab ParkにあるMilton Biotechの研究員です。本日は、このGenX dissociationを用いて、マウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製する方法をご紹介します。GenX dissociationを使用することで、単一細胞懸濁液を非常に簡単かつ迅速に調製することが可能です。それでは始めていきましょう。煩雑で、しばしば困難を伴う手動での解離を避けるため、gentle max di associatorを用いることで、制御可能かつ再現性のある条件下で組織を非常に効率的に解離させることができます。組織はviolet Cチューブを用いて緩やかに解離され、生存可能な単一細胞懸濁液になります。Cチューブはキャップの中央にセプタムで密閉された開口部を備えており、無菌状態を維持したままチューブ内へのピペッティングが可能です。解離させた細胞を懸濁させるには、適切なPBS-BSA-EDTAバッファーを使用する必要があります。このバッファーは、BSAストック溶液1部に対して、EDTA含有AutoMaxフェンシング溶液20部を加えて調製します。Max Pres分離フィルターを使用することで、解離させた組織サンプルからすべての細胞塊を除去し、最大限の分離とそれに続く解析を促進します。手順を開始するために、Cチューブに一定量のバッファーを充填します。脾臓の質量について、6〜7週齢の雌のバイオプシーマウスの正常な脾臓の重量は約80〜120 mgです。この質量の脾臓1〜2個につき、3 mLの緩衝液が必要です。合計容量が10 mLを超えないようにしてください。ここで、解剖した脾臓を3 mLの緩衝液が入ったCチューブに加えます。高齢の動物や感染した動物の脾臓は大きくなることが多く、緩衝液中で重量を測定する必要があります。次に、バッファー量を適宜調整しますが、合計容量が10 millilitersを超えないようにしてください。Cチューブのキャップがしっかりと締まっていることを確認し、Cチューブを解離装置に取り付けます。キャップを下に向けた状態で、1〜2個の脾臓を解離させるために、Program M spleen oh oneを選択して装置を起動します。プログラムの完了まで56 secondsかかります。脾臓の数が多い場合は、program M spleen oh fourを使用してください。このプログラムは、最大720 mgの脾臓組織に使用できます。プログラム終了後、元の脾臓組織はPLE細胞懸濁液に解離します。このように、短時間遠心分離してサンプルをチューブの底に集めてください。これにより、ローターとステーターからすべての細胞が取り除かれ、Cチューブの底に回収されます。1,000 µLピペッターを用いて、Cチューブキャップのセプタム封止開口部からサンプルを取り出します。ろ過ステップを開始するために、解離した組織を分離前ろ過フィルターまたは孔径30 µmのストレイナーに適用します。ストレイナーは、脾臓1〜2個の場合は15 mLチューブに、2個を超える場合は50 mLチューブに適合するものを使用してください。細胞懸濁液を通過させ、次に5 mLのバッファーを加えてフィルターを洗浄します。次に、細胞懸濁液の入ったチューブを室温で300 Gs、10分間遠心分離し、すべての細胞を脾細胞ペレットとして回収します。解離した細胞のペレットが得られたので、上清を吸引し、適切な量の脾臓解離用バッファーで細胞ペレットを再懸濁させます。gentle maxを使用することで、高割合の生存可能なPLE細胞を得ることができます。これはmax quantを用いたフローサイトメトリーによって実証されています。死細胞はプロピジウムヨードで染色されており、例が示されています。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のドットプロットは、調製されたSP細胞を示しています。このGentleX解離を用いて脾臓組織を解離する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルの大きさに合わせて緩衝液の量を調整し、適切なGentleXプログラムを選択することが重要です。以上で終了です。実験の成功をお祈りします。

preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-spleen-with-gentlemacs

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JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、抗原特異的ラットTリンパ球のラインのin...

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マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

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マウス脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製

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マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。...

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo...

マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

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マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

学ぶgentleMACS Dissociatorを用いたマウス脾臓の自動組織解離法。専用チューブとフィルター処理で高生存率の単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーによる解析に適したサンプルを得る効率的な技術です。

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

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