gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

このビデオプロトコルでは、専用チューブを用いて組織を機械的に破砕し、生存率の高い細胞懸濁液を調製できる自動ベンチトップ装置「Gentle Max」を使用したマウス脾臓の解離方法を紹介します。解離後、脾臓はMax Presセパレーションフィルターでろ過され、遠心分離を経て、その後のアプリケーションのために懸濁されます。こんにちは、メラニー・ムルーです。

私はドイツのBE Lab ParkにあるMilton Biotechの研究員です。本日は、このGenX dissociationを用いて、マウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製する方法をご紹介します。GenX dissociationを使用することで、単一細胞懸濁液を非常に簡単かつ迅速に調製することが可能です。

それでは始めていきましょう。煩雑で、しばしば困難を伴う手動での解離を避けるため、gentle max di associatorを用いることで、制御可能かつ再現性のある条件下で組織を非常に効率的に解離させることができます。組織はviolet Cチューブを用いて緩やかに解離され、生存可能な単一細胞懸濁液になります。

Cチューブはキャップの中央にセプタムで密閉された開口部を備えており、無菌状態を維持したままチューブ内へのピペッティングが可能です。解離させた細胞を懸濁させるには、適切なPBS-BSA-EDTAバッファーを使用する必要があります。このバッファーは、BSAストック溶液1部に対して、EDTA含有AutoMaxフェンシング溶液20部を加えて調製します。

Max Pres分離フィルターを使用することで、解離させた組織サンプルからすべての細胞塊を除去し、最大限の分離とそれに続く解析を促進します。手順を開始するために、Cチューブに一定量のバッファーを充填します。脾臓の質量について、6〜7週齢の雌のバイオプシーマウスの正常な脾臓の重量は約80〜120 mgです。

この質量の脾臓1〜2個につき、3 mLの緩衝液が必要です。合計容量が10 mLを超えないようにしてください。ここで、解剖した脾臓を3 mLの緩衝液が入ったCチューブに加えます。高齢の動物や感染した動物の脾臓は大きくなることが多く、緩衝液中で重量を測定する必要があります。

次に、バッファー量を適宜調整しますが、合計容量が10 millilitersを超えないようにしてください。Cチューブのキャップがしっかりと締まっていることを確認し、Cチューブを解離装置に取り付けます。キャップを下に向けた状態で、1〜2個の脾臓を解離させるために、Program M spleen oh oneを選択して装置を起動します。プログラムの完了まで56 secondsかかります。脾臓の数が多い場合は、program M spleen oh fourを使用してください。

このプログラムは、最大720 mgの脾臓組織に使用できます。プログラム終了後、元の脾臓組織はPLE細胞懸濁液に解離します。このように、短時間遠心分離してサンプルをチューブの底に集めてください。これにより、ローターとステーターからすべての細胞が取り除かれ、Cチューブの底に回収されます。

1,000 µLピペッターを用いて、Cチューブキャップのセプタム封止開口部からサンプルを取り出します。ろ過ステップを開始するために、解離した組織を分離前ろ過フィルターまたは孔径30 µmのストレイナーに適用します。ストレイナーは、脾臓1〜2個の場合は15 mLチューブに、2個を超える場合は50 mLチューブに適合するものを使用してください。

細胞懸濁液を通過させ、次に5 mLのバッファーを加えてフィルターを洗浄します。次に、細胞懸濁液の入ったチューブを室温で300 Gs、10分間遠心分離し、すべての細胞を脾細胞ペレットとして回収します。解離した細胞のペレットが得られたので、上清を吸引し、適切な量の脾臓解離用バッファーで細胞ペレットを再懸濁させます。

gentle maxを使用することで、高割合の生存可能なPLE細胞を得ることができます。これはmax quantを用いたフローサイトメトリーによって実証されています。死細胞はプロピジウムヨードで染色されており、例が示されています。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のドットプロットは、調製されたSP細胞を示しています。

このGentleX解離を用いて脾臓組織を解離する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルの大きさに合わせて緩衝液の量を調整し、適切なGentleXプログラムを選択することが重要です。以上で終了です。

実験の成功をお祈りします。