二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

こんにちは。ニューヨーク市のウェイルコーネル医科大学、生理学・生物物理学部のOla Anderson博士です。私はOlsonです。Olive Anderson博士の研究室で計算生物医学を専攻している学生です。

私はアンダーソン研究室のリサーチテクニシャン、シェイル・コリウッドです。本日は、バイオレイヤー（生体膜）の形成方法、バイオレイヤー・パンチ電極を用いた小規模な膜の分離方法、単一チャネル活性の記録方法、およびその結果の解析方法について解説し、それによってグラミンチャネルを脂質バイオレイヤー特性のプローブとして利用する方法をご紹介します。前回のビデオでは、これらの実験に向けた準備手順について解説しました。

使用したチャンバーの準備方法と、チャネル活性を記録するために膜の小さな層を単離させるバイレイヤー・パンチ電極の準備方法について説明しました。それでは、バイレイヤーのパンチを作成しましょう。バイレイヤー実験のセットアップを開始するために、温度平衡化した電解質溶液 2.5 mLを、あらかじめ塗装したチャンバーの各コンパートメントに加えます。通常使用する溶液は、1 M NaClに10 mMを添加したものです。

pH 7に緩衝し、テフロンの穴が視野の中心に位置し、明るく照らされるように顕微鏡と光源を調整します。ガラスマイクロピペットをマイクロ電極ホルダーに挿入します。タイゴンチューブを用いて、シリンジをホルダーに接続します。

吸引により、電極ホルダー内のピペットを満たします。電極ホルダー内のシルバーペレットとピペットチップ間の電気的接続が断たれる可能性があるため、気泡が入らないよう注意してください。ネジに少量の पेट्रोलियमジェリーを塗布し、マイクロ電極ホルダーに装着します。

पेट्रोलियमゼリーを用いて気密シールを作成します。電極ホルダーをファラデーケージ内のパッチクランプヘッドステージに差し込みます。マイクロピペットの先端を、テフロン製パーティションの穴の直後、中心に位置するように配置します。

コイル状に巻いた銀電極をフロントチャンバーに配置します。モデリングクレイで固定し、電圧指令回路に接続します。最後に、電極のバランスを調整します。

前方の電極とマイクロ電極ホルダー内の電極では、半電池電位がわずかに異なる可能性があるため、この操作は極めて重要です。半電池電位とは、銀金属と電極、および塩化銀コーティングに隣接する電解質溶液との間の電位差のことです。パッチクランプにおける2つのコンパートメント間に流れる電流が-200 pAから+200 pAの間で変動するように、マニュアルオフセットを調整して電極のバランスをとってください。

オフセット電位は時間とともに変化するため、脂質二分子膜を形成させる間、実験を通して定期的に電極のバランス調整を行ってください。付属のビデオに示されている通り、火炎研磨したパステールピペットをfch溶液で洗浄します。洗浄したピペットを脂質デッキング溶液に浸し、溶液がピペット内に約1 mm上昇するようにしてください。

ピペットチップをテフロンパーティションの穴の直前に配置し、脂質溶液の気泡を穴にそっと塗布します。成功すると、鮮やかな色の脂質気泡が穴に形成され、トーラス状またはドーナツ状の脂質がテフロンパーティションに付着します。膜を薄くさせますが、これは膜に100〜200 millivoltの電位を印加することで促進できます。

ガラスマイクロピペットチップをTaurusに挿入し、ピペットとバイレイヤーの間でより良好なシールが得られるよう、数分間そのままにしておきます。これで、ガラスマイクロピペットを用いてメンブレンパッチを分離する準備が整いました。次に、グラミンで膜をドープします。

このグラミン溶液は、1 µMのストック溶液を1〜10 nMに希釈して調製しました。通常、DMSO（ジメチルスルホキシド）を用いて、希釈液を1〜10 µLずつメンブレンの両側に加え、最終濃度をpM（ピコモーラー）範囲にします。マグネチックスターラーで溶液を約2分間攪拌し、さらに10分間待機してから、シングルチャネル活性を記録するための新しい小型メンブレンを形成します。

この重量により、グラミンを膜に組み込むことができます。電圧を印加して、チャネル活性を確認してください。一般的に、1秒あたり約1回のチャネルイベントが得られるように調整します。

チャネルは、膜電流の個別の増減として観察されます。これで、実際の実験を開始する準備が整いました。まず、コントロールの電流トレースを記録してください。

先に示した手順で電極のバランスを調整し、付属のビデオに記載されている方法で小さな膜またはパッチを形成します。+200 mVを印加し、シングルチャネル活性を記録します。100から200回のシングルチャネル電流遷移を収集してください。

この手順を-200 mVで繰り返します。ピペットチップから電解質を排出してパッチを切断します。ナイロンスクリューを使用して電極のバランスを再調整し、ピペットをリアチャンバーに後退させ、過剰な脂質を吹き飛ばしてから、新しいパッチを形成します。

また、これらの手順を繰り返すことで、他の電位での記録を行うことも可能です。これで、バイレイヤー修飾剤を用いて実験的な電流トレースを記録する準備が整いました。本例では、膜の両側に抗うつ薬のfluoxetineを添加します。

フルオキセチンのストック溶液は、DMSOを用いて25 millimolarに希釈してください。この溶液を5 µL添加し、チャンバー内での濃度を50 micromolarにします。DMSOは脂質二重層の特性に影響を及ぼす可能性があります。そのため、溶液中のDMSO量を25 µL（1%または150 millimolar）以内に制限することが重要です。

5分間撹拌し、修飾剤が水溶液と膜の間で平衡状態に達するまで10分間待ちます。次に、修飾剤が存在する条件下で、前述の方法に従ってチャネル活性を記録します。これらの手順を繰り返し、修飾剤の濃度を上げてチャネル活性を記録します。

チャネルの寿命と出現率を定量化することで、バイレイヤーの変化について多くの知見を得ることができます。このような解析を行うには、チャネルの形成と消失を検出する必要があります。ここでは、コンピュータが一次導関数を計算して電流の急激な変化を特定し、それをチャネルイベントとしてマークする、遷移ベースのアルゴリズムを使用します。

遷移前後におけるチャネル寿命を決定するため、イベントは時系列データとして保存されます。また、電流レベルも保存され、実験進行中のチャネル振幅の決定に役立てられます。コンピュータは電流遷移振幅のヒストグラムを作成し、これにより電流遷移の取得状況を追跡することが可能になります。

これにより、実験の精度を評価することも可能になります。現在の遷移振幅が大きく分散している場合は、問題があると考えられます。ヒストグラムが鋭いピークを示していれば、良好に進行しています。

200回以上の転移イベントが蓄積されたら、メインピークにおける転移の平均電流値と標準偏差を算出します。チャネルの出現率は、電流転移振幅ヒストグラムにおける転移回数を観察時間で割ることで簡単に推定できます。チャネルは出現時と消失時の2回ヒストグラムにカウントされるため、さらに2で割ることを忘れないでください。

遷移イベントの時系列を解析し、チャネルの生存時間分布を求めます。同時に導電しているチャネルが最大で1つである電流トレースの場合、生存時間の決定は単純です。この場合、コンピュータは各遷移がチャネルの出現か消失かを検出し、消失イベントは直前の出現イベントにのみ対応すると判断されます。

2つの遷移の間の時間がチャネル寿命となります。チャネル遷移の間隔が短すぎて区別できない場合は、出現と消失を手動で割り当てる必要があります。同時に2つ以上のチャネルが導通している場合、どのチャネルの消失がどのチャネルの出現に対応するかが不明になるため、割り当てはより複雑になります。

そのため、チャネル活性を低く抑えることが好ましいです。乱数生成器を使用して、出現を消失に割り当てることで、割り当て問題を解決できます。これにより、最終的に一連のチャネル寿命が得られます。

これを寿命ヒストグラムに変換し、さらに生存曲線へと変換します。非線形最小二乗法を用いて生存曲線に単一指数分布をフィッティングさせることで、平均寿命を決定します。また、巨大膜が破裂しなかった実験についても検討します。バイレイヤー修飾剤を添加することで、チャネルの出現率への影響を比較できます。巨大膜が破裂してしまった場合は、このような比較は妥当ではありません。膜タンパク質の機能は、細胞膜の脂質組成によって制御されています。

この調節は、特定の脂質とタンパク質の相互作用と、脂質二重層と膜タンパク質の間のより一般的な相互作用の組み合わせによるものです。これらの相互作用は、薬理学的研究において特に重要です。現在市場にある多くの医薬品は、脂質二重層の特性を変化させうる両親媒性物質であり、それが結果として膜タンパク質の機能変化につながる可能性があるためです。

Graminチャネルは、両親媒性物質が脂質二重層の特性を変化させるかどうかを報告する分子力トランスデューサーとして利用できます。寿命および出現率の変化を修飾剤の濃度の関数としてプロットすることで、二重層特性の変化についての知見が得られます。

頻度の増加は、グラムサイトの形成や二量体化に合わせて、二層膜がより容易に変形することを意味します。寿命の延長は、チャネル形成に伴う二層膜の変形に要するエネルギーコストが低減したことを意味します。修飾剤は、膜の弾性を高めるか、あるいは曲率に影響を与えることで、頻度と寿命を向上させることがあります。

以上で、クロモチャネルを用いて、低分子化合物が弾性バイレイヤー特性を変化させるかどうかを確認する方法について説明しました。ご視聴ありがとうございました。

実験の成功をお祈りします。